專利名稱：一種可降解的酸敏感高分子兩親性陽離子嵌段共聚物與膠束粒子及其制備方法
技術領域：
本發明涉及高分子化學、藥學和生物醫學工程領域，具體地說，涉及一種可降解的酸敏感高分子兩親性陽離子嵌段共聚物與膠束粒子及其制備方法。
背景技術：
多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)是目前癌癥治療中化療失敗的主要原因之一。多藥耐藥是指腫瘤細胞對一種藥物產生耐藥性的同時也對與之結構無關、作用機制完全不同的藥物產生交叉性耐藥的廣譜耐藥現象。由于腫瘤細胞的多藥耐藥性產生的原因較復雜，通常涉及多種因素，多種基因的異常，若只使用單一模式的多藥耐藥調節劑或者免疫治療方法很難有效的逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性。為了提高化療效果，亟需發展有效的逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性的方法。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近些年來發現的一種基因沉默現象。通常是指內源或外源RNA (double-stranded RNA, dsRNA)分子高效而特異地阻斷體內特定基因表達，使目標mRNA特異性降解，誘使細胞表現出特定的基因缺失的現象。RNA干擾技術的出現，能夠針對多個基因或基因族的共同序列來同時抑制多個基因的表達，有望從根本上逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性。具有酸敏響應性的陽離子聚合物載體有著特殊的功能，其疏水的內核能夠負載疏水性的抗癌藥物，表面的陽離子能夠有效的復合基因。該載體復合物能夠同時將抗癌藥物和siRNA聯合傳輸到腫瘤病灶部位，且能夠實現智能控釋。在抗腫瘤藥物進行化療的同時通過siRNA技術阻斷抗凋亡基因BC1-2及其蛋白的表達，有望同時發揮化療治療和siRNA的作用而提高化療效果。此類酸敏響應性的陽離子雙載體目前沒有文獻報道，作為新型的生物醫用高分子載體材料具有重要的研究價值和廣闊的應用前景。

發明內容
本發明的目的在于提供一種可降解的酸敏感高分子兩親性陽離子嵌段共聚物與膠束粒子及其制備方法。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現
一種可降解的酸敏感高分子兩親性陽離子嵌段共聚物，包括親疏水段，所述親疏水段分別由聚賴氨酸和酸敏基團修飾的聚天冬氨酸衍生物組成。在上述高分子兩親性陽離子嵌段共聚物中，所述酸敏基團為二異丙基乙二胺基。 所述酸敏基團在PH 6.4-8.0之間表現出很強的酸敏響應性。上述高分子兩親性陽離子嵌段共聚物的制備方法，包括如下步驟正丁胺引發L 型賴氨基酸芐酯N-羧酸酐開環聚合，丙炔胺引發L型天冬氨基酸芐酯N-羧酸酐開環聚合，通過點擊化學反應將兩個嵌段連接起來，再通過氨解反應引入酸敏基因，最后酸性條件下脫保護得到目標產品。上述高分子兩親性陽離子嵌段共聚物的膠束粒子的制備方法，包括如下步驟將 5^10 mg共聚物與1 mg疏水性藥物共溶于1 ml的二甲基亞砜溶液中，在超聲作用下于冰浴中滴加到2. 5^10 ml的水中，然后將該混合液裝入Mcro 14000的透析袋中在水中透析一至三天即得；對于酸敏感藥物需在溶解時加1 ml三乙胺保證其疏水性。上述高分子兩親性陽離子嵌段共聚物負載藥物和基因的膠束粒子的制備方法，其特征在于包括如下步驟抗凋亡基因BCL-2 siRNA被加入到已知量的負載了 DOX的陽離子膠束溶液中，接著該混合體系被強烈渦旋1 后在室溫下靜置30 min，得到一系列不同N/ P比的同時負載了 DOX和siRNA的膠束。上述陽離子嵌段共聚物在pH 7.4時能夠自組裝形成穩定的膠束粒子。上述高分子兩親性陽離子嵌段共聚物膠束粒子能夠同時負載抗癌藥物和基因，膠束粒子能夠將負載的抗癌藥物和基因靶向傳輸到腫瘤病灶部位，膠束粒子能夠在腫瘤病灶部位實現對負載物的智能控釋。作為聯合傳輸藥物和BCL-2 siRNA的雙載體，藥物的負載量和BC1_2 siRNA的負載量相匹配才能產生良好的協同作用，最大程度地提高化療效果，因此嵌段聚合物載體的結構調控非常關鍵。為了控制共聚物兩嵌段的比例，我們分別使用小分子的引發劑正丁胺和丙炔胺來引發Lys-NCA和BLA-NCA的開環聚合反應，通過控制引發劑和單體的比例、反應溫度、反應時間等來實現對預聚物分子量的控制。兩種預聚物通過高效的點擊化學反應連接起來。具有酸敏響應性小分子二異丙基乙二胺通過氨解反應來實現。聚芐基-L賴氨酸中的芐基的脫保護反應在33%乙酸/氫溴酸條件下進行。作為一種優選方案，上述制備方法包括如下步驟將1摩爾份數三光氣與2. 5摩爾份數帶有活性側基的L型賴氨酸芐酯在干燥無水的四氫呋喃中反應制得相應的N-羧酸酐，然后根據預期均聚物的分子量計算所用的小分子引發劑正丁胺的用量來引發L型賴氨酸芐酯N-羧酸酐的開環聚合得到均聚物PLLm-NH2,端胺基再分別與溴代乙酰溴和疊氮鈉反應生成含有疊氮根基團的均聚物PLLm43。用小分子引發劑丙炔胺引發L型天冬氨酸芐酯N-羧酸酐的開環聚合得到均聚物PBLAn-NH2,用乙酸酐封端得到帶有炔基基團的均聚物alkyne-PBLAn-Ac。兩種均聚物通過點擊化學連接起來，然后再通過氨解反應將酸敏基團二乙丙基乙二胺引入，最后通過酸性條件下的水解反應除去聚賴氨酸芐酯中的保護基團，最終得到具有PH敏感性的兩親性陽離子嵌段共聚物。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
(1)本發明的可降解的酸敏感高分子兩親性陽離子嵌段共聚物載體材料是由聚賴氨酸與聚天冬氨酸衍生物組成，無毒且具有優良的生物相容性和生物可降解性；
(2)本發明可降解的酸敏感高分子兩親性陽離子嵌段共聚物載體材料具有顯著的質子響應性，其PKa值(約6. 3)處于體內弱酸性生理環境的pH值范圍內，適用于大部分有低pH 值要求的部位或組織；
(3)本發明的可降解的酸敏感高分子兩親性嵌段共聚物載體材料所形成的納米結構可以在質子濃度(即PH值)的影響下實現對負載藥物和基因的智能控釋；(4)本發明的可降解的酸敏感高分子兩親性陽離子嵌段共聚物載體材料的獨特結構使其能夠同時負載抗腫瘤藥物和基因，從而使得藥物療法和基因治療產生很好的協同作用，促進化療技術的進步。


圖 1 是均聚物 PLL10-N3 (a)禾Π alkyne-PBLA32_Ac (b)在 DMS0_d6 中的 1H 匪R 譜圖。圖 2 均聚物 alkyne-PBLAn-Ac、alkyne-PBLA14_Ac 和 alkyne-PBLA32_Ac 以 DMF 為流動相的凝膠滲透色譜圖(a);均聚物PLL(Z)ltl-N3以DMF為流動相的凝膠滲透色譜圖 (b);均聚物PLLltl與嵌段共聚物PLLltl-力-PAsp (DIP)11以水為流動相的凝膠滲透色譜圖
(C)。圖3是點擊化學反應后的嵌段共聚物PLL(Z)ltl-力-PBL^2 (a);氨解之后的嵌段共聚物 PLL (z)1Q4-PAsp (DIP)32 在 DMSO-Or6 中的 1H NMR 譜圖(b)。圖 4 是聚合物 PLL (z) 1(|-N3、PLL (Z)10-辦-PBU^2-Ac、PLL (z) 10-/ -PAsp (DIP) 32"Ac 和PLLltl-力-PAsp (DIP)32-Ac的紅外光譜對比圖。圖5均聚物PLL(z)1(143、alkyne-PBLA32-Ac及點擊化學反應后生成的嵌段共聚物PLL (Z)ltl-力-PBLA32-Ac的凝膠滲透色譜對比圖。圖6 是目標產品 PLLltl-力-PAsp (DIP^2-Ac 在 D2O 中的 1H NMR 譜圖。圖7是聚合物PLL34-力-PAsp (DIP)12的動態光散射譜圖。圖8是聚合物PLLltl-力-PAsp (DIP) n的動態光散射譜圖。圖9是聚合物PLLltl-力-PAsp (DIP)32-Ac在pH 7. 4時的臨界膠束濃度圖。圖10是負載阿霉素的聚合物PLLltl-力-PAsp (DIP)32-Ac膠束在pH 5. 5和7. 4時的熒光光譜對比圖。表1 是均聚物 PLL(z)m-N3、alkyne-PBLAn_Ac 及嵌段共聚物 PLL34-力-PAsp (DIP) 12、 PLLltl-力-PAsp (DIP) n、PLLlO-力-PAsp (DIP) 14 和 PLLltl-力-PAsp (DIP) 32 的凝膠滲透色譜對比數據。表2 是聚合物 PLL10-辦一PAsp (DIP) u_Ac、 PLL10-辦一PAsp (DIP) 14_Ac、 PLLltl-力-PAsp (DIP) 32_Ac 和 PLL34-力-PAsp (DIP) 12_Ac 的粒徑與電位數據對比圖。
具體實施例方式以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。實施例1
可生物降解的酸敏感的兩親性陽離子嵌段共聚物的制備 1.兩親性嵌段共聚物的制備
1.1 L型氨基酸芐酯N-羧酸酐的制備以天冬氨酸芐酯N-羧酸酐為例(BLA-NCA) 25.0 g (0.11 mol) β -天冬氨酸芐酯懸浮在150 mL干燥的THF中，氬氣保護， 加熱到40 ° C. 13. 5 g (0. 045 mol)三聚光氣在25 mL的THF中溶解后慢慢滴加到反應瓶中。反應溶液變澄清后，再繼續反應1小時.通入氬氣流鼓泡30 min以除去生成的HCl。反應溶液過濾除去少量沒有反應的芐酯，而后減壓濃縮到50 mL，沉淀到大量正己烷中(THF/ hexane為1/3)，把初產品BLA-NCA在THF/ hexane混合溶劑中重結晶三次除去生成的鹽。產品氬氣保護，-18 0C保存。1.2聚賴氨酸芐酯均聚物(PLL(Z)ltl-^g的合成 1.2. 1 PLL(Z)10-NH2 的合成
5. 0 g (0. 016 mol) Lys-NCA在氬氣保護下溶解在100 mL DMF中，充分攪拌，加熱到 40 ° C，0. 16 mL (0. 0017 mol)小分子引發劑正丁胺(/？-Butylamine)溶解在 5.0 mL DMF中，氬氣保護下轉移到Lys-NCA的DMF溶液中。大量氣泡冒出，反應72小時停止。1. 2. 2 PLL(Z)10-Br 的合成
接著上步反應進行端氨基與溴代乙酰溴的反應.將反應瓶放置在冰水浴中，1.45 mL (0.017 mol)溴代乙酰溴(bromoacetyl bromide)用2 mL DMF稀釋，慢慢滴加到反應瓶中，30 min后滴加完畢。室溫下反應3小時。反應溶劑DMF減壓濃縮為15 mL,沉淀到冷的乙醚中，乙醚洗數次，抽干。1. 2. 3 PLL(Z)10-N3 的合成
4.0 g (0.0013 mol) PLL(Z)m-Br 溶解在 50 mL DMF 中，0.88 g (0.013 mol) NaN3 加入反應瓶中。常溫反應48 h。減壓蒸餾除去大部分DMF，將濃縮后的溶液沉淀到冷的乙醚中。產品水洗數次除去過量的Ni^3,凍干，-18 ° C保存。1. 3聚天冬氨酸芐酯均聚物(alkyne-PBLA32-Ac)的合成
3. 0 g (0. 012 mol) BLA-NCA 溶解在 DMF (40 mL)中，加熱到 40 ° C。將溶解在 5.0 mL DMF 中的 0.0 mL (0. 0004 mol)小分子引發劑丙炔胺(propargylamine)加入到反應瓶中。大量氣泡冒出。反應72 h。然后將0.11 mL (0. 0012 mol)乙酸酐(acetic anhydride )加入到反應瓶中將端氨基封端，35 ° C反應1小時。將反應液沉淀到冷的乙醚中，乙醚洗數次，抽干。1. 4通過點擊化學反應合成兩嵌段聚合物PLL (ζ) 1(1-力-PBLA32-Ac
此反應在手套箱中操作以防其中的催化劑體系暴露空氣中的氧氣而失活.帶有炔基基團的 alkyne-PBLA32-Ac 2. 0 g (0. 28 mmol, 1 equivalent)和帶有疊氮根的 PLL(Z)ltl-N3 1.7 g (0. 56 mmol, 2 equivalents) 一起溶解在 20 mL 的 DMF 中。催化劑體系溴化亞銅/五甲基二乙烯三胺即CuBr/PMDTA CuBr為0. 04 g (0. 28 mmol, 1 equivalent), PMDTA 為 0. 05 g (0. 28 mmol, 1 equivalent)力口入到反應瓶中.氬氣保護，80 ° C下反應48 h.反應溶液沉淀到冷的乙醚中，乙醚洗數次。沉淀分級，除去過量的 PLL (Z)ltlA3。1. 5通過氨解反應合成兩嵌段聚合物PLL (ζ) 1(Γ力-PAsp (DIP) 32_Ac
2.5 g (0.25 mmol)嵌段共聚物 PLL (ζ) 1(1-力-PBLA32-Ac 溶解在 15 mL DMF 中，加熱到 40 ° C，二異丙基乙二胺即 DIP 42 mL (20 eq to the benzyl group of PBLA)加入到反應瓶中。反應Mh.沉淀到冷的乙醚中，乙醚洗數次，抽干。實施例2
聚合物納米載體的制備
2. 1 PLL (z) 1(14-PASp (DIP)32-Ac聚合物空白膠束的制備10 mg聚合物溶解在1 ml DMS0/THF混合溶劑中，充分攪拌，加入0.5 mL三乙胺使聚賴氨酸嵌段中的伯胺基去質子化，在超聲作用下緩慢滴到10 mL PH 7.4 PBS溶液中。膠束溶液用PBS透析12 h,凍干。0.45 ym水相過濾頭過濾，超濾離心管濃縮為 10 mL即聚合物濃度為1 mg/mL，4 ° C冰箱保存備用。2. 2 負載 DOX 聚合物 PLL (z) w~b~ Asp (DIP) 32_Ac 膠束的制備
2 mg水溶性DOX溶解在1 mL DMS0/THF混合溶劑中，加入0. 5 mL三乙胺使DOX 去質子化由親水性轉變為疏水性；10 mg聚合物溶解在1 mL DMS0/THF混合溶劑中，加入0.5 mL三乙胺充分攪拌.將兩者混合，充分攪拌后在超聲作用下滴到20 mL pH 7.4 PBS溶液中。微堿性透析12 h除去有機溶劑和沒有被負載的D0X，0.45 ym水相過濾頭過濾，超濾離心管濃縮為10 HiL聚合物濃度為1 mg/mL，4 ° C冰箱保存備用。2.3同時負載DOX以及SiRNA的聚合物膠束的制備
一定量(e.g. 0.1 yg)的BCL-2 siRNA被加入到已知量的負載了 DOX的 PLL (Z)ltl-力-PAsp (DIP)32-Ac陽離子膠束溶液中，接著該混合體系被強烈渦旋1 后在室溫下靜置30 min。得到一系列不同N/P比的同時負載了 DOX和siRNA的膠束。實施例3
3. 1納米載藥膠束粒徑的測試
分別將所得的1 mg/mL聚合物空白膠束溶液采用動態光散射法對其粒徑進行測量 PLL34-力-PAsp (DIP) 12和PLLltl-力-PAsp (DIP) n制成的膠束的平均粒徑分別為38. 0 nm、40. 0 nm03.2臨界膠束濃度的測定
將芘配成3.0X10-4 M的苯溶液，待苯揮發完后稱取一定量的聚合物，用pH 7.4 PBS溶液定容，依次配成0.1-1000 ug/ml的聚合物及芘的水溶液。每個樣品低強度超聲 30分鐘以促使芘被包到疏水的膠束中，然后檢測其熒光強度。3. 3熒光光譜的測定
將負載DOX的聚合物PLL (Z)ltl-力-PAsp (DIP)32-Ac膠束溶液分別調節pH為5. 5和 7.4，檢測其熒光強度。其中激發波長為490 nm,發射波長為510 nm至700 nm,狹縫寬度為12 nm。 表權利要求
1.一種可降解的酸敏感高分子兩親性陽離子嵌段共聚物，包括親疏水段，其特征在于所述的親疏水段分別由聚賴氨酸和酸敏基團修飾的聚天冬氨酸衍生物組成。
2.根據權利要求1所述的高分子兩親性陽離子嵌段共聚物，其特征在于，所述酸敏基團為二異丙基乙二胺基。
3.權利要求1所述的高分子兩親性陽離子嵌段共聚物的制備方法，其特征在于包括如下步驟正丁胺引發L型賴氨基酸芐酯N-羧酸酐開環聚合，丙炔胺引發L型天冬氨基酸芐酯N-羧酸酐開環聚合，通過點擊化學反應將兩個嵌段連接起來，再通過氨解反應引入酸敏基因，最后酸性條件下脫保護得到目標產品。
4.權利要求1所述的高分子兩親性陽離子嵌段共聚物的膠束粒子的制備方法，其特征在于包括如下步驟將5 10 mg共聚物與1 mg疏水性藥物共溶于1 ml的二甲基亞砜溶液中，在超聲作用下于冰浴中滴加到2. 5 10 ml的水中，然后將該混合液裝入Mcro 14000 的透析袋中在水中透析一至三天即得；對于酸敏感藥物需在溶解時加1體積三乙胺保證其疏水性。
5.權利要求1所述的高分子兩親性陽離子嵌段共聚物負載藥物和基因的膠束粒子的制備方法，其特征在于包括如下步驟抗凋亡基因BCL-2 siRNA被加入到已知量的負載了 DOX的陽離子膠束溶液中，接著該混合體系被強烈渦旋1 后在室溫下靜置30 min，得到一系列不同N/P比的同時負載了 DOX和siRNA的膠束。
全文摘要
本發明公開了一種可降解的酸敏感高分子兩親性陽離子嵌段共聚物與膠束粒子及其制備方法。本發明高分子兩親性嵌段共聚物的親疏水段分別由聚賴氨酸和帶有酸敏基團的聚天冬氨酸衍生物組成。本發明高分子兩親性嵌段共聚物的制備方法是以小分子胺引發劑引發帶有活性側基的L型氨基酸芐酯的N-羧酸酐開環聚合，經點擊化學將親疏水段連接起來,通過進一步的氨解反應引入酸敏基團,最后通過酸性條件下脫芐基保護基團后得到目標產品。本發明共聚物具有良好的酸敏感性、生物相容性和生物可降解性，可在水溶液中自組裝并形成納米級的膠束，該膠束能夠同時負載抗癌藥物如阿霉素和基因如BCL-2siRNA,且能夠在腫瘤部位實現對負載物的智能控釋。
文檔編號C08G69/08GK102516552SQ20111036760
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月18日 優先權日2011年11月18日
發明者國翠平, 帥心濤, 林樹東, 王小鶯, 程度, 陳偉才 申請人:中山大學