【
技術領域：
】本發明涉及產生對于酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5b(tracp-5b：別名、破骨細胞來源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶)特異性的單克隆抗體、該單克隆抗體的雜交瘤、使用該單克隆抗體的tracp-5b的檢測方法、以及在其中使用的試劑盒。本發明的單克隆抗體作為骨吸收的標志物，在骨疾病的醫學治療或臨床檢查的領域中極有效。
背景技術：
：血清中的酒石酸抵抗性酸性磷酸酶(tracp：tartrateresistantacidphosphataseec3.1.3.2)其大部分是破骨細胞來源的酸性磷酸酶，其測定作為評價破骨細胞的功能的指標有用，作為骨吸收標志物被感興趣(非專利文獻1)。一方面，血清中的酸性磷酸酶由聚丙烯酰胺凝膠電泳，從原點起分為0～5的6個條帶，在其中，第5是酒石酸抵抗性，從而被稱為band5酒石酸抵抗性酸性磷酸酶(tracp5)。這還由電泳分為與糖鏈的唾液酸鍵合多的5a和幾乎無唾液酸鍵合的5b。進而，5a是來自血小板或其他的酶而血中值不變動，與此相對，由于僅5b伴隨骨吸收而變動，5b被認為是破骨細胞來源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶的本體(專利文獻1)。再者，clinical在chemistry志(非專利文獻2)中也提議將破骨細胞來源的acp簡寫為tracp-5b。從而，在本說明書中也將破骨細胞來源、且表示成為骨吸收的指標的acp表示為tracp-5b，破骨細胞來源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶和酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5b作為同義表示為tracp-5b。作為表示破骨細胞的活性的酸性磷酸酶的指標求出tracp活性的以往的活性測定法在特異性、靈敏度、測定的復雜性及測定時間的方面有問題。一般而言，由活性測定法的tracp-5b的測定通過在酒石酸的存在下作為合成底物使用磷酸酯而對由酶反應發生的反應生成物(醇或苯酚類)進行比色定量求出酶活性。此時，酒石酸抑制前列腺來源酸性磷酸酶，通過將殘留的酸性磷酸酶活性用底物測定，將tracp活性看作tracp-5b活性而求出。但是，由于也測定了在待測樣品中存在的破骨細胞來源以外的紅細胞來源或血小板來源的酒石酸抵抗性酸性磷酸酶，在特異性的方面有問題。作為上述方法的改善法，將血清稀釋5倍的液于37℃溫育1小時的預處理之后，已知將其余的tracp活性在酒石酸存在下、作為底物使用p-硝基苯基磷酸(pnpp)而測定的方法(非專利文獻3及非專利文獻4)。此方法可回避紅細胞來源酸性磷酸酶的影響，但無法排除血小板來源酸性磷酸酶的影響。再者，作為更特異性的活性測定法，本發明人報告了利用tracp-5b和紅細胞或血小板來源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶活性對于氟的感受性有差異的tracp-5b測定法(專利文獻2)。但是，盡管無紅細胞及血小板來源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶的影響，但無法排除tracp-5a的影響，另外，通過從總酒石酸抵抗性酸性磷酸酶活性減去在氟存在下不被抑制的活性而求出tracp-5b活性，在精度的方面要求進一步的改良。再者，報告有通過在上述利用氟的方法中組合tracp-5a的抑制物質而使用，更特異性地測定tracp-5b活性的方法(專利文獻3)。但是，盡管比僅使用氟的方法更有特異性，但由于仍然由減法求出破骨細胞來源tracp-5b活性，同樣地在精度的方面留有問題。人tracp-5a和tracp-5b均是由325個氨基酸構成的人acp5基因(http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝acp5)產物(seqidno:1)來源的同種型，至第1～21的分泌信號序列被切除，形成了tracp-5a，與此相對，tracp-5b還有由組織蛋白酶k切除至第162～181的肽，第161半胱氨酸和第219半胱氨酸經ss鍵結合的約16kda和約23kda的亞基結構。作為由免疫學測定法的tracp-5b的測定方法，也已知使用多克隆抗體或單克隆抗體的免疫測定法(非專利文獻5、非專利文獻6、非專利文獻7、非專利文獻8、非專利文獻9及非專利文獻10)。這些方法由于測定了tracp-5a及tracp-5b的兩者，從而無法忽略tracp-5a的影響(非專利文獻11)。再者，報告有更特異性地測定tracp-5b的免疫學測定法(專利文獻4)。此方法對tracp-5b活性更具有特異性，但由于在測定中使用的抗體對于tracp-5b不是特異性的，也與tracp-5a反應，利用tracp-5a和tracp-5b的最適ph的差而在活性測定中算出測定值。因此，擔心末期腎疾病等的tracp-5a亢進的患者待測樣品的影響，另外，健康者待測樣品和骨吸收亢進的患者待測樣品的差異小，作為骨吸收標志物，靈敏度說不上充分(非專利文獻12)。本申請發明人從前也試過可識別tracp-5a和tracp-5b的單克隆抗體的制成(專利文獻6)。結果，盡管成功制成有一定的選擇性的抗體，但對于其選擇性有改良的余地，為了在臨床試驗中使用，有必要進一步的改良。現有技術文獻專利文獻專利文獻1：特表2002-510050號公報專利文獻2：特開平10-37198號公報專利文獻3：特開2001-231595號公報專利文獻4：wo99/50662號公報專利文獻5：特表2002-510050號公報專利文獻6：專利第4164804號公報非專利文獻非專利文獻1：骨代謝標志物,福永仁夫,中村利孝,松本俊夫編,medicalreview公司,1995非專利文獻2：clin.chem.47:1497.2001非專利文獻3：日大醫志.49:904-911.1990非專利文獻4：clin.chem.33:458-462.1987非專利文獻5：jclinendocrinolmetab.71:442-451.1990非專利文獻6：jboneminerres.13:683-687.1998非專利文獻7：immunollett.70:143-149.1999非專利文獻8：jboneminerres.14:464-469.1999非專利文獻9：clinchem.45:2150-2157.1999非專利文獻10：clinchem.46:1751-1754.2000非專利文獻11：calciftissueint,online14,sepember,2009非專利文獻12：clin.chim.acta301:147-158,2000技術實現要素：【發明要解決的技術課題】鑒于涉及的問題，本發明旨在提供對于作為骨吸收標志物的破骨細胞來源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶(tracp-5b)，再者特異性和親和性高的單克隆抗體、產生所述抗體的雜交瘤、使用該單克隆抗體的tracp-5b的檢測方法及在其中使用的試劑盒?！窘鉀Q課題的技術方案】為了解決識別含上述糖鏈修飾的差異的tracp-5同種型的課題，本申請發明人使用不是人來源的tracp-5b，在必須與人糖鏈修飾不同的蠶中在絹絲腺中產生的重組體人tracp-5b而取得特異性和親和性高的單克隆抗體，對于該抗體進行解析。即，本發明的構成如下[1]～[28]。[1]識別依賴于tracp-5b的立體結構的表位，由該線狀排列一級結構形成的什么樣的表位均不識別的單克隆抗體；[2]保藏號nitebp-01866的雜交瘤trk-126；[3]保藏號nitebp-01867的雜交瘤trk-127；[4]由[2]所述的雜交瘤產生的[1]所述的單克隆抗體；[5]由[3]所述的雜交瘤產生的[1]所述的單克隆抗體；[6]通過使用1個或多個[1]所述的單克隆抗體的免疫測定法檢測待測樣品中的tracp-5b的tracp-5b的檢測方法；[7]通過使用[4]及[5]所述的單克隆抗體的免疫測定法，檢測待測樣品中的tracp-5b的[6]所述的tracp-5b的檢測方法；[8]通過使用[4]所述的單克隆抗體及[5]所述的單克隆抗體的夾心測定elisa，檢測待測樣品中的tracp-5b的，[7]所述的檢測方法；[9]通過使用[4]所述的單克隆抗體及[5]所述的單克隆抗體的化學發光酶聯免疫測定法(cleia法)，檢測待測樣品中的tracp-5b的，[7]所述的檢測方法；[10]通過使用[4]所述的單克隆抗體及[5]所述的單克隆抗體的乳膠凝集法(比濁法)，檢測待測樣品中的tracp-5b的，[7]所述的檢測方法；[11]作為骨吸收的標志物在骨疾病的臨床檢查中使用的，[6]～[10]之任一項所述的檢測方法。[12]含1個或多個[1]所述的單克隆抗體作為構成成分的，用于在tracp-5b的檢測中使用的試劑盒；[13]含[4]所述的單克隆抗體及[5]所述的單克隆抗體作為構成成分的，用于在tracp-5b的檢測中使用的試劑盒；[14]用于在[8]所述的檢測方法中使用的試劑盒，其含下列作為構成成分：(1)固相支持體；(2)[4]所述的單克隆抗體及被標記的[5]所述的單克隆抗體、或者[5]所述的單克隆抗體及被標記的[4]所述的單克隆抗體；及(3)用于檢測標記的成分；[15]用于在[9]所述的檢測方法中使用的試劑盒，其含下列作為構成成分：(1)磁珠、(2)[4]所述的單克隆抗體及被標記的[5]所述的單克隆抗體、或者[5]所述的單克隆抗體及被標記的[4]所述的單克隆抗體；及(3)用于檢測標記的成分；[16]用于在[10]所述的檢測方法中使用的試劑盒，其含下列作為構成成分：(1)乳膠粒子；及(2)[4]所述的單克隆抗體及[5]所述的單克隆抗體。[17]在蠶絹絲腺中產生，以受蠶特異性的糖鏈修飾的重組體人tracp-5b作為抗原的抗體，識別依賴于tracp-5b的立體結構的表位，由該線狀排列的一級結構形成的什么樣的表位均不識別的單克隆抗體；[18]由[2]或[3]所述的雜交瘤產生的，[17]所述的抗體；[19]對于紅細胞、血小板、嗜中性粒細胞及前列腺來源的酸性磷酸酶基本上不顯示交叉反應性的，[17]或[18]之任一項所述的單克隆抗體。[20]使用[17]～[19]之任一項所述的單克隆抗體由免疫測定法檢測待測樣品中的tracp-5b的tracp-5b的檢測方法；[21]通過使用[17]～[19]之任一項所述的單克隆抗體的夾心測定elisa，檢測待測樣品中的tracp-5b的，[20]所述的檢測方法；[22]通過使用[17]～[19]之任一項所述的單克隆抗體的化學發光酶聯免疫測定法(cleia法)，檢測待測樣品中的tracp-5b的，[20]所述的檢測方法；[23]通過使用[17]～[19]之任一項所述的單克隆抗體的乳膠凝集法(比濁法)，檢測待測樣品中的tracp-5b的，[20]所述的檢測方法；[24]作為骨吸收的標志物在骨疾病的臨床檢查中使用的，[20]～[23]之任一項所述的檢測方法。[25]含[17]～[19]之任一項所述的單克隆抗體作為構成成分的，用于在tracp-5b的檢測中使用的試劑盒；[26]用于在[21]所述的檢測方法中使用的試劑盒，其含固相支持體、[17]～[19]之任一項所述的單克隆抗體、被標記的其他不同的針對tracp-5b的抗體、及用于檢測標記的成分作為構成成分；[27]用于在[22]所述的檢測方法中使用的試劑盒，其含磁珠、[17]～[19]之任一項所述的單克隆抗體、及被標記的其他不同的針對tracp-5b的抗體、及用于檢測標記的成分作為構成成分；[28]用于在[23]所述的檢測方法中使用的試劑盒，其含乳膠粒子及[17]～[19]之任一項所述的單克隆抗體作為構成成分。【發明效果】由本發明，能比以往方法更有效檢測定量生物體試樣中的tracp-5b，可輔助各種各樣的疾病的診斷?！靖綀D說明】【圖1】由elisa測定法的tracp-5b測定【圖2】在elisa測定法中的特異性檢驗【圖3】由cleia法的tracp-5b測定【圖4】在cleia法中的特異性檢驗【圖5】由乳膠凝集法的tracp-5b測定【圖6】acp5(tracp-5)氨基酸序列、及各種修飾預計部位【圖7】<比較例>trk-62和trk-49的表位定位【圖8】<比較例>trk-62和trk-49的表位部位【圖9】trk-126和trk-127的表位定位【圖10】使用trk-126和trk-127的tracp-5b的點印跡和蛋白印記【實施方式】本發明的單克隆抗體可通過以重組人tracp-5b作為免疫原使用而得到。在本說明書的之后記載的實施例中從基因重組蠶純化是培養細胞、大腸桿菌等，只要可表達人tracp-5b的宿主，就不限定。本發明的單克隆抗體，例如，由通過以純化人tracp-5b作為免疫原免疫動物，使該動物產生的產生抗人tracp-5b抗體的細胞和骨髓瘤瘍細胞融合而得到的雜交瘤產生。上述雜交瘤可由以下的方法得到。即，通過將如上所述得到的人tracp-5b使用弗氏的完全、不完全佐劑、氫氧化鋁佐劑、百日咳佐劑等的已經公知的一同混合，制作致敏用佐劑液，分數次向小鼠、大鼠等的動物每隔1～3周腹腔內皮下、或者尾靜脈施用而進行免疫。致敏抗原量設為1μg～100mg之間，但一般而言，優選50μg左右。在各種各樣的方法中知，免疫次數一般是2～7次。接下來，將來源于脾臟等的產生抗體的細胞和骨髓瘤瘍細胞(骨髓瘤細胞)等在試管內有增殖能力的細胞融合。產生抗體的細胞可從小鼠、裸鼠、大鼠等的脾臟等得到。作為上述融合法，可由已公知的kohler和milstein的定法(nature.256,495.1975)使用聚乙二醇(peg)融合。也可由仙臺病毒、電融合法進行融合。作為從上述融合的細胞選擇產生識別人tracp-5b的抗體的雜交瘤的方法，可如以下一樣進行。即，從上述融合的細胞從由有限稀釋法由在hat培養基及ht培養基中生存的細胞制作的集落選擇雜交瘤。在從放在96孔等的融合細胞得到的集落培養上清中含針對人tracp-5b的抗體時，可選擇由向將人tracp-5b固定化到板上的測定板上荷載上清，反應后與抗小鼠免疫球蛋白-hrp標記抗體等的第2標記抗體反應的elisa法，對于人tracp-5b的產生單克隆抗體的克隆。在標記抗體的標記物質中，除了hrp之外，可使用堿性磷酸酶等的酶、熒光物質、放射性物質等。另外，作為對照，同時進行由僅結合作為封閉劑的bsa的測定板的elisa而可進行人tracp-5b特異性抗體的篩選。即在人tracp-5b板上是陽性，可利用由bsa的elisa進行選擇陰性的克隆。作為本發明的雜交瘤，產生識別人tracp-5b的單克隆抗體的雜交瘤之中，優選產生特別與人tracp-5b反應、并且不與紅細胞、血小板、嗜中性粒細胞、前列腺來源的酸性磷酸酶交叉反應的單克隆抗體的。特別是，為了作為本發明的單克隆抗體，在臨床檢查中使用時，其檢查結果更明確地反映骨吸收，優選在檢測系統中不與人tracp-5a結合、僅識別結合tracp-5b的單克隆抗體。其中“與人tracp-5b結合，不與人tracp-5a結合”表示，在現有
技術領域：
中的檢測系統(例如，夾心測定elisa)中，相比人tracp-5a，對于人tracp-5b在檢測系統中，顯示約100倍以上、更優選為約500倍以上的反應性。上述雜交瘤可用通常在細胞培養中使用的培養基、例如α-mem、rpmi1640、asf、s-clone等培養，從該培養上清回收單克隆抗體。另外，將雜交瘤所來源的動物、裸鼠預先用姥鮫烷處理，通過向該動物腹腔內注射細胞使腹水貯留，也可從該腹水回收單克隆抗體。作為從上述的上清、腹水回收單克隆抗體的方法，可使用通常的方法。例如，可舉出由硫酸銨、硫酸鈉等的鹽析法或層析、離子交換層析、由蛋白a、蛋白g等的親和層析等?？捎墒褂帽景l明的單克隆抗體的免疫測定法高靈敏度并且特異性檢測待測樣品中的tracp-5b。作為成為對象的待測樣品，可舉出從待測樣品采集、單離的血液、血清、血漿、骨等的組織等。作為由使用本發明的單克隆抗體的免疫測定法的檢測方法，可舉出夾心測定elisa法、化學發光酶聯免疫測定法(cleia法)、乳膠凝集法(比濁法)、組織免疫染色法等。作為利用tracp-5b的酶活性的測定的免疫測定法，例如，可舉出使待測樣品、例如血清中的tracp-5b與本發明的單克隆抗體結合，對于結合的tracp-5b與tracp-5b的酶底物、例如p-硝基苯基磷酸或其鹽進行酶反應，可通過測定其酶活性來免疫測定待測樣品中的tracp-5b的方法。在該方法中，具體而言，tracp-5b可如以下一樣測定。首先，向吸附到固相支持體上的本發明的單克隆抗體加要測定的待測樣品，使待測樣品中的tracp-5b和抗體抗原抗體反應而使tracp-5b與抗體結合。接下來，將該固相支持體用清洗液清洗，除去未吸附到抗體上的待測樣品來源的成分之后，向反應系統加tracp-5b的酶底物、例如p-硝基苯基磷酸或其鹽，使與抗體結合的tracp-5b和底物反應。用反應停止液停止酶反應之后，由反應生成的苯酚類、例如，p-硝基苯酚，通常在390nm～450nm、優選為400～430nm的波長測定吸光度。由于其吸光度的大小反映tracp-5b酶活性，從而可從該值測定待測樣品中的tracp-5b。在本發明中，如從上述的測定法明了，抗體優選與固相支持體結合而使用，作為固相支持體，通常，使用在elisa法等的固相免疫測定法中使用的固相支持體，但不特別限定。例如，作為固相支持體的材料，可舉出，聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、尼龍、甲基丙烯酸樹脂等。作為固相支持體的形狀，可舉出板、(磁)珠、乳膠粒子等。為了調制吸附到固相支持體上的抗體，利用直接或間接物理結合或化學結合、親和性而使對于tracp-5b的抗體結合于固相支持體。致敏抗體量多是1ng～100mg/ml的范圍。作為固相支持體，使用(磁)珠進行化學發光酶聯免疫測定法(cleia法)時，可使用在通常的化學發光酶聯免疫測定法(cleia法)中使用的試劑、試劑盒等。當使用作為固相支持體的乳膠粒子進行乳膠凝集法時，可使用在通常的乳膠凝集法中使用的試劑、試劑盒等。實施本發明的測定方法之時是用于對tracp-5b進行免疫測定的試劑盒，使用含(i)固相支持體、(ii)本發明抗體的試劑盒進行。在此試劑盒中，關于(i)固相支持體、(ii)本發明抗體，分別制作固相支持體和抗體溶液，在測定tracp-5b時，可使抗體吸附到固相支持體上，也可預先在將抗體吸附到固相支持體上的狀態下提供。在此試劑盒中，使待測樣品中的tracp-5b與抗體結合之后，為了除去未吸附到固相支持體上的成分，優選含清洗液。作為清洗液，例如，可使用含表面活性劑的tris緩沖液。再者，在本發明的試劑盒中，根據需要，也可加待測樣品稀釋液而含有。作為待測樣品稀釋液，例如，可使用tris等的緩沖液。在該緩沖液中，也可根據需要，加edta·2na等的鰲合劑、食鹽等的無機鹽。在本發明中，也可由使用本發明的單克隆抗體的夾心測定elisa法測定tracp-5b。此時，作為單克隆抗體，除了本發明抗體以外，也可使用其他對于tracp-5b的不同的抗體實施。由夾心測定來測定tracp-5b的方法的具體例如下所述。通過首先，作為第一抗體，將本發明抗體吸附到固相支持體、例如，板上，待測樣品、例如，與血清中的tracp-5b反應，清洗固相支持體，接下來，使吸附的tracp-5b和生物素化的第2抗體、例如生物素化的不同的針對tracp-5b的單克隆抗體或多克隆抗體反應，與過氧化物酶標記鏈霉親和素反應之后，過氧化物酶反應、接下來，進行顯色反應，可檢測tracp-5b。另外，通過使用將第2抗體直接由過氧化物酶或堿性磷酸酶等酶標記，可進行同樣的測定。另外，與第2標記抗體結合的物質隨測定方法而也可不限于酶，放射線同位元素、熒光物質、磁性物質、膠體等。在本發明中，當進行使用本發明抗體的夾心測定elisa之時，可使用夾心測定elisa用的試劑盒實施。在用夾心測定elisa法實施本發明的測定方法之時，例如，作為用于對tracp-5b進行免疫測定的試劑盒，通過使用含(i)固相支持體、(ii)本發明抗體、(iii)被標記的，不同的對于tracp-5b的抗體、及(iv)用于檢測標記的成分的試劑盒，也可測定tracp-5b。用于檢測標記的成分是用于測定抗體被標記的的成分，在標記是生物素時，是含過氧化物酶標記鏈霉親和素、四甲基聯苯胺的過氧化物酶底物、及過氧化氫的試劑，在標記是堿性磷酸酶時，是含p-硝基苯基磷酸的試劑。在此試劑盒中，根據需要，也可含清洗液。在本發明中，當使用此試劑盒之時，使待測樣品中的tracp-5b與抗體結合之后，為了除去未吸附到固相支持體上的成分，優選含清洗液。作為清洗液，例如，可使用含表面活性劑的tris緩沖液。再者，在本發明的試劑盒中，也可根據需要，加待測樣品稀釋液而含有。作為待測樣品稀釋液，例如，可使用tris等的緩沖液。在該緩沖液中，也可根據需要，加edta·2na等的鰲合劑、食鹽等的無機鹽。再者，在本發明中，也可將待測樣品中的tracp-5b的存在由利用本發明的單克隆抗體的組織免疫染色法檢測。即，例如，通過從人的破骨細胞組織等由通常的方法調制例如冷凍切片，使本發明的單克隆抗體與其反應，接下來，例如，與用過氧化物酶或堿性磷酸酶等的酶標記的第二抗體反應，接下來顯色，可特異性檢測tracp-5b的存在。由這樣的組織免疫染色法的檢測可使用含(i)本發明的單克隆抗體、(ii)被標記的第二抗體及(iii)顯色試劑作為構成成分的試劑盒實施。作為被標記的第二抗體，例如，可舉出用過氧化物酶或堿性磷酸酶等的酶標記的，動物來源的抗igg抗血清、抗igg多克隆抗體等，作為顯色試劑，使用用于使標記中使用的酶顯色的通常使用的顯色底物等的試劑。在本發明中，進行使用本發明抗體的化學發光酶聯免疫測定法(cleia法)或乳膠凝集法時，可使用公知的化學發光酶聯免疫測定法(cleia法)用試劑盒或乳膠凝集法用的試劑盒實施。表位(epitope)是指抗體識別的抗原的一部分。完全長tracp-5本身由325個氨基酸形成，但抗體并不識別其整體，僅識別抗原的比較小的一部分而結合。為了作為表位發揮功能，有必要是至少10個氨基酸殘基、更優選為5個氨基酸殘基的長度。此抗體結合部分也稱為“表位”或“抗原決定基(antigenicdeterminant)”。識別“表位”是指在含該表位的抗原保持立體結構、或者立體結構解開的任何的條件下，可結合對應于該表位部分的抗體。另外，不識別“表位”是指，在抗原保持立體結構的，及立體結構解開的任何的條件下，對應的抗體也基本上不結合。在本發明中的立體結構是指表示氨基酸序列的一級結構、含其折疊而形成的螺旋或β-片等的二級結構、具有二級結構的多肽進一步折疊而成的三級結構、及在具有三級結構的多個多肽間締合而形成空間配置而成的四級結構，優選是指在認為該抗原通常存在的生物體內環境或與其類似的環境中可取該抗原的結構?！緦嵤├坑梢韵碌膶嵤├?、比較例及參考例還詳細地說明本發明，但本發明不限于這些實施例。【實施例1】(1)單克隆抗體制作用抗原的選擇和準備作為用于制成抗人tracp單克隆抗體的抗原，準備在基因重組蠶絹絲腺中產生的重組體tracp-5b。重組體tracp-5b的調制法用專利5177431號公報中記載的方法制作。從含人重組體tracp-5b的基因重組蠶摘出絹絲腺，得到300g的絹絲腺。使絹絲腺懸浮于緩沖液(50mmtris-hcl,ph7.5)5600ml中，由轉子定子型均漿器均化。其后10,000rpm,離心20分鐘分離，將該上清應用于cm-sepharose柱(gehealthcare)，將吸附的蛋白質用含nacl的上述tris緩沖液的直線濃度梯度(0-1.0mnacl)溶出。酒石酸抗性酸性磷酸酶活性使用底物對硝基苯基磷酸進行測定，合并活性高的部分。對其進行濃縮后，在含0.7mnacl的20mmtris緩沖液ph7.2中透析，應用于superdexs200柱(gehealthcare)，測定同樣地溶出的級分的酒石酸抗性酸性磷酸酶活性，合并活性部分。將其用20mmtris緩沖液ph7.2稀釋2倍，應用于hitrapheparinhp柱(5ml)(gehealthcare)，將吸附的蛋白質經含nacl的上述20mmtris緩沖液ph7.2的直線濃度梯度(0.35m-1mnacl)鹽濃度梯度溶出。通過將酒石酸抗性酸性磷酸酶高活性級分合并、濃縮，得到1.2mg純化人重組體tracp-5b。再者，蛋白量由a280確認，純度則通過進行sds-page而由銀染色的結果，在分子量35,000附近有單條帶確認。將變成單一條帶的酶作為純化tracp-5b而作為免疫抗原。(2)免疫將純化人重組tracp-5b用20mmtris-hcl,ph7.2稀釋至成1mg/ml，取50μg(50μl)而與弗氏完全佐劑(wako)50μl充分混合至乳化。將調制的懸浮液在二乙基醚麻醉下腹腔內施用于balb/c6周齡雌小鼠(日本clea)。在2周后使同量的tracp-5b(50μg/ml)與弗氏不完全佐劑(wako)混合而由與弗氏完全佐劑之時完全同樣的操作制作為乳化懸浮液，各自向小鼠致敏。在往后2周后進行同樣的操作，在第4次，作為最終免疫，將tracp-5b50μg/ml用20mmtris-hcl,ph7.2調制，由小鼠尾靜脈注射施用。(3)雜交瘤的確立在最終免疫起3天后，將從由tracp-5b致敏結束的小鼠在二乙基醚麻醉下外科的摘出的脾臟無菌分散而調制脾臟細胞。融合根據kohler和milstein的方法(nature.256,495.1975)進行，使用聚乙二醇(peg4000)(merk)而融合脾細胞和骨髓瘤細胞p3-x63-ag8-u1(p3u1)。其融合比率是相對于脾臟細胞數8×107個而骨髓瘤細胞p3-x63-ag8-u1(p3u1)2×107個，是4:1。融合細胞分散到10％fcs(invitrogen)α-mem(gibco)hat(cosmobio)培養基而分注到48孔微滴定培養板(住友bakelite)中，用37℃、5％co2條件培養。在以下的探討中使用的雜交瘤數是3000。(4)篩選在約2周后確認集落的生長而實施篩選。接下來敘述篩選的實施法。為了制作篩選用板，將在上述(1)中純化的tracp-5b在20mmtris-hcl,ph7.2緩沖液中溶解，分注到96孔板(nunc)中至成0.5μg/100μl/孔。在將板于4℃2晚靜置之后用含0.05％tween-20的tris緩沖液清洗3次，為了抑制非特異性反應，分注200μl的1.5％bsa溶液，再于4℃1晚靜置。在將完成的板用含0.05％tween20的tris緩沖液清洗3次之后使與培養上清100μl反應，在再進行清洗之后加作為第2抗體的hrp標記抗小鼠免疫球蛋白抗體(invitrogen)而使反應。在清洗后加100μl作為hrp的顯色底物的3,3’5,5’-四甲基聯苯胺(tmb)(kainos)而顯色一定時間后，還添加100μl的1n硫酸作為停止液在，測定波長450nm處測定吸光度。如上所述成為陽性的克隆(29克隆)由有限稀釋法再克隆，再次核對上清。(5)抗體的確認由elisa確認與純化tracp-5b的反應性，則在上述29克隆中克隆trk-126、trk-127中親和性有差異，但與板高靈敏度反應。結果，選擇克隆trk-126、trk-127作為識別tracp-5b的克隆。將得到的抗體用單克隆抗體分型試劑盒(roche)檢驗的結果，是以下的如表1一樣的結果?！颈?】克隆的特性克隆名類輕鏈trk-126igg1κtrk-127igg1κ上述雜交瘤trk-126及trk-127于2014年6月6日，以niteabp-01866(trk-126)及niteabp-01867(trk-127)被獨立行政法人制品評價技術基盤機構內專利微生物保藏中心接收，于2014年6月23日生存確認后，被賦予保藏號nitebp-01866(trk-126)及nitebp-01867(trk-127)(保藏證2014年6月30日發行)。接下來，記載特別指定保藏的內容。[1]保藏機關的名稱－地址名稱：獨立行政法人制品評價技術基盤機構專利微生物保藏中心地址：日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8(郵政編碼292-0818)[2]保藏日：2014年6月6日[3]保藏號nitebp-01866(雜交瘤trk-126)nitebp-01867(雜交瘤trk-127)(6)單克隆抗體的制作及純化向姥鮫烷(sigma-aldrich)0.5ml施用后2周的，10周齡、balb/c雌小鼠(日本clea)腹腔內施用在上述(5)中得到的雜交瘤trk-126、trk-1271×107細胞個，在約2周后在二乙基醚麻醉下外科采集貯留在小鼠腹腔內的腹水。由在上述(4)的篩選中進行的elisa法，以腹水作為樣品階段稀釋而進行確認，則含高濃度的單克隆抗體。將此腹水用硫酸銨40％處理，在pbs中透析之后，由蛋白g柱(gehealthcare)純化，由sds-page確認。則trk-126、trk-127均在非還原時確認分子量約150,000的單一的條帶，在巰基乙醇還原時確認了分子量約50,000的條帶和25,000這2條條帶。純化的抗體trk-126、trk-127均是小鼠每1只約10mg或其以上，對于工業上利用是充分的量。(7)由夾心elisa測定法的tracp-5b測定和特異性檢驗使用單克隆抗體trk-126,trk-127而制作由夾心elisa測定法的tracp-5b測定試劑。另外，為了研究本測定法的特異性使用native-tracp-5b、tracp-5a進行下述的實驗，與使用公知的單克隆抗體trk-62及trk-49的tracp-5b夾心elisa測定法比較(日本專利第4164804號公報)。測定方法如下。將利用proteing純化的單克隆抗體trk-126分注在固相板(nunc)上至成2μg/孔，于4℃靜置2天。用含0.05％tween20的20mmtris(ph7.5)清洗液清洗3次之后，加200μl而1.5％bsatris(ph7.5)于4℃封閉一晚。標記抗體用與前述同樣的方法將純化的單克隆抗體trk-127使用hrplabelingkit-nh2(同仁化學)，alp標記。其中，標記抗體濃度設為1μg/μl。使用這樣制作的板和標記抗體，由夾心elisa測定法評價tracp-5b測定的有用性。具體而言，向抗體結合板上加算出含有tracp-5b的人血清來源的tracp-5b試樣50μl。于室溫反應1小時，反應結束后，用前出的清洗液清洗3次而加100μl的辣根過氧化物酶(hrp)標記的第二抗體。再者于室溫反應1小時，反應結束后，用前出的清洗液清洗3次，加100μl的100μl的3,3’5,5’-四甲基聯苯胺(tmb)(kainos)而顯色一定時間后，還添加100μl的1n硫酸作為停止液，在測定波長450nm處測定吸光度。測定的結果，確認在使用在本發明中得到的抗體的測定系統中吸光度以tracp-5b的濃度依賴性地升高(圖1)。同樣地，向抗體結合板上加僅人血清來源的tracp-5b終濃度在25ng/ml的試樣、或者使tracp-5b及tracp-5a各自達終濃度25ng/ml的試樣50μl。于室溫反應1小時，反應結束后，用前出的清洗液清洗3次而加100μl的辣根過氧化物酶(hrp)標記的第二抗體。再于室溫反應1小時，反應結束后，用前出的清洗液清洗3次，加100μl的100μl的3,3’5,5’-四甲基聯苯胺(tmb)(kainos)而顯色一定時間后，還添加100μl的1n硫酸作為停止液，在測定波長450nm處測定吸光度。測定的結果確認，公知的tracp-5b夾心elisa測定法(專利第416804號公報)是native-tracp-5b、tracp-5a均顯示反應性，但由trk-126、trk-127的夾心elisa測定法是tracp-5b特異性地顯示反應性(圖2)。(8)由化學發光酶聯免疫測定法(cleia法)的tracp-5b測定使用單克隆抗體trk-126,trk-127而制作使用磁珠的tracp-5b測定試劑。另外，為了研究本測定法的特異性，將在公知的方法(專利第416804號公報)中使用的抗體制作同樣的測定試劑，對對于native-tracp-5b、tracp-5a的反應性進行比較。測定方法如下。將5mg的trk-126或trk-62由dynabeadsantibodycouplingkit(invitrogen)致敏磁珠。作為標記抗體，將200μg的trk-127或trk-49使用alkalinephosphataselabelingkit-nh2(同仁化學)，alp標記。其中，標記抗體濃度設為1μg/μl。使用上述制成的磁珠和標記抗體，由化學發光酶聯免疫測定法(cleia法)評價tracp-5b測定的有用性。具體而言，向2μg的抗體致敏磁珠加算出含有tracp-5b的人血清試樣30μl，約攪拌20分鐘。一邊由磁鐵蓄積磁珠，一邊用含0.05％tween20的20mmtris(ph7.5)清洗液清洗3次之后，加包含含有1μg的alp標記抗體的0.05％tween20的20mmtris(ph7.5)而約攪拌20分鐘。一邊由磁鐵蓄積磁珠，一邊用含0.05％tween20的20mmtris(ph7.5)清洗液清洗3次之后，加100μl作為alp的基質的amppd(和光純藥)。于室溫約攪拌5分鐘，測定在波長477nm處具有發光極大的光的發光量。測定的結果，確認在使用在本發明中得到的抗體的測定系統中發光計數以tracp-5b的濃度依賴性地升高(圖3)。同樣地，向2μg的抗體致敏磁珠加僅人血清來源的tracp-5b達終濃度25ng/ml的試樣、或者tracp-5b及tracp-5a各自達終濃度25ng/ml的試樣30μl，約攪拌20分鐘。一邊由磁鐵蓄積磁珠，一邊用含0.05％tween20的20mmtris(ph7.5)清洗液清洗3次之后，加包含含有1μg的alp標記抗體的0.05％tween20的20mmtris(ph7.5)而約攪拌20分鐘。一邊由磁鐵蓄積磁珠，一邊用含0.05％tween20的20mmtris(ph7.5)清洗液清洗3次之后，加100μl作為alp的基質的amppd(和光純藥)。于室溫約攪拌5分鐘，測定在波長477nm處具有發光極大的光的發光量。測定的結果確認，公知的測定法(日本專利注冊編號416804)是native-tracp-5b、tracp-5a均顯示反應性，但由trk-126、trk-127的夾心elisa測定法是tracp-5b特異性地顯示反應性(圖4)。(9)由乳膠凝集法的tracp-5b測定使用單克隆抗體trk-126、trk-127，向乳膠致敏2種單克隆抗體，制作乳膠試劑。乳膠試劑制作如下述一樣進行。將1％乳膠懸浮液2ml和0.1mg/mltrk-126及trk-127抗體溶液2ml混合，約1小時攪拌。離心后，使沉淀懸浮于1％bsa溶液中，再次攪拌約1小時。再離心后，將沉淀在pbs溶液中懸浮，得到乳膠試劑。使用上述調制的乳膠試劑而確認由乳膠免疫凝集測定(latex測定)能定量人血清中的tracp-5b。具體而言，使算出含有tracp-5b的人血清試樣35μl與含tris緩沖液的第一試劑100μl、含制作的乳膠試劑的第二試劑100μl反應，使用日立7180型自動分析裝置，在主波長570nm、副波長800nm處，在19-34測光點間(相當于第二試劑添加后約1分鐘后～5分鐘后)，測定由2端點法的吸光度變化量。作為結果，如圖5所示，確認了tracp-5b濃度依賴性的吸光度升高?！颈容^例1】trk-62、trk-49的表位的鑒定(1)肽載玻片的制成(replitope)從ncbi數據庫取得的acp5(tracp-5)氨基酸序列(seqidno:1)及文獻中報告的各種修飾預計部位如圖6所示。對于20～325a.a，用jpt公司肽載玻片服務(replitope,船越http://www.funakoshi.co.jp/news/071201spdf/071201s_p24.pdf)，分為每10a.a.的肽而依賴斑(表2；seqidno:2～61)?！颈?】制成的肽組(2)由replitope的trk-62及trk-49的表位解析將制成的肽載玻片使用trk-62,trk-49進行表位定位，由顯色法解析(圖7)。具體而言，對上述肽載玻片使用superblock(pierce)而于室溫進行60分鐘封閉處理。其后，作為第一抗體，將trk-62或trk-49以1μg/ml的濃度，于室溫反應60分鐘。用pbs-t清洗3次后，將兔抗小鼠igg-hrp(dako)以0.5μg/ml的濃度，于室溫反應60分鐘。再次用pbs-t清洗3次后，加作為hrp的顯色底物的3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(tmb)(kainos)。一定時間的溫育之后，由顯微鏡觀察確認斑的顯色的程度。解析的結果，判斷在trk-62、trk-49均特異性地存在于tracp-5b中的糖鏈的結合位置附近有表位，由此認為，提高對tracp-5b的反應特異性(圖8)?！緦嵤├?】trk-126、trk-127的表位解析(1)由replitope的trk-126及trk-127的表位解析根據以上的結果，由發光法進行trk-126及trk-127的表位解析。具體而言，將上述肽載玻片使用superblock(pierce)于室溫進行60分鐘封閉處理。其后，作為第一抗體，將trk-126或trk-127以1μg/ml的濃度，于室溫反應60分鐘。用pbs-t清洗3次后，添加amershameclprime(gehealthcare)附屬的第二抗體，于室溫反應60分鐘。再次用pbs-t清洗3次后，加試劑盒附屬的檢測試劑。一定時間的溫育之后，由imagequantlas4000(gehealthcare)確認斑的發光的程度。解析的結果，trk-126及trk-127均不顯示與各序列肽的反應性(圖9)。從而接下來，使用這2種抗體進行點印跡解析及蛋白印跡解析。(2)由蛋白印跡法、點印跡法的反應性確認(2-1)由點印跡法的反應性確認將純化的tracp-5b滴到1.0μgpvdf膜(millipore)，進行1小時封閉。接下來，在各自轉印trk-126及trk-127(以5μg/ml濃度含抗體的pbs-t)的膜上反應1小時。反應后，將膜用pbs-t清洗，作為第二抗體，使hrp標記抗小鼠免疫球蛋白抗體(zymed)各自反應30分鐘。用pbs-t清洗后，用膜用tmb溶液(和光純藥工業)進行檢測(圖10)。(2-2)由蛋白印跡法的反應性確認將1.0μg、2.0μg的純化的tracp-5b在非還原下進行sds-page。其后，轉印到pvdf膜(millipore)，進行1小時封閉。其后，用(2-1)中記載的同樣的方法進行反應、檢測(圖11)。解析的結果，trk-126及trk-127均確認了由點印跡法的與tracp-5b的反應性，而在蛋白印跡法中均檢測不到。從這些的結果認為，trk-126及trk-127是識別tracp-5b的天然的立體結構，識別其表位不是由線狀排列的一級結構形成的表位，依賴于tracp-5b的立體結構的表位的抗體。雖然是一級結構上相同性高的tracp-5a和tracp-5b，但其立體結構大不同。從而認為，識別依賴于tracp-5b的立體結構的表位的抗體與公知的測定法(日本專利注冊編號416804)記載的trk-62、trk-49(其表位的一級結構在tracp-5a上也存在)相比，tracp-5b特異性結合性增加?！竟I實用性】以上詳細地說明了在本發明的免疫測定法中，對于測定對象目的物質(tracp-5b)，通過組合使用反應性及選擇性高的抗體而除去反應系中的競爭結合物質的影響，可特異性精密測定目的物質。?序列表<110>nittobosekicoltd<120>對tracp-5b（酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5b）具有特異性的蛋白定量法<130>w7323-00<150>jp2014-168934<151>2014-08-22<160>61<170>patentinversion3.1<210>1<211>325<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>1metaspmettrpthralaleuleuileleuglnalaleuleuleupro151015serleualaaspglyalathrproalaleuargphevalalavalgly202530asptrpglyglyvalproasnalaprophehisthralaargglumet354045alaasnalalysgluilealaargthrvalglnileleuglyalaasp505560pheileleuserleuglyaspasnphetyrphethrglyvalglnasp65707580ileasnasplysargpheglngluthrphegluaspvalpheserasp859095argserleuarglysvalprotrptyrvalleualaglyasnhisasp100105110hisleuglyasnvalseralaglnilealatyrserlysileserlys115120125argtrpasnpheproserprophetyrargleuhisphelysilepro130135140glnthrasnvalservalalailephemetleuaspthrvalthrleu145150155160cysglyasnseraspasppheleuserglnglnprogluargproarg165170175aspvallysleualaargthrglnleusertrpleulyslysglnleu180185190alaalaalaarggluasptyrvalleuvalalaglyhistyrproval195200205trpserilealagluhisglyprothrhiscysleuvallysglnleu210215220argproleuleualathrtyrglyvalthralatyrleucysglyhis225230235240asphisasnleuglntyrleuglnaspgluasnglyvalglytyrval245250255leuserglyalaglyasnphemetaspproserlysarghisglnarg260265270lysvalproasnglytyrleuargphehistyrglythrgluaspser275280285leuglyglyphealatyrvalgluileserserlysglumetthrval290295300thrtyrileglualaserglylysserleuphelysthrargleupro305310315320argargalaargpro325<210>2<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>2aspglyalathrproalaleuargpheval1510<210>3<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>3alaleuargphevalalavalglyasptrp1510<210>4<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>4alavalglyasptrpglyglyvalproasn1510<210>5<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>5glyglyvalproasnalaprophehisthr1510<210>6<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>6alaprophehisthralaargglumetala1510<210>7<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>7alaargglumetalaasnalalysgluile1510<210>8<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>8asnalalysgluilealaargthrvalgln1510<210>9<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>9alaargthrvalglnileleuglyalaasp1510<210>10<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>10ileleuglyalaasppheileleuserleu1510<210>11<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>11pheileleuserleuglyaspasnphetyr1510<210>12<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>12glyaspasnphetyrphethrglyvalgln1510<210>13<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>13phethrglyvalglnaspileasnasplys1510<210>14<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>14aspileasnasplysargpheglngluthr1510<210>15<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>15argpheglngluthrphegluaspvalphe1510<210>16<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>16phegluaspvalpheseraspargserleu1510<210>17<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>17seraspargserleuarglysvalprotrp1510<210>18<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>18arglysvalprotrptyrvalleualagly1510<210>19<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>19tyrvalleualaglyasnhisasphisleu1510<210>20<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>20asnhisasphisleuglyasnvalserala1510<210>21<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>21glyasnvalseralaglnilealatyrser1510<210>22<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>22glnilealatyrserlysileserlysarg1510<210>23<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>23lysileserlysargtrpasnpheproser1510<210>24<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>24trpasnpheproserprophetyrargleu1510<210>25<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>25prophetyrargleuhisphelysilepro1510<210>26<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>26hisphelysileproglnthrasnvalser1510<210>27<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>27glnthrasnvalservalalailephemet1510<210>28<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>28valalailephemetleuaspthrvalthr1510<210>29<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>29leuaspthrvalthrleucysglyasnser1510<210>30<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>30leucysglyasnseraspasppheleuser1510<210>31<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>31aspasppheleuserglnglnprogluarg1510<210>32<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>32glnglnprogluargproargaspvallys1510<210>33<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>33proargaspvallysleualaargthrgln1510<210>34<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>34leualaargthrglnleusertrpleulys1510<210>35<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>35leusertrpleulyslysglnleualaala1510<210>36<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>36lysglnleualaalaalaarggluasptyr1510<210>37<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>37alaarggluasptyrvalleuvalalagly1510<210>38<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>38valleuvalalaglyhistyrprovaltrp1510<210>39<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>39histyrprovaltrpserilealagluhis1510<210>40<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>40serilealagluhisglyprothrhiscys1510<210>41<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>41glyprothrhiscysleuvallysglnleu1510<210>42<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>42leuvallysglnleuargproleuleuala1510<210>43<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>43argproleuleualathrtyrglyvalthr1510<210>44<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>44thrtyrglyvalthralatyrleucysgly1510<210>45<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>45alatyrleucysglyhisasphisasnleu1510<210>46<211>10<212>prt<213>部分acp5<400>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