專利名稱：一種微圖案化溫敏殼聚糖膜及其制備方法
技術領域：
本發明涉及膜材料及技術，特別涉及一種細胞培養和脫附用的圖案化溫度敏感膜及其制備方法。
背景技術：
生物材料表面拓撲結構對細胞行為的影響是組織工程研究中的一個重要課題Stevens MM, George J H. Exploring and engineering the cell surface interface.Science，2005，310 (5751) : 1135-1138。研究表明，微/納米尺度的拓撲結構與機體內細胞生長的自然環境極為相似，材料表面微觀形態對于細胞的黏附、增殖、移動、分化都起著非常重要的作用Recknor J B, Sakaguchi D S, Mallapragada S K. Directed growthand selective differentiation of neuralprogenitor cells on micropatternedpolymer substrate. Biomaterials, 2006, 27 (22) :4098_4108。隨著這一研究課題的持續·升溫，關于微/納米拓撲結構的構建方法更是得到快速發展，如國內如許海燕等采用高壓靜電紡絲技術構建了聚氨酯(PU)取向納米纖維聚合物膜，研究了其引導人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)生長的作用韓昭昭，孔樺，許海燕等.取向納米纖維聚合物膜引導內皮細胞生長的作用.高等學校化學學報，2008，29 (5) :1070 1073。路慶華等通過激光刻蝕技術，制備了柱狀、三角形、矩形等溝槽結構，研究了不同基質表面形貌對細胞行為的影響朱邦尚，路慶華等.不同的基質表面形貌對細胞生長行為的影響.細胞生物學雜志，2003，25(4) :228-230。國外如Dalby等利用聚合物微相分離技術，制備了表面分布有納米級島結構的聚合物材料Dalby MJ, Riehle MO, Johnstone H, et al. In vitro reaction ofendothelial cells to polymerdemixed nanotopography. Biomaterials, 2002, 23(14)2945。Dusseiller MR等在聚苯乙烯膜表面通過表面摹拓方法，構建了 3D微結構，進行單細胞培養的研究Dusseiller MR, Schlaepfer D, Koch M, Kroschewski R, Textor Μ. Aninverted microcontact printing method on topographicallystructured polystyrenechips for arrayed micro-3—D culturing of single cells. Biomaterials2005,26 5917-5925。Curtis等通過電子刻蝕技術在聚乙酸內酯或聚甲基丙烯酸甲酯表面制備有序排列的直角或六邊形的納米點，檢測該拓撲結構對人類纖維母細胞的影響Curtis AS，Gadegaard N,Dalby MJ,et al. Cells react to nanoscale order and symmetry in theirsurroundings. IEEE Trans Nanobioscience, 2004, 3 (I) :61_66。這些方法都各有其優缺點，如激光刻蝕、電子刻蝕等方法需要超純凈以及昂貴設備，表面摹拓方法轉移圖形不精確等，因此需要開發簡便易行，成本低廉的制備拓撲微結構的方法，本發明則提供一種操作簡單，不需要特殊設備的制備微/納米級球狀突起微結構的方法。殼聚糖是甲殼素的脫乙酸化廣物，是2_氨基_2_脫氧-13-D-匍萄糖單體以13(1-4)苷鍵連接的均聚物，在結構上與人體內存在的糖胺聚糖類似，具有優良的生物相容性和生物可降解性，是理想的細胞外基質材料，被廣泛應用于生物醫學、組織工程等領域。殼聚糖具有良好的成膜性，如Mi等通過干/濕相分離方法制備了非對稱殼聚糖膜，作為一種新型傷口敷料，可以控釋抗生素Fwu-Long Mi, Yu-Bey Wu, et al. Asymmetricchitosan membranes prepared by dry/wetphase separation a new type of wounddressing for controlled antibacterial release. Journal ofMembrane Science,2003,212(1/2) Tang RP等制備了雙醛淀粉交聯的殼聚糖膜，并研究了它的抗菌性Tang RP, DuYM, Fan LH. Dialdehyde starch-crosslinked chitosan films and theirantimicrobialeffects. Journal ofPolymer Science Part B, Polymer Physics, 2003,41 (9)。敷敏等制備了季銨化殼聚糖和聚苯乙烯共混膜，研究了膜的溫度、pH響應性和力學強度敖敏，王吉林等.季銨化殼聚糖-聚苯乙烯共混膜的制備及表征.化工科技，2011，19(3)。本發明利用殼聚糖的成膜性，在其表面構建微/納米級球狀突起微結構，應用于細胞培養研究，為能使細胞在回收過程中功能不受損傷，將殼聚糖以溫敏性物質聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)改性，制備微圖案化殼聚糖溫敏膜。PNIPAAm的化學結構中具有親水部分和疏水部分，其水溶液的最低臨界溫度(Lower critical solution temperature, LCST)為32°C。當溫度低于32°C時，PNIPAAm高分子鏈伸展，與水發生水合作用而溶于水；當溫度高于32°C時，PNIPAAm高分子鏈收縮，進行脫水。當溫度高于32°C時(常采用37°C，人的正常體溫)，材料表面表
現疏水性，可以使各種細胞在其上吸附、鋪展和分化，但當溫度低于32°C時，PNIPAAm構型轉變，表現親水性。低溫下，PNIPPAm的親水性不利于細胞在材料表面的吸附，并且溫度降低，PNIPAAm分子鏈有收縮狀態變為伸展狀態，削弱了細胞與材料之間的作用力，從而使細胞從材料表面自動脫附，避免了酶解法對細胞功能造成的損傷。Okano研究小組利用電子束輻照法將溫敏性聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)接枝到組織培養用聚苯乙烯表面，利用溫度改變調控細胞吸附/脫附，進行了一系列的研究工作Elloumi-Hannachi I，Yamato M，Okano T. Cell sheet engineering a unique nanotechnology for scaffold-free tissuereconstruction with clinical applications inregenerative medicine. Journal ofInternal Medicine, 2010, 267 :54_70，取得了有意義的實驗結果。綜上分析，本發明制備應用于細胞培養的微圖案化殼聚糖溫敏膜，通過微圖案調控細胞行為，通過溫度響應性，無損傷回收培養細胞，為構建具有特定結構和功能的組織或器官提供理論基礎和實驗依據。

發明內容
本發明擬解決的技術問題是提供一種微圖案化智能膜，該膜一方面通過微納米拓撲結構的建立，模擬細胞體內生長微環境；另一方面通過溫敏性PNIPAAm的修飾，使本發明的微圖案化智能膜的溫度響應范圍為25V _37°C，可實現細胞脫附智能化。本發明微納米拓撲智能膜可由以下方法制得(I)微圖案化聚苯乙烯模板的制備室溫下，將聚苯乙烯溶于四氫呋喃靜置過夜，置于培養皿中，真空脫泡制成成膜液；將丙三醇和正丙醇或丙三醇和1，2-丙二醇和按一定體積比充分混合，靜止脫泡成凝固浴；取成膜液快速滴于凝固浴表面，室溫下靜置成膜，得微圖案化聚苯乙烯模板。(2)微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備室溫下，將分子量為5. O X IO4,脫乙酰度為85 %的CS溶于I % HCl溶液中，待CS全部溶解后，加入EDC和TEMED，在攪拌均勻后，滴加AAc，磁力攪拌下反應，停止反應，將反應液過濾，去掉反應液中未溶解的雜質；攪拌下在過濾后的反應液中加入氫氧化鈉(NaOH)，中和反應液中殘留的AAc以及溶液中的HC1，反應液逐漸由酸性轉為中性或堿性，此時乙烯基殼聚糖單體(CSA)也逐漸析出；將析出的CSA重新過濾，以蒸餾水水洗三遍，當過濾液呈中性時用無水乙醇洗滌CSA，以溶解AAc自聚產生的自聚物，無水乙醇洗兩遍后，將過濾出的CSA抽真空干燥，得CSA單體粉末；將CSA和異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按一定質量比溶于1%的HCl溶液中，再加入過硫酸胺(APS)作引發劑，充分溶解后充氮氣30min，迅速加入適量的TEMED作促進劑，密封，室溫下反應，得到粘稠的溶液；將溶液傾倒于已經制備好的微圖案化聚苯乙烯模板上，放入質量分數為10% NaOH中浸泡，蒸餾水沖洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微圖案化溫敏殼聚糖膜。本發明的目的也在于提供一種微圖案化殼聚糖溫敏膜制備方法，制備方法包括以下步驟(I)微圖案化聚苯乙烯模板的制備室溫下，將聚苯乙烯溶于四氫呋喃靜置過夜，置于培養皿中，真空脫泡制成成膜 液；將丙三醇和正丙醇或丙三醇和1，2-丙二醇和按一定體積比充分混合，靜止脫泡成凝固浴；取成膜液快速滴于凝固浴表面，室溫下靜置成膜，得微圖案化聚苯乙烯模板。(2)微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備室溫下，將分子量為5. O X 104，脫乙酰度為85%的殼聚糖(CS)溶于I % HCl溶液中，待CS全部溶解后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在攪拌均勻后，滴加丙烯酸(AAc)，磁力攪拌下反應，停止反應，將反應液過濾，去掉反應液中未溶解的雜質；攪拌下在過濾后的反應液中加入氫氧化鈉(NaOH)，中和反應液中殘留的AAc以及溶液中的HC1，反應液逐漸由酸性轉為中性或堿性，此時乙烯基殼聚糖單體(CSA)也逐漸析出；將析出的CSA重新過濾，以蒸餾水水洗三遍，當過濾液呈中性時用無水乙醇洗滌CSA，以溶解AAc自聚產生的自聚物，無水乙醇洗兩遍后，將過濾出的CSA抽真空干燥，得CSA單體粉末；將CSA和異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按一定質量比溶于I %的HCl溶液中，再加入過硫酸胺(APS)作引發劑，充分溶解后充氮氣30min，迅速加入適量的TEMED作促進劑，密封，室溫下反應，得到粘稠的溶液；將溶液傾倒于已經制備好的微圖案化聚苯乙烯模板上，放入質量分數為10% NaOH中浸泡，蒸餾水沖洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微圖案化溫敏殼聚糖膜。所述步驟⑴中聚苯乙烯溶液濃度為O. I O. 5g/mL ；所述步驟(I)中丙三醇和正丙醇體積比為3 : I 10 : I ；所述步驟(I)中丙三醇和1，2_丙二醇體積比為3 : I 10 : I ；所述步驟⑵中殼聚糖溶液濃度為O. 05 O. lg/mL ；所述步驟⑵中加入丙烯酸量為10 20mL ；所述步驟(2)中CSA與NIPAAm質量比為I : I 5 : I所述步驟(2)中CSA與NIPAAm溶于I % HCl所得溶液的濃度為O. 05 O. lg/mL ；所述步驟(2)中反應時間為10 30h。有益效果本發明所設計的微圖案化殼聚糖溫敏膜具有良好的綜合性能，PNIPAAm在水中的LCST為32°C，本發明所制備的微圖案化殼聚糖溫敏膜由于聚合了 NIPAAm，因此在32°C附近發生親/疏水性的轉變，當環境溫度高于32°C時，膜表面表現較強疏水性，有利于細胞的吸附與增殖；當環境溫度低于32°C時，膜表面表現較強親水性，有利于細胞的自動脫附，從而實現細胞脫附智能化。另一方面，通過膜表面微圖案的構建，可以模擬細胞體內生長微環境，使細胞保持正確的接觸方式，為細胞提供特殊的生長和分化信號，使細胞能表達正確的基因并進行分化，從而形成具有特定功能的新生組織；可以從分子和細胞水平調控生物材料與細胞間的相互作用，從而引發特異性細胞反應，對于組織再生與修復存在潛在的應用前景，可促進組織工程向第三代生物材料——細胞和基因活化仿生材料的發展。由于所述的良好綜合特性，本發明微圖案化殼聚糖在組織工程支架材料、細胞培養基質材料等方面可以得到廣泛應用。本發明所述制備方法工藝方法簡單，反應易于控制，實驗條件溫和，不需要特殊設備，投資成本低，操作快捷，適用范圍廣、安全，便于工業化實施。
具體實施例方式以下給出本發明的具體實施例，但本發明不受實施例的限制。實施例I :(I)微圖案化聚苯乙烯模板的制備·室溫下，將聚苯乙烯溶于四氫呋喃，溶液濃度為O. lg/mL靜置過夜，置于培養皿中，真空脫泡5h制成成膜液；將丙三醇和正丙醇按體積比為3 I充分混合，靜止5h脫泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室溫下靜置成膜，得微圖案化聚苯乙烯模板。(2)微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備室溫下，將分子量為5. OX 104，脫乙酰度為85%的殼聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液濃度為O. 05g/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在攪拌均勻后，滴加15mL丙烯酸(AAc),磁力攪拌下反應30h,停止反應,將反應液過濾,去掉反應液中未溶解的雜質；攪拌下在過濾后的反應液中加入氫氧化鈉(NaOH)，中和反應液中殘留的AAc以及溶液中的HC1，反應液逐漸由酸性轉為中性或堿性，此時乙烯基殼聚糖單體(CSA)也逐漸析出；將析出的CSA重新過濾，以蒸餾水水洗三遍，當過濾液呈中性時用無水乙醇洗滌CSA，以溶解AAc自聚產生的自聚物，無水乙醇洗兩遍后，將過濾出的CSA抽真空干燥，得CSA單體粉末；將CSA和異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按質量比為I : 1，溶于1%的HCl溶液中，溶液濃度為O. 05g/mL，再加入O. 02g過硫酸胺(APS)作引發劑，充分溶解后充氮氣30min，迅速加入適量的TEMED作促進劑，密封，室溫下反應10h，得到粘稠的溶液；將溶液傾倒于已經制備好的微圖案化聚苯乙烯模板上，放入質量分數為10% NaOH中浸泡，蒸餾水沖洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微圖案化溫敏殼聚糖膜。實施例2 (I)微圖案化聚苯乙烯模板的制備室溫下，將聚苯乙烯溶于四氫呋喃，溶液濃度為O. 3g/mL靜置過夜，置于培養皿中，真空脫泡5h制成成膜液；將丙三醇和正丙醇按體積比為5 I充分混合，靜止5h脫泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室溫下靜置成膜，得微圖案化聚苯乙烯模板。(2)微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備室溫下，將分子量為5. OX 104，脫乙酰度為85%的殼聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液濃度為O. lg/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在攪拌均勻后，滴加IOmL丙烯酸(AAc),磁力攪拌下反應20h,停止反應,將反應液過濾,去掉反應液中未溶解的雜質；攪拌下在過濾后的反應液中加入氫氧化鈉(NaOH)，中和反應液中殘留的AAc以及溶液中的HC1，反應液逐漸由酸性轉為中性或堿性，此時乙烯基殼聚糖單體(CSA)也逐漸析出；將析出的CSA重新過濾，以蒸餾水水洗三遍，當過濾液呈中性時用無水乙醇洗滌CSA，以溶解AAc自聚產生的自聚物，無水乙醇洗兩遍后，將過濾出的CSA抽真空干燥，得CSA單體粉末；將CSA和異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按質量比為3 I，溶于I %的HCl溶液中，溶液濃度為O. lg/mL，再加入O. 02g過硫酸胺(APS)作引發劑，充分溶解后充氮氣30min，迅速加入適量的TEMED作促進劑，密封，室溫下反應15h，得到粘稠的溶液；將溶液傾倒于已經制備好的微圖案化聚苯乙烯模板上，放入質量分數為10% NaOH中浸泡，蒸餾水沖洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微圖案化溫敏殼聚糖膜。實施例3
(I)微圖案化聚苯乙烯模板的制備室溫下，將聚苯乙烯溶于四氫呋喃，溶液濃度為O. lg/mL靜置過夜，置于培養皿中，真空脫泡5h制成成膜液；將丙三醇和正丙醇按體積比為10 I充分混合，靜止5h脫泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室溫下靜置成膜，得微圖案化聚苯乙烯模板。(2)微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備室溫下，將分子量為5. OX 104，脫乙酰度為85%的殼聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液濃度為O. 05g/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在攪拌均勻后，滴加15mL丙烯酸(AAc),磁力攪拌下反應15h,停止反應,將反應液過濾,去掉反應液中未溶解的雜質；攪拌下在過濾后的反應液中加入氫氧化鈉(NaOH)，中和反應液中殘留的AAc以及溶液中的HC1，反應液逐漸由酸性轉為中性或堿性，此時乙烯基殼聚糖單體(CSA)也逐漸析出；將析出的CSA重新過濾，以蒸餾水水洗三遍，當過濾液呈中性時用無水乙醇洗滌CSA，以溶解AAc自聚產生的自聚物，無水乙醇洗兩遍后，將過濾出的CSA抽真空干燥，得CSA單體粉末；將CSA和異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按質量比為3 1，溶于1%的HCl溶液中，溶液濃度為O. 05g/mL，再加入O. 02g過硫酸胺(APS)作引發劑，充分溶解后充氮氣30min，迅速加入適量的TEMED作促進劑，密封，室溫下反應15h，得到粘稠的溶液；將溶液傾倒于已經制備好的微圖案化聚苯乙烯模板上，放入質量分數為10% NaOH中浸泡，蒸餾水沖洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微圖案化溫敏殼聚糖膜。實施例4 (I)微圖案化聚苯乙烯模板的制備室溫下，將聚苯乙烯溶于四氫呋喃，溶液濃度為O. lg/mL靜置過夜，置于培養皿中，真空脫泡5h制成成膜液；將丙三醇和正丙醇按體積比為10 O充分混合，靜止5h脫泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室溫下靜置成膜，得微圖案化聚苯乙烯模板。(2)微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備室溫下，將分子量為5. OX 104，脫乙酰度為85%的殼聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液濃度為O. lg/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在攪拌均勻后，滴加20mL丙烯酸(AAc),磁力攪拌下反應30h,停止反應,將反應液過濾,去掉反應液中未溶解的雜質；攪拌下在過濾后的反應液中加入氫氧化鈉(NaOH)，中和反應液中殘留的AAc以及溶液中的HC1，反應液逐漸由酸性轉為中性或堿性，此時乙烯基殼聚糖單體(CSA)也逐漸析出；將析出的CSA重新過濾，以蒸餾水 水洗三遍，當過濾液呈中性時用無水乙醇洗滌CSA，以溶解AAc自聚產生的自聚物，無水乙醇洗兩遍后，將過濾出的CSA抽真空干燥，得CSA單體粉末；將CSA和異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按質量比為5 I，溶于I %的HCl溶液中，溶液濃度為O. lg/mL，再加入O. 02g過硫酸胺(APS)作引發劑，充分溶解后充氮氣30min，迅速加入適量的TEMED作促進劑，密封，室溫下反應20h，得到粘稠的溶液；將溶液傾倒于已經制備好的微圖案化聚苯乙烯模板上，放入質量分數為10% NaOH中浸泡，蒸餾水沖洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微圖案化溫敏殼聚糖膜。實施例5 (I)微圖案化聚苯乙烯模板的制備室溫下，將聚苯乙烯溶于四氫呋喃，溶液濃度為O. lg/mL靜置過夜，置于培養皿中，真空脫泡5h制成成膜液；將丙三醇和I，2-丙二醇按體積比為3 I充分混合，靜止5h脫泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室溫下靜置成膜，得微圖案化聚苯乙烯模板。(2)微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備室溫下，將分子量為5. OX 104，脫乙酰度為85%的殼聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液濃度為O. 05g/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在攪拌均勻后，滴加15mL丙烯酸(AAc),磁力攪拌下反應30h,停止反應,將反應液過濾,去掉反應液中未溶解的雜質；攪拌下在過濾后的反應液中加入氫氧化鈉(NaOH)，中和反應液中殘留的AAc以及溶液中的HC1，反應液逐漸由酸性轉為中性或堿性，此時乙烯基殼聚糖單體(CSA)也逐漸析出；將析出的CSA重新過濾，以蒸餾水水洗三遍，當過濾液呈中性時用無水乙醇洗滌CSA，以溶解AAc自聚產生的自聚物，無水乙醇洗兩遍后，將過濾出的CSA抽真空干燥，得CSA單體粉末；將CSA和異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按質量比為I : 1，溶于1%的HCl溶液中，溶液濃度為O. 05g/mL，再加入O. 02g過硫酸胺(APS)作引發劑，充分溶解后充氮氣30min，迅速加入適量的TEMED作促進劑，密封，室溫下反應10h，得到粘稠的溶液；將溶液傾倒于已經制備好的微圖案化聚苯乙烯模板上，放入質量分數為10% NaOH中浸泡，蒸餾水沖洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微圖案化溫敏殼聚糖膜。實施例6 (I)微圖案化聚苯乙烯模板的制備室溫下，將聚苯乙烯溶于四氫呋喃，溶液濃度為O. 3g/mL靜置過夜，置于培養皿中，真空脫泡5h制成成膜液；將丙三醇和I，2-丙二醇按體積比為5 I充分混合，靜止5h脫泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室溫下靜置成膜，得微圖案化聚苯乙烯模板。(2)微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備
室溫下，將分子量為5. OX 104，脫乙酰度為85%的殼聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液濃度為O. lg/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在攪拌均勻后，滴加IOmL丙烯酸(AAc),磁力攪拌下反應20h,停止反應,將反應液過濾,去掉反應液中未溶解的雜質；攪拌下在過濾后的反應液中加入氫氧化鈉(NaOH)，中和反應液中殘留的AAc以及溶液中的HC1，反應液逐漸由酸性轉為中性或堿性，此時乙烯基殼聚糖單體(CSA)也逐漸析出；將析出的CSA重新過濾，以蒸餾水水洗三遍，當過濾液呈中性時用無水乙醇洗滌CSA，以溶解AAc自聚產生的自聚物，無水乙醇洗兩遍后，將過濾 出的CSA抽真空干燥，得CSA單體粉末；將CSA和異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按質量比為3 1，溶于1%的HCl溶液中，溶液濃度為O. lg/mL，再加入O. 02g過硫酸胺(APS)作引發劑，充分溶解后充氮氣30min，迅速加入適量的TEMED作促進劑，密封，室溫下反應15h，得到粘稠的溶液；將溶液傾倒于已經制備好的微圖案化聚苯乙烯模板上，放入質量分數為10% NaOH中浸泡，蒸餾水沖洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微圖案化溫敏殼聚糖膜。實施例7 (I)微圖案化聚苯乙烯模板的制備室溫下，將聚苯乙烯溶于四氫呋喃，溶液濃度為O. lg/mL靜置過夜，置于培養皿中，真空脫泡5h制成成膜液；將丙三醇和I，2-丙二醇按體積比為10 I充分混合，靜止5h脫泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室溫下靜置成膜，得微圖案化聚苯乙烯模板。(2)微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備室溫下，將分子量為5. OX 104，脫乙酰度為85%的殼聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液濃度為O. 05g/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC ·HCl和lml2%N，N，f ,Ni _四甲基乙二胺(TEMED)，在攪拌均勻后，滴加15mL丙烯酸(AAc),磁力攪拌下反應15h,停止反應,將反應液過濾,去掉反應液中未溶解的雜質；攪拌下在過濾后的反應液中加入氫氧化鈉(NaOH)，中和反應液中殘留的AAc以及溶液中的HC1，反應液逐漸由酸性轉為中性或堿性，此時乙烯基殼聚糖單體(CSA)也逐漸析出；將析出的CSA重新過濾，以蒸餾水水洗三遍，當過濾液呈中性時用無水乙醇洗滌CSA，以溶解AAc自聚產生的自聚物，無水乙醇洗兩遍后,將過濾出的CSA抽真空干燥，得CSA單體粉末；將CSA和異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按質量比為3 I，溶于I %的HCl溶液中，溶液濃度為0.05g/mL，再加入0.02g過硫酸胺(APS)作引發劑，充分溶解后充氮氣30min，迅速加入適量的TEMED作促進劑，密封，室溫下反應15h，得到粘稠的溶液；將溶液傾倒于已經制備好的微圖案化聚苯乙烯模板上，放入質量分數為10% NaOH中浸泡，蒸餾水沖洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微圖案化溫敏殼聚糖膜。實施例8 (I)微圖案化聚苯乙烯模板的制備室溫下，將聚苯乙烯溶于四氫呋喃，溶液濃度為O. lg/mL靜置過夜，置于培養皿中，真空脫泡5h制成成膜液；將丙三醇和1，2_丙二醇按體積比為10 O充分混合，靜止5h脫泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室溫下靜置成膜，得微圖案化聚苯乙烯模板。
(2)微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備室溫下，將分子量為5. OX 104，脫乙酰度為85%的殼聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液濃度為O. lg/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在攪拌均勻后，滴加20mL丙烯酸(AAc),磁力攪拌下反應30h,停止反應,將反應液過濾,去掉反應液中未溶解的雜質；攪拌下在過濾后的反應液中加入氫氧化鈉(NaOH)，中和反應液中殘留的AAc以及溶液中的HC1，反應液逐漸由酸性轉為中性或堿性，此時乙烯基殼聚糖單體(CSA)也逐漸析出；將析出的CSA重新過濾，以蒸餾水水洗三遍，當過濾液呈中性時用無水乙醇洗滌CSA，以溶解AAc自聚產生的自聚物，無水乙醇洗兩遍后，將過濾出的CSA抽真空干燥，得CSA單體粉末；將CSA和異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按質量比為5 I，溶于I %的HCl溶液中，溶液濃度為O. lg/mL，再加入O. 02g過硫酸胺(APS)作引發劑，充分溶解后充氮氣30min，迅速加入適量的TEMED作促進劑，密封，室溫下反應20h，得到粘稠的溶液；將溶液傾倒于已經制備好的微圖案化聚苯乙烯模板上，放入質量·分數為10% NaOH中浸泡，蒸餾水沖洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微圖案化溫敏殼聚糖膜。
權利要求
1.一種微圖案化殼聚糖溫敏膜，其特征在于所述微圖案化殼聚糖溫敏膜溫度響應范圍為25V 37°C，表面具有微米級球狀突起微結構，所述微圖案化殼聚糖溫敏膜可由下述方法制得 (1)微圖案化聚苯乙烯模板的制備 室溫下，將聚苯乙烯溶于四氫呋喃，溶液濃度為O. I O. 5g/mL靜置過夜,置于培養皿中，真空脫泡5h制成成膜液，將丙三醇和正丙醇按體積比為3 : I 10 : I充分混合，靜止5h脫泡成凝固浴，取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室溫下靜置成膜，得微圖案化聚苯乙烯模板； (2)微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備 室溫下，將分子量為5. OX 104，脫乙酰度為85%的殼聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液濃度為O. 05 O. lg/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在攪拌均勻后，滴加10 20mL丙烯酸(AAc)，磁力攪拌下反應10 30h，停止反應，將反應液過濾，去掉反應液中未溶解的雜質，攪拌下在過濾后的反應液中加入氫氧化鈉(NaOH)，中和反應液中殘留的AAc以及溶液中的HC1，反應液逐漸由酸性轉為中性或堿性，此時乙烯基殼聚糖單體(CSA)也逐漸析出，將析出的CSA重新過濾，以蒸餾水水洗三遍，當過濾液呈中性時用無水乙醇洗滌CSA，以溶解AAc自聚產生的自聚物，無水乙醇洗兩遍后，將過濾出的CSA抽真空干燥，得CSA單體粉末，將CSA和異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按質量比為I : I 5 : 1，溶于I %的HCl溶液中，溶液濃度為O. 05 O. lg/mL，再加入O. 02g過硫酸胺(APS)作引發劑，充分溶解后充氮氣30min，迅速加入適量的TEMED作促進劑，密封，室溫下反應10 30h，得到粘稠的溶液，將溶液傾倒于已經制備好的微圖案化聚苯乙烯模板上，放入質量分數為10%NaOH中浸泡，蒸餾水沖洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微圖案化溫敏殼聚糖膜。
2.根據權利要求I所述的微圖案化殼聚糖溫敏膜，其特征在于響應溫度為25V 37 V，表面具有微米級球狀突起微結構。
3.一種微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備方法，包括以下步驟 (1)微圖案化聚苯乙烯模板的制備 室溫下，將聚苯乙烯溶于四氫呋喃，溶液濃度為O. I O. 5g/mL靜置過夜,置于培養皿中，真空脫泡5h制成成膜液，將丙三醇和正丙醇按體積比為3 : I 10 : I充分混合，靜止5h脫泡成凝固浴，取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室溫下靜置成膜，得微圖案化聚苯乙烯模板； (2)微圖案化殼聚糖溫敏膜的制備 室溫下，將分子量為5. OX 104，脫乙酰度為85%的殼聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液濃度為O. 05 O. lg/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在攪拌均勻后，滴加10 20mL丙烯酸(AAc)，磁力攪拌下反應10 30h，停止反應，將反應液過濾，去掉反應液中未溶解的雜質，攪拌下在過濾后的反應液中加入氫氧化鈉(NaOH)，中和反應液中殘留的AAc以及溶液中的HC1，反應液逐漸由酸性轉為中性或堿性，此時乙烯基殼聚糖單體(CSA)也逐漸析出，將析出的CSA重新過濾，以蒸餾水水洗三遍，當過濾液呈中性時用無水乙醇洗滌CSA，以溶解AAc自聚產生的自聚物，無水乙醇洗兩遍后，將過濾出的CSA抽真空干燥，得CSA單體粉末，將CSA和異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按質量比為I : I 5 1，溶于I %的HCl溶液中，溶液濃度為O. 05 O. lg/mL，再加入O. 02g過硫酸胺(APS)作引發劑，充分溶解后充氮氣30min，迅速加入適量的TEMED作促進劑，密封，室溫下反應10 30h，得到粘稠的溶液，將溶液傾倒于已經制備好的微圖案化聚苯乙烯模板上，放入質量分數為10%NaOH中浸泡，蒸餾水沖洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微圖案化溫敏殼聚糖膜。
4.根據權利要求1，3所述一種微圖案化殼聚糖溫敏膜制備方法，其特征在于所述步驟(I)中聚苯乙烯溶液濃度為O. I O. 5g/mL。
5.根據權利要求1，3所述一種微圖案化殼聚糖溫敏膜制備方法，其特征在于所述步驟(I)中丙三醇和正丙醇體積比為3 I 10 : I。
6.根據權利要求1，3所述一種微圖案化殼聚糖溫敏膜制備方法，其特征在于所述步驟(1)中丙三醇和I,2-丙二醇體積比為3 : I 10 : I。
7.根據權利要求1，3所述一種微圖案化殼聚糖溫敏膜制備方法，其特征在于所述步驟(2)中殼聚糖溶液濃度為O.05 O. lg/mL。
8.根據權利要求1，3所述一種微圖案化殼聚糖溫敏膜制備方法，其特征在于所述步驟(2)中CSA與NIPAAm質量比為I : I 5 : I。
9.根據權利要求1，3所述一種微圖案化殼聚糖溫敏膜制備方法，其特征在于所述步驟(2)中CSA與NIPAAm溶于1% HCl所得溶液的濃度為O. 05 O. lg/mL。
全文摘要
本發明公開了一種微圖案化殼聚糖溫敏膜及其制備方法，屬于膜材料及技術領域，特別涉及一種細胞培養和脫附用的圖案化溫度敏感膜及其制備方法，該膜溫度響應范圍為25℃-37℃，可由下述方法制得將聚苯乙烯溶于四氫呋喃得成膜液，丙三醇和正丙醇或丙三醇和1，2-丙二醇按一定體積比充分混合，得凝固浴，取成膜液快速滴于凝固浴表面，得微圖案化聚苯乙烯模板；將殼聚糖與異丙基丙烯酰胺反應所得聚合物溶液流延于微圖案化聚苯乙烯模板表面，以四氫呋喃溶解聚苯乙烯模板，得到微圖案化殼聚糖溫敏膜。本發明所述制備方法工藝方法簡單，反應易于控制，實驗條件溫和，不需要特殊設備，投資成本低，操作快捷，適用范圍廣、安全，便于工業化實施。
文檔編號C08L51/02GK102942705SQ20121053283
公開日2013年2月27日 申請日期2012年12月11日 優先權日2012年12月11日
發明者賀曉凌, 陳碧洲, 林凱旋, 葛莉莉, 鄧中顯, 陳莉 申請人:天津工業大學