專(zhuān)利名稱(chēng)：一種脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因療法將為一切與基因有關(guān)的疾病的治療提供無(wú)限可能性，因此近二十年來(lái)成為研究熱點(diǎn)。基因治療應(yīng)用于臨床的瓶頸是其安全性和有效性問(wèn)題。由于病毒載體存在諸多無(wú)法預(yù)期和解決的諸如免疫原性、毒性、致癌性、宿主DNA插入整合等安全隱患，因此非病毒載體成為實(shí)現(xiàn)基因療法臨床應(yīng)用的希望。過(guò)去十年來(lái)，人們開(kāi)始致力于設(shè)計(jì)各種新的非病毒載體，研究提高其轉(zhuǎn)染效率、同時(shí)降低細(xì)胞毒性的途徑，并取得了極大進(jìn)展，但與病毒載體的轉(zhuǎn)染效率仍存在一定差距。因此提高非病毒載體的基因轉(zhuǎn)染效率仍是基因治療中一個(gè)需要解決的重要問(wèn)題。在非病毒載體中，聚乙烯亞胺PEI因?yàn)樵贒NA保護(hù)、細(xì)胞粘附和攝取、內(nèi)含體逃逸方面性能優(yōu)異而被認(rèn)為是最有效的陽(yáng)離子基因載體之一。但它不可降解，且轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性具有分子量依賴(lài)性，即它們均隨分子量的增加而增加。因此，研究者采用各種策略對(duì) PEI進(jìn)行改性，以進(jìn)一步提高其基因轉(zhuǎn)染效率同時(shí)降低細(xì)胞毒性。比如在大分子量的PEI上引入靶向配體、核定位信號(hào)因子等提高細(xì)胞攝取及入核能力等。或取基本無(wú)轉(zhuǎn)染效率、無(wú)細(xì)胞毒性、但具有內(nèi)含體突破能力(質(zhì)子海綿作用)、細(xì)胞粘附、并可通過(guò)新陳代謝排出體外的小分子量的PEI (LMW ΡΕΙ,ΡΕΙ分子量<業(yè)Dalton)，用可降解的交聯(lián)鍵連接起來(lái)，或?qū)?LMW PEI作為側(cè)鏈連接在可降解的大分子主鏈上等，形成含LMW PEI的大分子作為基因載體，以降低聚合物的電荷密度及使聚合物進(jìn)入細(xì)胞后能降解，并使DNA的釋放更容易，進(jìn)而降低細(xì)胞毒性，提高基因轉(zhuǎn)染效率。此外，也有研究者將膽固醇(動(dòng)物細(xì)胞膜的成分之一) 和LMW PEI連接起來(lái)形成接枝共聚物。基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明該載體能在一定程度上提高基因轉(zhuǎn)染效率(與PEI 2 相比)。他們認(rèn)為這種提高是通過(guò)膽固醇實(shí)現(xiàn)的。膽固醇的引入一方面促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)聚合物載體/基因復(fù)合物的攝取，而這種促進(jìn)作用是通過(guò)細(xì)胞的膽固醇攝取路徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的；另一方面可能因?yàn)槟懝檀紝?duì)PEI的疏水改性提高了聚合物對(duì)質(zhì)粒DNA 的包封、促進(jìn)了聚合物/DNA復(fù)合物在細(xì)胞膜表面的吸附、促進(jìn)復(fù)合物的胞內(nèi)運(yùn)輸及DNA從復(fù)合物中的釋放等。但是，這種載體的基因轉(zhuǎn)染效率仍遠(yuǎn)低于病毒的轉(zhuǎn)染水平。如利用這種載體對(duì)鼠Jurkat細(xì)胞進(jìn)行體外無(wú)血清轉(zhuǎn)染時(shí)，其綠色熒光蛋白(GFP)的基因轉(zhuǎn)染效率最高僅能達(dá)到約18% ；而在有血清轉(zhuǎn)染時(shí)，其轉(zhuǎn)染效率更低于1%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物，該聚合物具有生物相容性好、可控的降解性能、有血清及無(wú)血清基因轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低、安全實(shí)用、成本低等優(yōu)點(diǎn)ο本發(fā)明的目的還在于提供上述脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物的制備方法，該方法工藝簡(jiǎn)單、易于控制。本發(fā)明的目的還在于提供上述脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物作為基因載體以及藥物載體的用途。本發(fā)明通過(guò)制備以親水的多醛基海藻酸鈉為主鏈、疏水膽固醇封端的低分子量聚乙烯亞胺為側(cè)鏈的脂多糖胺刷狀聚合物(brush polymer)，并對(duì)其物理化學(xué)結(jié)構(gòu)、緩沖能力、轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性進(jìn)行表征，探討其用做基因載體的可行性及在提高基因轉(zhuǎn)染效率降低細(xì)胞毒性方面的作用。本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物，通過(guò)以下步驟制備獲得(1)以聚乙烯亞胺PEI和膽固醇氯甲酸酯為原料，合成膽固醇Cho封端的聚乙烯亞胺 PEI-Cho ；(2)將膽固醇Cho封端的聚乙烯亞胺PEI-Ch0接枝于多醛基海藻酸鈉MASA，合成膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho，即脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物。其中將脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物經(jīng)過(guò)還原處理時(shí)獲得還原了的膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物。具體為將步驟O)中的膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物 MASA-PEI-Cho即脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物經(jīng)硼氫化鈉NaBH4還原處理，獲得還原了的膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物。其中還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物和未還原的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物均可用作基因載體，只是還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物與未還原的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物相比更加穩(wěn)定，而未還原的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物由于亞胺鍵會(huì)水解所以降解更徹底，但轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性二者基本相同，二者的轉(zhuǎn)染效率均接近100 %。本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的上述脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物的制備方法，含以下步驟(1)以聚乙烯亞胺PEI和膽固醇氯甲酸酯為原料，合成膽固醇Cho封端的聚乙烯亞胺 PEI-Cho ；(2)將膽固醇Cho封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho接枝于多醛基海藻酸鈉MASA，合成膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho，即脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物。作為本發(fā)明的一種改進(jìn)還可以對(duì)步驟O)中獲得的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物進(jìn)行還原處理，具體過(guò)程是采用硼氫化鈉NaBH4還原膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho，獲得還原了的膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物。其中步驟(1)中所述聚乙烯亞胺PEI的分子量小于業(yè)，其與膽固醇氯甲酸酯的摩爾比為 1 0. 5 3。步驟(1)中以聚乙烯亞胺PEI和膽固醇氯甲酸酯為原料合成膽固醇封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho的具體過(guò)程為取聚乙烯亞胺PEI、二氯甲烷和三乙胺混勻得溶液A，取膽固醇氯甲酸酯溶于二氯甲烷中得溶液B，將溶液B滴加至溶液A中進(jìn)行攪拌反應(yīng)后，除去有機(jī)溶齊U，得到粘稠狀半固體，將該粘稠狀半固體溶于鹽酸水溶液中后過(guò)濾，將濾液用二氯甲烷萃取以除去未反應(yīng)完的膽固醇氯甲酸酯后，取水相過(guò)濾，濾液經(jīng)干燥即獲得膽固醇封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho。步驟⑵中多醛基海藻酸鈉MASA中醛基與膽固醇Cho封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho 的摩爾比小于1 2，所述多醛基海藻酸鈉的氧化程度為0.20-0. 80。步驟O)中將膽固醇封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho接枝于多醛基海藻酸鈉MASA合成膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho的具體過(guò)程為將多醛基海藻酸鈉溶于水中得溶液1，將膽固醇封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho溶于水中得溶液 2，將溶液1滴入劇烈攪拌的溶液2中，滴完后室溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)透析后濾去不溶物，凍干得膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的上述脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物作為基因載體以及其它藥物載體如抗癌藥物、RNA等載體的用途。所述脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物包括還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物和未還原的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明提供的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物不僅結(jié)合了 MASA、PEI、膽固醇三者的優(yōu)點(diǎn)，即同時(shí)具有MASA的可降解性、優(yōu)良的生物相容性，低分子量PEI的質(zhì)子海綿特性、低毒性、強(qiáng)的細(xì)胞膜粘附及保護(hù)DNA不受酶解的特性，膽固醇的細(xì)胞攝取及脂質(zhì)特性；而且賦予了脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物新的特性本發(fā)明脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物是兩親接枝共聚兩性電解質(zhì)，即共聚物同時(shí)具有親疏水性(兩親)及酸堿性(兩性)，可形成類(lèi)似細(xì)胞膜雙分子層的脂質(zhì)體囊泡；上述優(yōu)點(diǎn)能促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染過(guò)程中的DNA壓縮裝載、聚合物/基因復(fù)合物在細(xì)胞表面的粘附攝取、復(fù)合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)體/溶酶體的突破、DNA從復(fù)合物的解離釋放等過(guò)程， 最終達(dá)到提高基因轉(zhuǎn)染效率及降低細(xì)胞毒性的目的；(2)本發(fā)明提供的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物MASA-PEI-Cho可形成疏水層為膽固醇 (動(dòng)物細(xì)胞膜脂之一)、親水層為天然多糖及PEI的類(lèi)似細(xì)胞膜雙分子層的脂質(zhì)體囊泡。因囊泡有著很大的比表面積，且其表面正電荷更多，因此可壓縮裝載更多的DNA(帶負(fù)電荷的 DNA可增溶進(jìn)入囊腔中、也可和囊泡內(nèi)外表面帶正電荷的PEI發(fā)生中和作用后沉積于囊泡內(nèi)外表面)，更好地保護(hù)DNA不被酶解，并可能因?yàn)槟懝檀技癙EI的共同作用使復(fù)合物更易粘附在細(xì)胞膜表面，能更好地與細(xì)胞膜表面發(fā)生相互作用，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)其攝取，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的即刻毒性減小；(3)MASA中大量的羧基陰離子在酸性的內(nèi)體/溶酶體中的質(zhì)子化增強(qiáng)了共聚物的質(zhì)子緩沖能力，提高了其突破內(nèi)體/溶酶體的能力；(4)膽固醇的疏水改性及MASA的可降解性促進(jìn)了 DNA從聚合物/基因復(fù)合物中的解離釋放。由于本體系中形成聚合物/DNA納米復(fù)合物的驅(qū)動(dòng)力來(lái)源于兩方面疏水相互作用和靜電相互作用，因此膽固醇的疏水改性減弱了 DNA和PEI之間的靜電相互作用，可能促進(jìn)共聚物/DNA復(fù)合物的解離，使DNA的釋放更容易。再加上MASA的可降解性，降解后聚合物攜帶的正電荷數(shù)減少，聚合物和DNA之間的靜電相互作用繼續(xù)減弱，進(jìn)一步促進(jìn)了 DNA的
5解離釋放，同時(shí)也減輕了細(xì)胞毒性；(5)MASA的陰離子特性，可能抑制了血清蛋白對(duì)其轉(zhuǎn)染效率的抑制，因此在有血清轉(zhuǎn)染時(shí)也能獲得高達(dá)98%的基因轉(zhuǎn)染效率。


圖1是本發(fā)明MASA-PEI-Cho的合成示意圖；圖2是具體實(shí)施方式
中的PEI-Cho的1H NMR譜圖(⑶Cl3為溶劑)；圖3是具體實(shí)施方式
中制備獲得的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物溶液的緩沖能力滴定曲線(xiàn)；圖4是具體實(shí)施方式
中不同N/P下，脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物/pEGFP (pEGFP是質(zhì)粒 DNA中的一種，即增強(qiáng)的綠色熒光蛋白質(zhì)粒。如無(wú)特殊說(shuō)明，說(shuō)明書(shū)附圖和實(shí)施例中的DNA 均指pEGFP)復(fù)合物的凝膠電泳結(jié)果；圖5是rMASA-PEI-Cho在水溶液中自組裝形成納米囊泡的透射電鏡照片(磷鎢酸負(fù)染)，其中A是還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物rMASA-PEI-Cho的透射電鏡照片，B是具體實(shí)施方式
中N/P為60時(shí)，水溶液中還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物rMASA-PEI-Cho/DNA 復(fù)合物的透射電鏡照片；圖6a是具體實(shí)施方式
中rMASA-PEI-Cho最佳N/P比為60/1時(shí)熒光顯微鏡下的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞MSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況(無(wú)血清)；圖6b是具體實(shí)施方式
中PEI 25k在最佳N/P比為10/1時(shí)熒光顯微鏡下的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞MSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況(無(wú)血清)；圖7是不同的N/P下，rMASA-PEI-Cho/DNA復(fù)合物對(duì)MSCs細(xì)胞的無(wú)血清轉(zhuǎn)染效率 (流式細(xì)胞儀測(cè)定)(A)及細(xì)胞毒性(轉(zhuǎn)染后MSCs的存活率)(B)。(PEI 25k和MASA-PEI 均是文獻(xiàn)報(bào)道的最佳N/P下的轉(zhuǎn)染效率)；圖8是熒光顯微鏡下，以rMASA-PEI-Cho為載體時(shí)，MSCs對(duì)綠色熒光蛋白GFP的細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況(有血清，N/P = 100)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中使用的材料如下平均分子量為1800和25000的聚乙烯亞胺(PEI)均由Aldrich公司購(gòu)得。海藻酸鈉，粘度 300cps(Lot M3H5540, Nacalai tespue INC.，Kyoto，Japan)。攜帶報(bào)告基因增強(qiáng)的綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-Cl (華西醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng))，通過(guò)大腸桿菌hcherichia coli DH5-a增殖、用內(nèi)毒素去除試劑盒Oliagen，CA, USA)提純。DNA濃度由生物分光光度計(jì) (Eppendorf5840R,Germany)測(cè)定^Onm的紫外吸光度確定。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)按照常規(guī)方法從大鼠股骨分離提取并常規(guī)培養(yǎng)。二氯甲烷、三乙胺等為分析純?cè)噭６燃淄楹蚉EI經(jīng)脫水處理，其它試劑直接用。實(shí)施例11還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物rMASA-PEI-Cho的合成1. 1膽固醇封端的聚乙烯亞胺(PEI-Cho)的合成首先對(duì)二氯甲烷和分子量小于業(yè)的PEI進(jìn)行脫水處理，然后取3gPEI (1.67 X l(T3mOl)、10mL 二氯甲烷、100 μ L三乙胺(7. 17X10、ol)于冰上充分?jǐn)嚢杌旌?30min得澄清透明溶液A ；取0. 75g膽固醇氯甲酸酯(1. 67X 10_3mol，此處PEI與膽固醇氯甲酸酯的摩爾投料比為1 1。)溶于5mL冰冷的無(wú)水二氯甲烷中得透明澄清溶液B。攪拌下將溶液2于30min內(nèi)慢慢滴加至溶液A中，然后使反應(yīng)混合物于冰上繼續(xù)攪拌反應(yīng)12h， 旋蒸除去溶劑，得到白色極粘稠的半固體。將半固體溶于50mL 0. lmol/L HCl中，過(guò)濾，濾液用IOOmL 二氯甲烷萃取3次以除掉未反應(yīng)的膽固醇氯甲酸酯。然后過(guò)濾萃取后的水溶液，濾液經(jīng)冷凍干燥即可得PEI-Cho固體(反應(yīng)示意圖見(jiàn)圖1)。樣品置于-20°C密閉干燥保存。同時(shí)以氘代氯仿CDCl3為溶劑，用屮NMR分析共聚物的化學(xué)結(jié)構(gòu)(圖2)。圖2中， 2. 5-3. 6ppm出現(xiàn)的信號(hào)峰為PEI單體單元NCH2CH2N中的亞甲基質(zhì)子峰，其余為膽固醇中的各種質(zhì)子峰，說(shuō)明聚合物中同時(shí)存在PEI和膽固醇。另外，從IH NMR譜圖中可積分算出PEI 和膽固醇中所有氫的積分面積A，再按下式算出共聚物中兩者的摩爾比(nPEI ηΒΘΙ )。(Apei/164) (Α 膽固醇/45) = ηΡΕΙ η 刪醇經(jīng)計(jì)算得出ηΡΕΙ n_e= 1 1，即1個(gè)PEI分子上接了 1個(gè)膽固醇基。1. 2膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho的合成按王琴梅專(zhuān)利方法合成多醛基海藻酸鈉MASA(具體參閱專(zhuān)利如200910039769. 3 中所述的合成方法)。取多醛基海藻酸鈉0. 27g(含醛基7. 94X ΙΟΛιοΙ，氧化程度為 0. 26 (氧化程度在0. 2-0. 8之間均可，此處為列舉，Mn = 31)，溶于IOmL水中，得溶液1。取 5. 27g PEI-Cho (2. 38 X 10_3mol，ηβ /ηΡΕΙ = 1/3，η代表物質(zhì)的量，單位為摩爾，此處為列舉， ηβ /ηΡΕΙ < 1/2均可)溶于30mL水中，得溶液2。攪拌下將溶液1于20min內(nèi)緩慢滴入劇烈攪拌的溶液2中。滴完后，室溫下攪拌反應(yīng)Mh。反應(yīng)產(chǎn)物在蒸餾水中透析72h，濾去不溶物，凍干后得到膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho， 即脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物(反應(yīng)示意圖見(jiàn)圖1)。1.3還原了的膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物 rMASA-PEI-Cho 的合成先按上述步驟讓PEI-Cho和MASA反應(yīng)Mh，不做后續(xù)的純化，然后取 0.3gNaBH4(7.94X10-4mOl，nMASA + _基nNaBH4 = 1 1 (此處二者的摩爾比并不僅限于 1 1， 其它比例如1 1 100也可以，只要NaBH4保持過(guò)量即可)加入反應(yīng)溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)M小時(shí)，以還原共聚物中的亞胺鍵(由PEI上的氨基和MASA中的醛基反應(yīng)生成)及MASA 上殘余的醛基。產(chǎn)物在蒸餾水中透析72h，濾去不溶物，凍干后得到還原了的膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物rMASA-PEI-Cho (反應(yīng)示意圖見(jiàn)圖1)。用元素分析法測(cè)定聚合物中的N含量，結(jié)果表明，MASA中N含量為0 ；PEI 1. 8k中 N含量為23. 42mmol/g ；rMASA-PEI-Cho中N含量為11. ^mmol/g，據(jù)此可看出共聚物的N含量低于PEI 1.8k，說(shuō)明引入MASA和Cho后成功降低了聚合物的電荷密度。同時(shí)聯(lián)合元素分析及PEI-Cho的核磁積分結(jié)果計(jì)算出每8個(gè)MASA單體單元接一個(gè)PEI-Cho。因MASA的氧化程度為沈％，即每4個(gè)MASA的單體單元中有一個(gè)單體單元被氧化，考慮到PEI為高度支化的分子，反應(yīng)時(shí)存在立體位阻；此外MASA上的醛基還有可能和鄰近的羥基生成半縮醛或縮醛而不能和PEI的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，所以這個(gè)PEI-Cho在MASA上的接枝率是合理的。實(shí)施例2
1脂多糖胺陽(yáng)離子接枝共聚物MASA-PEI-Cho的合成1. 1膽固醇封端的聚乙烯亞胺(PEI-Cho)的合成首先對(duì)二氯甲烷和PEI進(jìn)行脫水處理，然后取3g PEI (1. 67 X 10_3mol)、IOmL 二氯甲烷、200 μ L三乙胺(1.43Χ IO-2Hiol)于冰上充分?jǐn)嚢杌旌?0min得澄清透明溶液A ；取 1.5g膽固醇氯甲酸酯(其與PEI的摩爾比為2 1)溶于IOmL冰冷的無(wú)水二氯甲烷中得透明澄清溶液B。攪拌下將溶液B于30min內(nèi)慢慢滴加至溶液A中，然后使反應(yīng)混合物于冰上繼續(xù)攪拌反應(yīng)12h，旋蒸除去溶劑，得到白色極粘稠的半固體。將半固體溶于50mL 0. 5mol/ L HCl中，過(guò)濾，濾液用IOOmL 二氯甲烷萃取3次以除掉未反應(yīng)的膽固醇氯甲酸酯。然后過(guò)濾萃取后的水溶液，濾液經(jīng)冷凍干燥即可得PEI-Cho固體(反應(yīng)示意圖見(jiàn)圖1)。樣品置于-20°C密閉干燥保存。同時(shí)以氘代氯仿CDCl3為溶劑，用 NMR分析共聚物的化學(xué)結(jié)構(gòu) (圖2)。圖2中，2. 5-3. 6ppm出現(xiàn)的信號(hào)峰為PEI單體單元NCH2CH2N中的亞甲基質(zhì)子峰， 其余為膽固醇中的各種質(zhì)子峰，說(shuō)明聚合物中同時(shí)存在PEI和膽固醇。另外，從IH NMR譜圖中可積分算出PEI和膽固醇中所有氫的積分面積A，再按下式算出共聚物中兩者的摩爾
比(nPEI . η膽固醇)ο(Apei/164) (Α 膽固醇/45) = ηΡΕΙ η 膽固醇經(jīng)計(jì)算得出ηΡΕΙ n_e= 1 1. 8，即1個(gè)PEI分子上接了約2個(gè)膽固醇基。1. 2膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho的合成按王琴梅專(zhuān)利方法合成多醛基海藻酸鈉MASA，具體參閱專(zhuān)利如200910039769. 3 中所述的合成方法。取多醛基海藻酸鈉0. 27g(含醛基9. MX IO-4Hiol，氧化程度為0. 35 (氧化程度大于0. 20均可，在0. 2 0. 8之間更好，此處為列舉)，溶于IOmL水中，得溶液1。 取 6. 33g PEI-Cho (2. 86 X 10"3mol, η /ηΡΕΙ = 1/3，η 代表物質(zhì)的量，單位為摩爾，ηβ /ηΡΕΙ < 1/2即可，此處為列舉但并不限定)溶于30mL水中，得溶液2。攪拌下將溶液1于20min 內(nèi)緩慢滴入劇烈攪拌的溶液2中。滴完后，室溫下攪拌反應(yīng)18h。反應(yīng)產(chǎn)物在蒸餾水中透析72h，濾去不溶物，凍干后得到膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物 MASA-PEI-Cho,即脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物(反應(yīng)示意圖見(jiàn)圖1)。以下實(shí)驗(yàn)采用的是實(shí)施例1中制備獲得的還原了的膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物進(jìn)行效果試驗(yàn)，但未還原的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物與還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物進(jìn)相比，二者在試驗(yàn)結(jié)果上基本無(wú)區(qū)別。1接枝共聚物緩沖能力的測(cè)定室溫下取50mg實(shí)施例1中制備獲得的接枝共聚物(指還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物rMASA-PEI-Cho)溶于30mL 0. 9% NaCl溶液中，用IM HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至10， 再用IM HCl進(jìn)行滴定。記錄加入的鹽酸的總體積及此時(shí)溶液相應(yīng)的pH，繪制鹽酸體積-pH 曲線(xiàn)(圖3)，并據(jù)此計(jì)算聚合物的緩沖能力。以0.9% NaCl溶液、PEI 2 分別作為空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。聚合物的緩沖能力根據(jù)下式計(jì)算( ΔH+ 樣品-ΔH+NaC1)/NX 100%,其中，ΔΗ+為滴定時(shí)，樣品溶液從pH 7. 0到4. 0之間消耗的鹽酸的摩爾數(shù)。N為樣品中所含N的摩爾數(shù)。結(jié)果，rMASA-PEI-Cho和PEI 25k的緩沖能力分別為30. 7,21. 3，說(shuō)明共聚物具有強(qiáng)的質(zhì)子緩沖能力，即具有優(yōu)異的內(nèi)含體/溶酶體逃逸能力。2載體/DNA復(fù)合物的制備和表征用去離子水調(diào)節(jié)實(shí)施例1中制備獲得的共聚物溶液濃度，使其中的氨基基團(tuán)和等體積pEGFP DNA溶液(40 μ g/mL)中磷酸基團(tuán)的摩爾比(N/P)分別為0. 3、0. 9、1. 5、3、4. 5、 6。各取50 μ L共聚物和DNA溶液，渦旋混合后室溫共孵育30min，取15 μ L復(fù)合物溶液用凝膠電泳觀察聚合物阻滯DNA的情況(圖4)。圖4顯示，rMASA-PEI-Cho和PEI 25k均在N/ P為1. 5時(shí)即對(duì)DNA具有完全阻滯能力，說(shuō)明此時(shí)聚合物能完全壓縮包裹DNA形成表面帶正電荷的復(fù)合物。此外，發(fā)明人還用透射電鏡和動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)分析了 N/P為60/1時(shí)， rMASA-PEI-Cho和DNA形成的復(fù)合物、及同樣濃度下單純r(jià)MASA-PEI-Cho水溶液的性質(zhì)。圖 5為去離子水溶液中單純共聚物(5A)及共聚物/DNA復(fù)合物(5B)的透射電鏡照片(磷鎢酸負(fù)染)。圖5A可見(jiàn)，單純共聚物在蒸餾水中能形成粒徑約為IlOnm的囊泡，因?yàn)闃悠分苽溥^(guò)程中囊泡里的水蒸發(fā)而導(dǎo)致其塌陷成癟了的足球形狀。圖5B可見(jiàn)，共聚物能壓縮DNA形成球狀的復(fù)合物納米囊泡。DLS測(cè)得共聚物的粒徑約為llOnm，ζ電位為39mV ；共聚物/DNA 復(fù)合物的平均粒徑為112nm，ζ電位為35mV，這進(jìn)一步證明rMASA-PEI-Cho自身能在水溶液中自組裝形成穩(wěn)定的表面帶正電荷的納米囊泡，也能壓縮DNA形成穩(wěn)定的、表面帶正電荷的納米囊泡。3體外骨髓間質(zhì)干細(xì)胞MSCs無(wú)血清轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞MSCs由本實(shí)驗(yàn)室按標(biāo)準(zhǔn)方法分離提取后，在含10% (ν/ν)小牛血清FBS (fetal bovine serum)，1 %青霉素-鏈霉素的DMEM 1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)傳代。將實(shí)施例1中制備獲得的聚合物載體與質(zhì)粒DNA(pEGFP)按前述方法分別用去離子水配制成一定濃度的溶液后，按N/P為45、60、77、90等體積混合，渦旋后室溫靜置30min。 將MSCs細(xì)胞接種到M孔板上，密度為1. OX IO5個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)20 M小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞融合度為70% 80%時(shí)，將有血清的培養(yǎng)液更換成不含血清的1640培養(yǎng)液(lml/孔)，每孔再加入100 μ L載體/DNA復(fù)合物溶液(含2 μ g質(zhì)粒)，37°C、5% (X)2下孵育4h。然后將培養(yǎng)介質(zhì)更換成新鮮含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)44小時(shí)，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)GFP的表達(dá)情況，用流式細(xì)胞儀測(cè)定每10000個(gè)細(xì)胞中發(fā)熒光的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，此即細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。圖6a 和圖6b為MASA-PEI-Cho和PEI 25k在最佳N/P比時(shí)熒光顯微鏡下的細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。圖 6a和圖6b中可見(jiàn)，與陽(yáng)離子聚合物PEI 2 基因載體相比，以rMASA-PEI-Cho為基因載體時(shí)，細(xì)胞對(duì)GFP的表達(dá)多且強(qiáng)。圖7A為用流式細(xì)胞儀測(cè)定的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。圖7A中可見(jiàn)， PEI2^的最高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為10. 2% (N/P = 10)，而接枝共聚物的最高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高達(dá) 96. 5% (N/P = 60、77、90)，接近病毒載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。4rMASA-PEI-Cho 的細(xì)胞毒性按“3體外骨髓間質(zhì)干細(xì)胞MSCs無(wú)血清轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)”中的方法對(duì)MSCs進(jìn)行無(wú)血清轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48h，再加入MTT溶液，用標(biāo)準(zhǔn)的MTT法研究不同N/P下的實(shí)施例1中制備的還原了的聚合物/DNA復(fù)合物對(duì)MSCs的毒性。實(shí)驗(yàn)以PEI2 為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔。 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7B。圖中的縱坐標(biāo)為細(xì)胞活力，細(xì)胞活力=OD樣品/ODrantralXlOO1^, 其中0D#S為用復(fù)合物溶液處理的細(xì)胞組在490nm處的吸光度值，0D。。ntral為只用培養(yǎng)液處理的細(xì)胞組在490nm處的吸光度值。圖7B可見(jiàn)，在所研究的范圍內(nèi)，rMASA-PEI-Cho/ DNA復(fù)合物的細(xì)胞存活率均大于PEI 25k/DNA復(fù)合物(最佳N/P比)。在最佳N/P比下， rMASA-PEI-Cho/DNA復(fù)合物的細(xì)胞存活率接近90%，其對(duì)MSCs的細(xì)胞毒性為I級(jí)(國(guó)標(biāo))， 說(shuō)明rMASA-PEI-Cho具有較低的細(xì)胞毒性，適合體內(nèi)應(yīng)用。因本實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞為正常組織的干細(xì)胞，而非癌細(xì)胞，因此其細(xì)胞毒性對(duì)體內(nèi)應(yīng)用更有說(shuō)服力。基因載體的毒性主要來(lái)源于其上大量的陽(yáng)離子，由于接枝共聚物的MASA嵌段上每個(gè)單體單元均帶有一個(gè)羧基陰離子，減少了凈陽(yáng)離子的數(shù)量，另外元素分析法證明了 MASA和Cho的引入降低了聚合物的電荷密度，因此接枝共聚物的毒性遠(yuǎn)小于PEI2^。而與帶陰離子的DNA復(fù)合后，復(fù)合物的凈陽(yáng)離子濃度進(jìn)一步降低，因此毒性進(jìn)一步減小。此外， 進(jìn)入細(xì)胞后，rMASA-PEI-Cho可降解成PEI 1. 8K、膽固醇和無(wú)毒的小分子多糖，此時(shí)其毒性進(jìn)一步降低，因此可以認(rèn)為接枝共聚物用作基因載體時(shí)有可忽略的細(xì)胞毒性。5有血清轉(zhuǎn)染有血清轉(zhuǎn)染方法同上，除了轉(zhuǎn)染前不再將有血清的培養(yǎng)液更換成無(wú)血清的培養(yǎng)液，而是更換成加入了轉(zhuǎn)染介質(zhì)的含血清全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，再換全培養(yǎng)基培養(yǎng)Mh。圖 8是rMASA-PEI-Cho在N/P = 100時(shí)的熒光顯微鏡照片，圖8中可見(jiàn)，有血清且以共聚物為載體時(shí)，MSCs對(duì)GFP的表達(dá)同樣多且強(qiáng)。流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)N/P為100、110、12、 140時(shí)，MSCs的基因轉(zhuǎn)染效率最高，為98. 2%，遠(yuǎn)高于PEI 2 最大轉(zhuǎn)染效率55. 0%。說(shuō)明陽(yáng)離子聚合物不被血清清除，且轉(zhuǎn)染效率受血清影響不大。無(wú)血清轉(zhuǎn)染的最佳N/P(60)比有血清時(shí)的最佳N/P(如100)小，這是因?yàn)檠逯杏泻芏鄮ж?fù)電荷的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)染時(shí)部分陽(yáng)離子聚合物被中和，因此達(dá)最高轉(zhuǎn)染效率需更高濃度的陽(yáng)離子聚合物。綜上，本發(fā)明設(shè)計(jì)的脂多糖-胺類(lèi)接枝共聚物(MASA-PEI-Cho)以及其還原了的脂多糖-胺類(lèi)接枝共聚物(rMASA-PEI-Cho)，合成容易、成本較低，具有低的細(xì)胞毒性、生物降解性能、接近病毒載體的高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率、且轉(zhuǎn)染效率不受血清影響，是一種適用范圍較廣，極有前景的陽(yáng)離子聚合物基因載體。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
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權(quán)利要求
1.一種脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物，其特征是通過(guò)以下步驟制備獲得(1)以聚乙烯亞胺PEI和膽固醇氯甲酸酯為原料，合成膽固醇Cho封端的聚乙烯亞胺 PEI-Cho ；(2)將膽固醇Cho封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho接枝于多醛基海藻酸鈉MASA，合成膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho，即脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物，其特征是將步驟中的膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho即脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物經(jīng)硼氫化鈉NaBH4還原處理，獲得還原了的膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物。
3.權(quán)利要求1所述的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物的制備方法，其特征是含以下步驟(1)以聚乙烯亞胺PEI和膽固醇氯甲酸酯為原料，合成膽固醇Cho封端的聚乙烯亞胺 PEI-Cho ；(2)將膽固醇Cho封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho接枝于多醛基海藻酸鈉MASA，合成膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho，即脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物的制備方法，其特征是步驟中將膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho即脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物采用硼氫化鈉NaBH4還原處理，獲得還原了的膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即還原了的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物的制備方法，其特征是步驟(1)中所述聚乙烯亞胺PEI的分子量小于業(yè)，其與膽固醇氯甲酸酯的摩爾比為1 0.5 3。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物的制備方法，其特征是步驟(1)中以聚乙烯亞胺PEI和膽固醇氯甲酸酯為原料合成膽固醇封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho的具體過(guò)程為取聚乙烯亞胺PEI、二氯甲烷和三乙胺混勻得溶液A，取膽固醇氯甲酸酯溶于二氯甲烷中得溶液B，將溶液B滴加至溶液A中進(jìn)行攪拌反應(yīng)后，除去有機(jī)溶劑，得到粘稠狀半固體，將該粘稠狀半固體溶于鹽酸水溶液中后過(guò)濾，將濾液用二氯甲烷萃取以除去未反應(yīng)完的膽固醇氯甲酸酯后，取水相過(guò)濾，濾液經(jīng)干燥即獲得膽固醇封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物的制備方法，其特征是步驟中多醛基海藻酸鈉MASA中醛基與膽固醇Cho封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho的摩爾比小于1 2， 所述多醛基海藻酸鈉的氧化程度為0. 20-0. 80。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物的制備方法，其特征是步驟中將膽固醇封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho接枝于多醛基海藻酸鈉MASA合成膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho的具體過(guò)程為將多醛基海藻酸鈉溶于水中得溶液1，將膽固醇封端的聚乙烯亞胺PEI-Cho溶于水中得溶液2，將溶液1滴入劇烈攪拌的溶液2中，滴完后室溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)透析后濾去不溶物，凍干得膽固醇封端的聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI-Cho。
9.權(quán)利要求1-2所述的脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物作為基因載體以及藥物載體的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物，通過(guò)以親水的多醛基海藻酸鈉為主鏈、疏水膽固醇封端的低分子量聚乙烯亞胺為側(cè)鏈合成，并對(duì)其物理化學(xué)結(jié)構(gòu)、緩沖能力、轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性進(jìn)行了表征，探討其用作基因載體的可行性及在提高基因轉(zhuǎn)染效率降低細(xì)胞毒性方面的作用發(fā)現(xiàn)，該聚合物具有生物相容性好、可控的降解性能、在MSCs中無(wú)論有無(wú)血清對(duì)GFP的轉(zhuǎn)染效率均高于95％、細(xì)胞毒性低、安全實(shí)用、成本低等優(yōu)點(diǎn)，并可作為基因載體以及其它藥物載體如抗癌藥物、RNA等載體的應(yīng)用，本發(fā)明還公開(kāi)了該聚合物的制備方法和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C08G73/04GK102558569SQ20121000805
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者滕偉, 王琴梅 申請(qǐng)人:中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院, 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院