專利名稱：胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及肝素鈉生產技術領域，特別涉及一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝。
背景技術：
肝素鈉又稱肝素，是一種含有硫酸基的酸性粘多糖類天然抗凝血物質。肝素鈉為白色或類白色粉末，無臭無味，有引濕性，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、二氧六環等有機溶劑。肝素鈉廣泛存在于哺乳動物肝、肺、腸黏膜中，多與蛋白質結合成復合體存在。酶解蛋白可分離肝素鈉，肝素鈉是含硫酸、氨基、醛糖酸的粘多糖。在PH8-9時，帶負電荷，可與陰離子交換劑進行離子交換，進行粗分離，多糖液在高濃度乙醇中沉淀進行精純。肝素鈉是血液化學成分測定中最好的抗凝劑。肝素鈉是一種含硫酸基團的黏多糖，分子量為1.5萬，其抗凝機制是與抗凝酶II一起，在低濃度能抑制因子IX a、VDI和PF3之間的作用，并能加強抗凝血酶III滅活絲氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶形成；還有抑制凝血酶的自我催化及抑制因子X的作用。 傳統的肝素鈉的酶解生產方法的缺陷是:生產周期長，能耗大，收率低，生產一億國際單位肝素鈉粗品需2800-3000根豬小腸的粘膜，產品純度低，肝素鈉的效價至多為80U/mg，并產生大量的腸渣和廢水，污染環境。CN1308088A的發明公開了一種利用生物發酵工藝生產肝素鈉的方法。該方法采用2709蛋白酶作為催化劑，D204強堿性陰離子交換樹脂作為離子交換樹脂，并采用150-180目多層布篩進行過濾。2709蛋白酶為人工合成物，降低了肝素鈉產品的天然性，而且采用2709蛋白酶酶解，生產過程中產生的異味較大，污染環境。同時該方法的產品收率、純度也較低。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝，生產周期短，產品收率、純度高，可以很大程度的減少生產過程中異味產生，利于環保，在提取中大大減少了人工合成物的使用，提高了產品的天然性。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:
一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝，所述的工藝步驟如下:
(I)胰蛋白酶酶液制備:取新鮮豬胰臟，去除表面殘留油脂，用絞肉機將其絞碎，將絞碎的豬胰臟:飽和石灰水=1:9-12的重量比例混合均勻得胰蛋白酶酶液。(2)酶解:將豬小腸粘膜漿液加入酶解罐，豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1:
2.5-4的重量比的混合物，向酶解罐中加入鹽度21° -24°的氯化鈉溶液調節酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°，控制料液的pH在8.5 + 0.5 ;接著按每1000L料液加15 ± 5kg的酶量向酶解罐內加入胰蛋白酶酶液，控制料液溫度在53±3°C，鹽度4.2±0.2°，pH 7.0±0.5保持3±0.5小時；最后升溫至85-88°C，保持20_25min得酶解液，過濾去殘渣。本步驟最后酶解液過濾去殘渣時，往往采用布袋過濾去殘渣，這樣效率往往較低，發明人通過實踐探索，發明了采用振動篩過濾去殘渣的方式，大大提高了過濾速度，提高了生產效率，是代替布袋過濾的好方法。(3)吸附:將酶解液輸入吸附罐，降溫至57±3°C，加水調節鹽度至3.0±0.5°，控制pH 7.0-7.5，按每1000L酶解液加3_8kg的樹脂量，向吸附罐內加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂，攪拌吸附6-8小時后，收集樹脂。(4)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性，再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液，攪拌至少I小時進行洗滌，其中，樹脂:氯化鈉溶液=1:1.3-1.7 (w/V)。控制氯化鈉溶液溫度在55-60°C，便于將樹脂表面油脂類的附著物清洗干凈，便于洗脫。(5)洗脫:將步驟(4)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進行兩次洗脫，其中，第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液中攪拌至少3小時，樹月旨:氯化鈉溶液=1:1-1.4 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液中攪拌至少3小時，樹脂:氯化鈉溶液=1:0.8-1.2 (w/v);合并兩次收集的洗脫液；控制兩次洗脫洗脫時的氯化鈉溶液溫度在55-60°C，便于將油脂狀的肝素鈉從樹脂上洗脫下來，增加得率。(6)沉淀:將步驟(5)收集到的洗脫液倒入沉淀罐中，攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度85±5°的酒精，酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45° -60°為準，靜置沉淀15小時以上，收集沉淀物。(7)重溶再沉淀:將沉淀物:水=1:8-10的重量比混合，充分溶解形成沉淀物溶液，向沉淀物溶液中加入腸衣專用鹽，攪拌均勻，腸衣專用鹽的用量為沉淀物溶液質量的1-3%;再加入酒精度85±5°的酒精再次沉淀，酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45° -60°為準，靜置沉淀15小時以上，收集沉淀物。(8)干燥:步驟(7)收集的沉淀物加入酒精度85°以上的酒精進行脫水1-3小時，濾干后做烘干處理即得肝素鈉產品。本發明中的w/v為質量體積比具體為:kg:L。本發明另辟蹊徑，采用新鮮豬胰臟為原料制取胰蛋白酶酶液，再用于提取肝素鈉，這樣大大減少了人工合成物的使用，提高了產品的天然性；而且，采用本發明的胰蛋白酶酶液提取肝素鈉，可以很大程度的減少生產過程中異味產生，利于環保。現有的肝素鈉生產過程的酒沉即沉淀步驟時，高濃度的酒精和洗脫液容易形成鹽結晶混在肝素鈉產品中，高濃度的酒精和洗脫液容易形成鹽結晶不容易被從肝素鈉產品中發現并分離，這樣大大降低了肝素鈉產品的純度。本發明通過增加了重溶再沉淀步驟，能有效解決高濃度的酒精和洗脫液容易形成鹽結晶混在肝素鈉產品中導致產品純度較低的問題。經本發明處理后的肝素鈉產品純度有明顯提高，肝素鈉的效價> 130U/mg。本發明采用新鮮豬胰臟為原料制取胰蛋白酶酶液提取肝素鈉，收率高，生產一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸。作為優選，步驟(2)處理得到的酶解液在6000-8000轉/分的轉速下，離心處理20-40min后，再進入下 一步的吸附。酶解后得到乳濁狀液體，濾去殘渣后進入離心機，啟動離心機，酶解液在離心力作用下，使乳濁狀酶解液進入離心機轉鼓后，固體顆粒或密度較大的液體(含蛋白)向轉鼓壁沉降，形成沉洛，密度較小的肝素鈉分解液向轉鼓中心方向聚集，流至溢流口排出，成為分離液。沉渣通過蝸桿傳動把沉渣從排渣口擠壓出來，分離液通過離心機從出料口排出，輸送到吸附罐內進行下一步樹脂吸附工序。增加本步驟后在分解工段中直接清除了部分雜質，使吸附工序中的樹脂能充分吸附肝素鈉，提高樹脂吸附有效性。在分解工序中直接進行雜質的分離，提高最終產品的純度。控制離心速度和時間，保證離心分離的效果。作為優選，將步驟(3)收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐，控制溫度在57±3°C，pH 7.0-7.5，按每1000L料液加2_3kg的樹脂量向吸附罐內加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附6-8小時后，收集樹脂，然后與步驟(3)收集的樹脂合并后，進入下一步的洗滌步驟。本步驟將樹脂吸附后的料液重新進行吸附，可以提高肝素鈉的收率，減少浪費，同時能減少廢液中蛋白的含量，利于廢水處理。作為優選，所述羅門哈斯FPA98CL型樹脂活化處理后再使用，活化處理為:樹脂用50-60°C溫水浸泡20小時以上后用清水沖洗干凈并浙干,再加入質量濃度為10%的氫氧化鈉溶液攪拌I個小時以上，最后用清水沖洗至洗液PH為中性，所述氫氧化鈉溶液的加入量為每千克樹脂加入IL氫氧化鈉溶液的量計；活化后的樹脂在4000-5000轉/分的轉速下，離心處理10-30min,再用于吸附。將活化處理后待使用的樹脂通過離心機進料口進入離心機。啟動離心機，樹脂在4000-5000轉/分鐘的轉速作用下，樹脂進入離心機轉鼓后，固體顆粒樹脂向轉鼓壁沉降，粘附在鼓壁內。離心作用甩出 的液體或密度較小的物質向轉鼓中心方向聚集，流至溢流口排出，成為廢物。收集留在鼓壁的樹脂，準備用于吸附工序。本步驟樹脂孔內水分得到充分甩干，以增加樹脂的吸附空間，提高樹脂的吸附能力。作為優選，步驟(5)收集的洗脫液進入超濾機超濾后再進入步驟(6)沉淀，超濾機的超濾膜孔徑在0.45 μ m-0.6 μ m。經過超濾，可將洗脫液中的廢水和雜質排除，有效提高產品的純度，并能減少下一步酒沉工藝中的酒精使用量，節約成本。作為優選，步驟(5)收集的洗脫液在8000-10000轉/分的轉速下，離心處理10-20min后，再進入步驟(6)沉淀。把洗脫液通過離心機進料口進入離心機，啟動離心機，洗脫液在分解液在離心力(8000-10000轉/分)作用下，使乳濁狀洗脫液進入離心機轉鼓后，固體顆粒或密度較大的液體(含蛋白)向轉鼓壁沉降，形成沉渣，密度較小的肝素鈉洗脫液向轉鼓中心方向聚集，流至溢流口排出，成為分離液。沉渣通過蝸桿傳動把沉渣從排渣口擠壓出來，分離液通過離心機從出料口排出，輸送到沉淀罐內進行下一步酒精沉淀工序。本步驟增加對洗脫液離心的工序，從而在洗脫工序中直接去除部分雜質和蛋白，從而提高最終產品的純度，并能減少下一步酒沉工藝中的酒精使用量，節約成本。作為優選，步驟(6)收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻，并調節pH為9-10，上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.5-0.7，靜置沉淀8-12小時后，收集沉淀，然后與步驟(6)得到的沉淀物合并后進入下一步的重溶再沉淀。
本步驟對第一次酒沉后的上清液再次進行酒沉，可有效提高肝素鈉的收率，減少浪費，利于廢水處理。作為優選，步驟(8)烘干處理的溫度為60-80°C。作為優選，收集步驟(2)酶解液過濾獲得的殘渣，向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液，然后將殘渣重新加入酶解罐中，殘渣與鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:5-6，控制料液的pH在8.5±0.5，接著按每1000L料液加10_12kg的酶量向酶解罐內加入胰蛋白酶酶液，控制料液溫度在55±1°C，保溫6-7小時；最后升溫至88-90°C，保持20-25min,再靜置20_30min后得酶解液，酶解液在6000-8000轉/分的轉速下，離心處理20-40min后,進入下一步的吸附。現有工藝中，酶解剩余的殘渣即腸渣往往棄之不用，這樣較浪費且增加了環境的負擔。而本發明的發明人經過多年實踐探索，發明了一條有效再利用殘渣的工藝步驟，通過對殘渣的再次酶解處理，能更進一步分解殘渣，提取肝素鈉，增加了肝素鈉的收率，減少了廢物排放，利于環保。本發明的有益效果是:
1、采用新鮮豬胰臟為原料制取胰蛋白酶酶液，再用于提取肝素鈉，這樣大大減少了人工合成物的使用，提高了產品的天然性；而且，采用本發明的胰蛋白酶酶液提取肝素鈉，可以很大程度的減少生產過程中異味產生，利于環保。2、收率高，生產一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸。3、增加了重溶再沉淀步驟，能有效解決高濃度的酒精和洗脫液容易形成鹽結晶混在肝素鈉產品中導致產品純度較低的問題，產品純度高，肝素鈉的效價> 130U/mg。
具體實施例方式下面通過具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。本發明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。樹脂活化處理:
將新的羅門哈斯FPA98CL型樹脂(市售進口樹脂，經銷商北京博賽斯生物技術有限公司)用50°C溫水浸泡20小時后用清水沖洗干凈并浙干，再加入質量濃度為10%的氫氧化鈉溶液攪拌I個小時以上，最后用清水沖洗至洗液PH為中性，所述氫氧化鈉溶液的加入量為每千克樹脂加入IL氫氧化鈉溶液的量計。研究表明，樹脂活化處理中采用的溫水溫度在50-60°C之間，浸泡時間在16-24小時之間，對樹脂的活化處理效果是等同的，在此不做——贅述。活化后的樹脂在4000-5000轉/分的轉速下，離心處理10-30min，再用于吸附。實施例1:
(I)胰蛋白酶酶液制備:取新鮮豬胰臟，去除表面殘留油脂，用絞肉機將其絞碎，將絞碎的豬胰臟:飽和石灰水=1:10的重量比例混合均勻得胰蛋白酶酶液。

(2)酶解:將1000L豬小腸粘膜漿液(由豬小腸經刮腸機處理而得)加入酶解罐，豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1: 3的重量比的混合物，向酶解罐中加入鹽度22°的氯化鈉溶液調節酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°，控制料液的pH在8.5左右；接著按每IOOOL料液加15kg的酶量向酶解罐內加入胰蛋白酶酶液，控制料液溫度在53°C，鹽度4.2±0.2° ,pH 7.0左右保持3小時；最后升溫至86°C，保持23min得酶解液，過濾去殘渣。然后酶解液在7000轉/分的轉速下，離心處理30min后，再進入下一步的吸附。收集酶解液過濾獲得的殘渣，向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液，然后將殘渣重新加入酶解罐中，殘渣與鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:5，控制料液的pH在8.5左右，接著按每1000L料液加IOkg的酶量向酶解罐內加入胰蛋白酶酶液，控制料液溫度在55°C，保溫6小時；最后升溫至90°C，保持22min，再靜置25min后得酶解液，酶解液在7000轉/分的轉速下，離心處理30min后，進入下一步的吸附(與豬小腸粘膜酶解得到的酶解液都輸入吸附罐)。(3)吸附:將酶解液輸入吸附罐，降溫至57°C，加水調節鹽度至3.0±0.5°，控制PH 7.0，按每1000L酶解液加5kg的樹脂量，向吸附罐內加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂，攪拌吸附7小時后，收集樹脂；將收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐，控制溫度在57°C,pH 7.0，按每1000L料液加2.5kg的樹脂量向吸附罐內加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附7小時后，收集樹脂，然后與酶解液吸附收集的樹脂合并后，進入下一步的洗滌步驟。(4)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性，再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度58°C的氯化鈉溶液，攪拌2小時進行洗滌，其中，樹脂:氯化鈉溶液=1:1.5 (w/v)。(5)洗脫:將步驟(4)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進行兩次洗脫，其中，第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度58°C的氯化鈉溶液中攪拌4小時，樹脂:氯化鈉溶液=1:1.2 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21±1°、溫度58°C的氯化鈉溶液中攪拌4小時，樹脂:氯化鈉溶液=1:1.0(w/v);合并兩次收集的洗脫液。收集的洗脫液進入超濾機 超濾后再進入下一步沉淀，超濾機的超濾膜孔徑在
0.45 μ m-0.6 μ m。(6)沉淀:將收集到的洗脫液倒入沉淀罐中，攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度85°的酒精，酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到50°為準，靜置沉淀18小時，收集沉淀物。收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻，并調節PH為9，上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.6，靜置沉淀10小時后，收集沉淀，然后與洗脫液沉淀得到的沉淀物合并后進入下一步的重溶再沉淀。(7)重溶再沉淀:將沉淀物冰=1:9的重量比混合，充分溶解形成沉淀物溶液，向沉淀物溶液中加入腸衣專用鹽，攪拌均勻，腸衣專用鹽的用量為沉淀物溶液質量的2%;再加入酒精度85°的酒精再次沉淀，酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到50°為準，靜置沉淀18小時，收集沉淀物。(8)干燥:向沉淀物加入酒精度90°的酒精進行脫水2小時，濾干后80°C烘干即得肝素鈉產品。經檢測，生產一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸，產品純度高，肝素鈉的效價> 130U/mg
實施例2:
(I)胰蛋白酶酶液制備:取新鮮豬胰臟，去除表面殘留油脂，用絞肉機將其絞碎，將絞碎的豬胰臟:飽和石灰水=1:9的重量比例混合均勻得胰蛋白酶酶液。(2)酶解:將2000L豬小腸粘膜漿液加入酶解罐，豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1: 2.5的重量比的混合物，向酶解罐中加入鹽度21°的氯化鈉溶液調節酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°，控制料液的pH在8.0 ;接著按每1000L料液加IOkg的酶量向酶解罐內加入胰蛋白酶酶液，控制料液溫度在50°C，鹽度4.2±0.2° ,pH 6.5保持3.5小時；最后升溫至85°C，保持25min得酶解液，過濾去 殘渣。然后酶解液在6000轉/分的轉速下，離心處理40min后,再進入下一步的吸附。收集酶解液過濾獲得的殘渣，向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液，然后將殘渣重新加入酶解罐中，殘渣與鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:6，控制料液的pH在8左右，接著按每1000L料液加12kg的酶量向酶解罐內加入胰蛋白酶酶液，控制料液溫度在54°C，保溫7小時；最后升溫至88°C，保持25min，再靜置30min后得酶解液，酶解液在6000轉/分的轉速下，離心處理40min后，進入下一步的吸附。(3)吸附:將酶解液輸入吸附罐，降溫至54°C，加水調節鹽度至3.0±0.5°，控制PH 7.5，按每1000L酶解液加3kg的樹脂量，向吸附罐內加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂，攪拌吸附8小時后，收集樹脂；將收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐，控制溫度在54°C,pH 7.5，按每1000L料液加2kg的樹脂量向吸附罐內加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附8小時后，收集樹脂，然后與酶解液吸附收集的樹脂合并后進入下一步的洗滌步驟。(4)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性，再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度60°C的氯化鈉溶液,攪拌I小時進行洗漆，其中，樹脂:氯化鈉溶液=1:1.3 (w/v)。(5)洗脫:將步驟(4)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進行兩次洗脫，其中，第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55°C的氯化鈉溶液中攪拌5小時，樹脂:氯化鈉溶液=1:1 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55°C的氯化鈉溶液中攪拌5小時，樹脂:氯化鈉溶液=1:0.8 (w/v);合并兩次收集的洗脫液。收集的洗脫液在8000轉/分的轉速下，離心處理20min后，再進入下一步沉淀。(6)沉淀:將洗脫液倒入沉淀罐中，攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度80°的酒精，酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45°為準，靜置沉淀20小時，收集沉淀物。收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻，并調節PH為10，上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.5，靜置沉淀12小時后，收集沉淀，然后與洗脫液沉淀得到的沉淀物合并后進入下一步的重溶再沉淀。(7)重溶再沉淀:將沉淀物:水=1:8的重量比混合，充分溶解形成沉淀物溶液，向沉淀物溶液中加入腸衣專用鹽，攪拌均勻，腸衣專用鹽的用量為沉淀物溶液質量的1%;再加入酒精度80°的酒精再次沉淀，酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45°為準，靜置沉淀20小時，收集沉淀物。(8)干燥:向沉淀物加入酒精度85°的酒精進行脫水I小時，濾干后60°C烘干即得肝素鈉產品。經檢測，生產一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸，產品純度高，肝素鈉的效價> 130U/mg
實施例3:
(I)胰蛋白酶酶液制備:取新鮮豬胰臟，去除表面殘留油脂，用絞肉機將其絞碎，將絞碎的豬胰臟:飽和石灰水=1:12的重量比例混合均勻得胰蛋白酶酶液。(2)酶解:將豬小腸粘膜漿液加入酶解罐，豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1:4的重量比的混合物，向酶解罐中加入鹽度24°的氯化鈉溶液調節酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°，控制料液的pH在9.0 ;接著按每1000L料液加20kg的酶量向酶解罐內加入胰蛋白酶酶液，控制料液溫度在56°C，鹽度4.2±0.2°，pH 7.5保持2.5小時；最后升溫至88 0C，保持20min得酶解液，過濾去殘渣。酶解液在8000轉/分的轉速下，離心處理20min后，再進入下一步的吸附。收集酶解液過濾獲得的殘渣，向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液，然后將殘渣重新加入酶解罐中，殘渣與鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1: 5，控制料液的PH在9，接著按每1000L料液加12kg的酶量向酶解罐內加入胰蛋白酶酶液，控制料液溫度在56°C，保溫6小時；最后升溫至90°C，保持20min，再靜置30min后得酶解液，酶解液在8000轉/分的轉速下，離心處理20min后，進入下一步的吸附。(3)吸附:將酶解 液輸入吸附罐，降溫至60°C，加水調節鹽度至3.0±0.5°，控制PH 7.0，按每1000L酶解液加8kg的樹脂量，向吸附罐內加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂，攪拌吸附6小時后，收集樹脂；將收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐，控制溫度在60°C, pH 7.0，按每1000L料液加3kg的樹脂量向吸附罐內加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附6小時后，收集樹脂，然后與酶解液吸附收集的樹脂合并后，進入下一步的洗滌步驟。(4)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性，再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度60°C的氯化鈉溶液,攪拌I小時進行洗漆，其中，樹脂:氯化鈉溶液=1: 1.7 (w/v)。(5)洗脫:將步驟(4)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進行兩次洗脫，其中，第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度60°C的氯化鈉溶液中攪拌3小時，樹脂:氯化鈉溶液=1: 1.4 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21±1°、溫度60°C的氯化鈉溶液中攪拌3小時，樹脂:氯化鈉溶液=1: 1.2 (w/v);合并兩次收集的洗脫液。收集的洗脫液在10000轉/分的轉速下，離心處理IOmin后，再進入下一步沉淀。(6)沉淀:將洗脫液倒入沉淀罐中，攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度90°的酒精，酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到60°為準，靜置沉淀15小時，收集沉淀物。收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻，并調節PH為10，上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.7，靜置沉淀8小時后，收集沉淀，然后與洗脫液沉淀得到的沉淀物合并后進入下一步的重溶再沉淀。(7)重溶再沉淀:將沉淀物:水=1: 10的重量比混合，充分溶解形成沉淀物溶液，向沉淀物溶液中加入腸衣專用鹽，攪拌均勻，腸衣專用鹽的用量為沉淀物溶液質量的3%;再加入酒精度90°的酒精再次沉淀，酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到60°為準，靜置沉淀15小時，收集沉淀物。(8)干燥:向沉淀物加入酒精度90°的酒精進行脫水I小時，濾干后70°C烘干即
得肝素鈉產品。經檢測，生產一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸，產品純度高，肝素鈉的效價> 130U/mg本發明大大減少了人工合成物的使用，提高了產品的天然性；而且，采用本發明的胰蛋白酶酶液提取肝素鈉，可以很大程度的減少生產過程中異味產生，利于環保。以上所述的實施例只是本發明的一種較佳的方案，并非對本發明作任何形式上的限制，在不超出權利要求所記載的`技術方案的前提下還有其它的變體及改型。
權利要求
1.一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝，其特征在于:所述的工藝步驟如下: (1)胰蛋白酶酶液制備:取新鮮豬胰臟，去除表面殘留油脂，用絞肉機將其絞碎，將絞碎的豬胰臟:飽和石灰水=1:9-12的重量比例混合均勻得胰蛋白酶酶液； (2)酶解:將豬小腸粘膜漿液加入酶解罐，豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1:2.5-4的重量比的混合物，向酶解罐中加入鹽度21° -24°的氯化鈉溶液調節酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°，控制料液的pH在8.5 + 0.5 ;接著按每1000L料液加15±5kg的酶量向酶解罐內加入胰蛋白酶酶液，控制料液溫度在53±3°C，鹽度4.2±0.2°，pH 7.0±0.5保持3±0.5小時；最后升溫至85-88°C，保持20_25min得酶解液，過濾去殘渣； (3)吸附:將酶解液輸入吸附罐，降溫至57±3°C，加水調節鹽度至3.0±0.5°，控制pH7.0-7.5，按每1000L酶解液加3-8kg的樹脂量，向吸附罐內加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂，攪拌吸附6-8小時后，收集樹脂； (4)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性，再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液，攪拌至少I小時進行洗滌，其中，樹脂:氯化鈉溶液=1:1.3-1.7 (w/V); (5)洗脫:將步驟(4)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進行兩次洗脫，其中，第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液中攪拌至少3小時，樹脂:氯化鈉溶液=1:1-1.4 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55-60°C的氯化鈉 溶液中攪拌至少3小時，樹脂:氯化鈉溶液=1:0.8-1.2 (w/v);合并兩次收集的洗脫液； (6)沉淀:將步驟(5)收集到的洗脫液倒入沉淀罐中，攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度85±5°的酒精，酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45° -60°為準，靜置沉淀15小時以上，收集沉淀物； (7)重溶再沉淀:將沉淀物:水=1:8-10的重量比混合，充分溶解形成沉淀物溶液，向沉淀物溶液中加入腸衣專用鹽，攪拌均勻，腸衣專用鹽的用量為沉淀物溶液質量的1-3%;再加入酒精度85±5°的酒精再次沉淀，酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45° -60°為準，靜置沉淀15小時以上，收集沉淀物； (8)干燥:步驟(7)收集的沉淀物加入酒精度85°以上的酒精進行脫水1-3小時，濾干后做烘干處理即得肝素鈉產品。
2.根據權利要求1所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝，其特征在于:步驟(2)處理得到的酶解液在6000-8000轉/分的轉速下，離心處理20-40min后，再進入下一步的吸附。
3.根據權利要求1所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝，其特征在于:將步驟(3)收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐，控制溫度在57±3°C，pH 7.0-7.5，按每1000L料液加2-3kg的樹脂量向吸附罐內加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附6_8小時后，收集樹脂，然后與步驟(3)收集的樹脂合并后，進入下一步的洗滌步驟。
4.根據權利要求1或3所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝，其特征在于:所述羅門哈斯FPA98CL型樹脂活化處理后再使用，活化處理為:樹脂用50-60°C溫水浸泡20小時以上后用清水沖洗干凈并浙干，再加入質量濃度為10%的氫氧化鈉溶液攪拌1個小時以上，最后用清水沖洗至洗液pH為中性，所述氫氧化鈉溶液的加入量為每千克樹脂加入IL氫氧化鈉溶液的量計；活化后的樹脂在4000-5000轉/分的轉速下，離心處理10-30min，再用于吸附。
5.根據權利要求1或2或3所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝，其特征在于:步驟(5)收集的洗脫液進入超濾機超濾后再進入步驟(6)沉淀，超濾機的超濾膜孔徑在 0.45 μ m-0.6 μ m。
6.根據權利要求1或2或3所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝，其特征在于:步驟(5)收集的洗脫液在8000-10000轉/分的轉速下，離心處理10-20min后，再進入步驟(6)沉淀。
7.根據權利要求1或2或3所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝，其特征在于:步驟(6)收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻，并調節pH為9-10，上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.5-0.7，靜置沉淀8-12小時后，收集沉淀，然后與步驟(6)得到的沉淀物合并后進入下一步的重溶再沉淀。
8.根據權利要求1或2或3所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝，其特征在于:步驟(8)烘干處理的溫度為60-80°C。
9.根據權利要求1或2或3所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝，其特征在于:收集步驟(2)酶解液過濾獲得的殘渣，向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液，然后將殘渣重新加入酶解罐中，殘渣與鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:5-6，控制料液的PH在8.5±0.5，接著按每1000L料液加10_12kg的酶量向酶解罐內加入胰蛋白酶酶液，控制料液溫度在55土 1°C，保溫6-7小時；最后升溫至88-90°C，保持20_25min，再靜置20-30min后得酶解液，酶解液在6000-8000轉/分的轉速下，離心處理20_40min后，進入下一步的吸附。
全文摘要
本發明涉及肝素鈉生產技術領域，提供了一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝。本發明另辟蹊徑，采用新鮮豬胰臟為原料制取胰蛋白酶酶液，再用于提取肝素鈉，這樣大大減少了人工合成物的使用，提高了產品的天然性，收率高，生產一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸；而且，采用本發明的胰蛋白酶酶液提取肝素鈉，可以很大程度的減少生產過程中異味產生，利于環保。本發明通過增加了重溶再沉淀步驟，能有效解決高濃度的酒精和洗脫液容易形成鹽結晶混在肝素鈉產品中導致產品純度較低的問題。經本發明處理后的肝素鈉產品純度有明顯提高，肝素鈉的效價＞130U/mg。
文檔編號C08B37/10GK103183747SQ201210347348
公開日2013年7月3日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者花瑞華, 潘為群, 潘為中 申請人:杭州龍揚生物科技有限公司