海參組織蛋白質組的提取方法
【專利摘要】本發明所公開的海參組織蛋白質組的提取方法，利用液氮研磨、超聲處理、超高速低溫離心及蛋白質組樣品純化等一系列步驟，能夠從海參組織中獲得種類全面、濃度及純度均較高的蛋白質組，其最終產物尤其適合于進行蛋白質雙向電泳、高效液相層析（HPLC）以及蛋白質組質譜鑒定等蛋白質組學研究，對開展海參蛋白質組學的相關研究具有較為重大的意義；它可以為海參的苗種優選、養殖技術提高以及病害防控提供理論基礎和實踐指導，有助于解決海參種質退化、病害頻發等實際生產問題，有利于提高海參產業的經濟效益和社會效益。
【專利說明】海參組織蛋白質組的提取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種物質的提取方法，特別是一種海參組織蛋白質組的提取方法。
【背景技術】 [0002]隨著對基因組研究的不斷深入，人們逐漸發現，單純從基因組水平并不能完全揭示生命活動的規律，只有深入研究基因組的表達產物，才能更直接地了解生命的本質。蛋白質是基因功能主要的執行者，在生命活動中發揮重要作用，對生物體蛋白質組進行定性、定量、定位及相互作用的研究可為闡明生命活動的本質提供理論依據。而蛋白質組樣品的提取是蛋白組學研究中的關鍵環節，蛋白質組樣品提取的質量好壞將直接影響后續的蛋白組學相關研究與分析。
[0003]海參具有較高的食用藥用價值和經濟價值，是被廣泛認同的具有特殊滋補與營養保健等多重功效的高值海珍品。但是，隨著海參人工養殖規模的不斷擴大，海參種質退化以及養殖病害問題日趨嚴重，制約了海參產業的健康和可持續發展。想要對海參蛋白質組學進行深入的研究，首先需要對海參的蛋白質組進行有效地、高質量的提取，而現在還沒有一種針對海參組織蛋白質組的提取方法。

【發明內容】

[0004]本發明是為了解決現有技術所存在的上述不足，提出一種可獲得較為全面的蛋白質種類，且純度和濃度都較高的海參組織蛋白質組的提取方法。
[0005]本發明的技術解決方案是:一種海參組織蛋白質組的提取方法，其特征在于:所述的方法按照以下步驟進行:
a、取海參組織用4°C、pH=6.8的50mM Tris-HCL清洗3_5次，然后將海參組織粉碎后放入研缽中，一邊研磨一邊向研缽中添加液氮，直至海參組織碎塊呈固態的粉末狀，
b、將海參組織粉末放置到超聲管中，并按照液料比為200μ I:0.1g的比例向超聲管中加入pH=6.8的50mM Tris-HCL的緩沖液，在4°C的條件下進行超聲處理，超聲處理過程中工作時間4s，間歇時間10s，循環30次，然后在8000g、4°C的條件下離心處理20min，取上清液和沉淀物，其中上清液即為海參組織可溶性全蛋白溶液，
C、將b步驟中獲得的沉淀物放入超聲管中，并向超聲管中添加50mM Tris-HCLUmMEGTAUmM PMSF, pH=7.4的緩沖液，在4°C的條件下進行超聲處理，超聲處理過程中工作時間4s，間歇時間10s，循環30次，然后在23000g、4°C的條件下離心處理lh，取上清液，將上清液在150000g、4°C的條件下離心處理lh，棄上清液，向余下的溶液中加入終濃度為2%的Triton X 114，在4°C的條件下攪拌處理lh，再在150000g、4°C的條件下離心處理lh，去除不溶物，在37°C的條件下水浴20min，之后在1000g、4°C的條件下離心處理20min，取下層溶液，該下層溶液即為海參組織細胞膜蛋白的提取液，
d、將b步驟中獲得的海參組織可溶性全蛋白溶液和c步驟中獲得的海參組織細胞膜蛋白的提取液合并后，與_20°C的丙酮按照1:5的比例混合，在_20°C的條件下靜置12-20h，然后將混合溶液在SOOOg的條件下離心處理30min，去除上清液，將沉淀取出在4°C的環境下干燥，干燥后的產物即為含有海參組織可溶性全蛋白和海參組織細胞膜蛋白的海參組織蛋白質組。
[0006]本發明同現有技術相比，具有如下優點:
本發明所公開的海參組織蛋白質組的提取方法，利用液氮研磨、超聲處理、超高速低溫離心及蛋白質組樣品純化等一系列步驟，能夠從海參組織中獲得種類全面、濃度及純度均較高的蛋白質組，其最終產物尤其適合于進行蛋白質雙向電泳、高效液相層析(HPLC)以及蛋白質組質譜鑒定等蛋白質組學研究，對開展海參蛋白質組學的相關研究具有較為重大的意義；它可以為海參的苗種優選、養殖技術提聞以及病害防控提供理論基礎和實踐指導，有助于解決海參種質退化、病害頻發等實際生產問題，有利于提高海參產業的經濟效益和社會效益。【具體實施方式】
[0007]—種海參組織蛋白質組的提取方法，按照以下步驟進行:
a、首先取適量的海參組織，用4°C、pH=6.8的50mM Tris-HCL清洗3_5次，然后將海參組織用消毒的干凈剪刀剪碎，放入研缽中，一邊研磨一邊向研缽中添加液氮，直至海參組織碎塊呈固態的粉末狀；在液氮速凍的條件下進行研磨能有效防止研磨過程中蛋白質的降解，以確保組織蛋白的活性與結構完整性。
[0008]b、然后將海參組織粉末放置到超聲管中，并按照液料比為200 μ I:0.1g的比例向超聲管中加入pH=6.8的50mM Tris-HCL的緩沖液，在4°C的條件下進行超聲處理，超聲處理過程中工作時間4s，間歇時間10s，循環30次，然后在8000g、4°C的條件下離心處理20min，取上清液和沉淀物，其中上清液即為海參組織可溶性全蛋白溶液；該步驟能夠有效避免核酸污染以及外源離子引入，以確保蛋白質樣品的純度。
[0009]C、將b步驟中獲得的沉淀物放入超聲管中，并向超聲管中添加50mM Tris-HCLUmMEGTAUmM PMSF, pH=7.4的緩沖液，在4°C的條件下進行超聲處理，超聲處理過程中工作時間4s，間歇時間10s，循環30次，然后在23000g、4°C的條件下離心處理lh，取上清液，將上清液在150000g、4°C的條件下離心處理lh，棄上清液，向余下的溶液中加入終濃度為2%的Triton X 114，在4°C的條件下攪拌處理lh，再在150000g、4°C的條件下離心處理lh，去除不溶物，在37°C的條件下水浴20min，之后在1000g、4°C的條件下離心處理20min，取下層溶液，該下層溶液即為海參組織細胞膜蛋白的提取液；該步驟同樣能夠有效避免核酸污染以及外源離子引入，以確保蛋白質樣品的純度。
[0010]d、將b步驟中獲得的海參組織可溶性全蛋白溶液和c步驟中獲得的海參組織細胞膜蛋白的提取液合并后，與-20°C的丙酮按照1:5的比例混合，在-20°C的條件下靜置12-20h，然后將混合溶液在8000g的條件下離心處理30min，去除上清液，將沉淀取出在4°C的環境下干燥，干燥后的產物即為含有海參組織可溶性全蛋白和海參組織細胞膜蛋白的海參組織蛋白質組；在這一步驟中，采用丙酮作為除鹽溶劑，能夠有效去除海參組織蛋白質組提取液中的各種鹽離子，進一步確保了所得蛋白質組的純度及濃度。
【權利要求】
1.一種海參組織蛋白質組的提取方法，其特征在于:所述的方法按照以下步驟進行: a.取海參組織用4°C、pH=6.8的50mM Tris-HCL清洗3_5次，然后將海參組織粉碎后放入研缽中，一邊研磨一邊向研缽中添加液氮，直至海參組織碎塊呈固態的粉末狀， b.將海參組織粉末放置到超聲管中，并按照液料比為200μ I:0.1g的比例向超聲管中加入pH=6.8的50mM Tris-HCL的緩沖液，在4°C的條件下進行超聲處理，超聲處理過程中工作時間4s，間歇時間10s，循環30次，然后在8000g、4°C的條件下離心處理20min，取上清液和沉淀物，其中上清液即為海參組織可溶性全蛋白溶液， c.將b步驟中獲得的沉淀物放入超聲管中，并向超聲管中添加50mMTris-HCLUmMEGTAUmM PMSF, pH=7.4的緩沖液，在4°C的條件下進行超聲處理，超聲處理過程中工作時間4s，間歇時間10s，循環30次，然后在23000g、4°C的條件下離心處理lh，取上清液，將上清液在150000g、4°C的條件下 離心處理lh，棄上清液，向余下的溶液中加入終濃度為2%的Triton X 114，在4°C的條件下攪拌處理lh，再在150000g、4°C的條件下離心處理lh，去除不溶物，在37°C的條件下水浴20min，之后在1000g、4°C的條件下離心處理20min，取下層溶液，該下層溶液即為海參組織細胞膜蛋白的提取液， d.將b步驟中獲得的海參組織可溶性全蛋白溶液和c步驟中獲得的海參組織細胞膜蛋白的提取液合并后，與_20°C的丙酮按照1:5的比例混合，在_20°C的條件下靜置12-20h，然后將混合溶液在SOOOg的條件下離心處理30min，去除上清液，將沉淀取出在4°C的環境下干燥，干燥后的產物即為含有海參組織可溶性全蛋白和海參組織細胞膜蛋白的海參組織蛋白質組。
【文檔編號】C07K1/02GK103665135SQ201310588498
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月21日 優先權日:2013年11月21日
【發明者】湛垚垚, 黃顯雅, 段立柱, 常亞青 申請人:大連海洋大學, 湛垚垚