本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種分離凱氏帶的方法。

背景技術：

植物根的初生結構由外至內分為表皮、皮層和維管柱三部分。皮層最內一層細胞為內皮層，細胞排列整齊而緊密。在內皮層細胞徑向壁和橫向壁上，常有木栓化和木質化的帶狀增厚部分，稱為凱氏帶。凱氏帶的主要功能是阻止水分向組織滲透，控制皮層和維管柱之間的物質運輸。在植物根部水與無機養分的運輸過程中，凱氏帶主要影響外質體運輸途徑，即水與無機養分經由表皮、外皮層及皮層細胞壁間質傳遞運輸。然而由于凱氏帶具有不透水性，當水與無機鹽養分進入到內皮層細胞時，轉由內皮細胞的細胞膜間質進行傳遞，即由質外體運輸途徑轉為共質體運輸途徑，最終進入中柱內的木質部細胞。

經典的分離凱氏帶的方法主要有以下兩種：(1)用濃硫酸等強酸處理植物根部，自然降解分離得到凱氏帶；(2)利用纖維素酶和果膠酶溫和酶解植物根部，從內皮層細胞中分離得到凱氏帶。但是，兩種方法均存在操作過程危險(強腐蝕性和強致癌性)、分離時間過長(半個月以上)、分離效率偏低(約幾毫克)以及成分破壞較為嚴重等缺點。因此，迫切需要設計一種安全、節省、快速、高效的分離凱氏帶的方法。

技術實現要素：

本發明所要解決的問題是如何分離凱氏帶。

為解決上述問題，本發明首先提供了一種分離凱氏帶的方法。

本發明所提供的分離凱氏帶的方法，包括步驟a2)：將植物初生根或植物初生根的根段進行微波處理。

所述植物初生根的根段的長度可為0.5～2cm(例如0.5～1cm或1～1.5cm或1.5～2cm或0.5cm或1cm或1.5cm或2cm)。

所述步驟a2)的所述微波處理中，所述微波的頻率可為2000～2800MHz(例如2000～2450MHz或2450～2800MHz或2000MHz或2450MHz或2800MHz)。

所述微波的頻率為2450MHz具體可通過輸出功率為600W的微波爐實現。

所述微波爐具體可為格蘭仕集團的產品，產品型號為P70F23P-G5(SO)。

所述步驟a2)中，所述微波處理的時間可為1～3min(例如1～2min或2～3min或1min或2min或3min)。

上述方法中，所述方法還可包括如下步驟：在進行所述步驟a2)前，進行步驟a1)；所述步驟a1)為：使用離析液浸泡處理植物初生根或植物初生根的根段；所述離析液 由過氧化氫水溶液和乙酸組成。

所述植物初生根的根段的長度可為0.5～2cm(例如0.5～1cm或1～1.5cm或1.5～2cm或0.5cm或1cm或1.5cm或2cm)。

所述離析液具體可由1體積份30％(質量體積比)過氧化氫水溶液和1體積份乙酸組成。

所述步驟a1)中，所述浸泡處理的條件參數可為：24～34℃(例如24～28℃或28～32℃或32～34℃或24℃或28℃或32℃或34℃)、1～2h(例如1h～1.5h或1.5h～2h或1h或1.5h或2h)。

所述步驟a1)中，所述浸泡處理的條件參數具體可為：32～34℃、1h。

所述步驟a1)中，所述浸泡處理的條件參數具體可為：32℃、1h。

所述步驟a1)中，所述浸泡處理的條件參數具體可為：34℃、1h。

上述方法中，所述方法還可包括如下步驟a3)：完成所述步驟a2)后，收集固態物質，使用酶解液浸泡處理。

所述酶解液的溶質及其在體系中的中濃度可為b1)或b2)：

b1)0.010～0.020g/mL(例如0.010～0.015g/mL或0.015～0.020g/mL或0.010g/mL或0.015g/mL或0.020g/mL)果膠酶，0.020～0.030g/mL(例如0.020～0.025g/mL或0.025～0.030g/mL或0.020g/mL或0.025g/mL或0.030g/mL)纖維素酶；

b2)10～20U/mL(例如10～15U/mL或15～20U/mL或10U/mL或15U/mL或20U/mL)果膠酶，20～30U/mL(例如20～25U/mL或25～30U/mL或20U/mL或25U/mL或30U/mL)纖維素酶。

所述酶解液的溶劑可為pH4.6～5.0(例如pH4.6～4.8或pH4.8～5.0或pH4.6或pH4.8或pH5.0)、0.01～0.05mol/L(例如0.01～0.02mol/L或0.02～0.03mol/L或0.03～0.04mol/L或0.04～0.05mol/L或0.01mol/L或0.02mol/L或0.03mol/L或0.04mol/L或0.05mol/L)檸檬酸-磷酸鹽緩沖液。

所述酶解液的溶質及其在體系中的中濃度具體可為：0.015g/mL果膠酶，0.025g/mL纖維素酶。

所述酶解液的溶劑具體可為pH4.8、0.01mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液。

所述纖維素酶可為纖維素酶R-10，具體可為北京科創匯達生物科技有限公司產品，產品編號為6008。纖維素酶R-10的比活力可為1000U/g。纖維素酶R-10酶活力定義可為：纖維素酶R-10在25℃條件下，每分鐘催化1μmol纖維素轉化為多糖所需要的酶量為1U。

所述果膠酶可為果膠酶Y-23，具體可為北京科創匯達生物科技有限公司產品，產品編號為6038。果膠酶Y-23的比活力可為1000U/g。果膠酶Y-23酶活力定義可 為：果膠酶Y-23在25℃條件下，每分鐘催化1μmol果膠轉化為多糖所需要的酶量為1U。

所述步驟a3)中，所述浸泡處理的條件參數可為：42～46℃(例如42～44℃或44～46℃或42℃或44℃或46℃)、5～7h(例如5h～6h或6h～7h或5h或6h或7h)。

所述步驟a3)中，所述浸泡處理的條件參數具體可為：42℃、5h。

上述方法中，所述方法還可包括如下步驟a4)：完成步驟a3)后，收集固態物質并將其置于水中進行振蕩處理，然后收集固體物質，得到凱氏帶。

所述水可為去離子水。

所述步驟a4)中，所述振蕩處理的條件參數可為：140～160rpm(例如140～150rpm或150～160rpm或140rpm或150rpm或160rpm)、2～3h(例如2h～2.5h或2.5h～3h或2h或2.5h或3h)。

所述步驟a4)中，所述振蕩處理的條件參數具體可為：150rpm、2.5～3h。

所述步驟a4)中，所述振蕩處理的條件參數具體可為：150rpm、2.5h。

所述步驟a4)中，所述振蕩處理的條件參數具體可為：150rpm、3h。

所述步驟a4)中，所述振蕩處理中，旋轉半徑可為40～60mm(例如40～50mm或50～60mm或40mm或50mm或60mm)。

所述步驟a4)中，所述振蕩處理中，溫度可為25～30℃(例如25～28℃或28～30℃或25℃或28℃或30℃)。

所述植物可為種子植物。

所述種子植物可為裸子植物或被子植物。

所述裸子植物可為柏科植物。

所述柏科植物可為杉木。

所述杉木具體可為廣西融水杉木

所述被子植物可為單子葉植物或雙子葉植物。

所述單子葉植物可為禾本科植物。

所述禾本科植物可為玉米。

所述玉米具體可為玉米品種鄭單958。

實驗證明，利用本發明提供的方法可分離玉米根內皮層凱氏帶和杉木根內皮層凱氏帶。本發明提供的分離凱氏帶方法具有以下優點：一是操作快速，將原有技術分離時間為3～5d縮短到8～12h，避免了分離時間過久對結構成分造成的損傷；二是經過微波處理植物初生根，提升了酶解反應效率；三是優化了酶解細胞壁的反應條件，不需要更換酶解液，從而降低了成本；四是分離效果好；五是操作安全：用過氧化氫乙酸離析液替代傳統的鉻酸硝酸離析液，避免了接觸可致癌物鉻酸；六是操作便捷，微 波處理只需使用常規微波爐。可見，本發明提供的分離凱氏帶的方法安全、節省、快速和高效，為深入研究凱氏帶奠定了技術基礎，也為工業化分離凱氏帶成分提供了理論支撐。

附圖說明

圖1為熒光顯微鏡觀察玉米根內皮層凱氏帶。

圖2為熒光顯微鏡觀察玉米根內皮層凱氏帶。

圖3為熒光顯微鏡觀察杉木根內皮層凱氏帶。

圖4為熒光顯微鏡觀察杉木根內皮層凱氏帶。

圖5為杉木根內皮層凱氏帶的紅外光譜分析。

圖6為微波和非微波處理下玉米根內皮層凱氏帶的紅外光譜分析。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

離析液由1體積份30％(質量體積比)過氧化氫水溶液和1體積份乙酸組成。

酶解液：含0.015g/mL果膠酶和0.025g/mL纖維素酶的pH4.8、0.01mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液；其中纖維素酶為纖維素酶R-10，果膠酶為果膠酶Y-23，均產自日本YAKULT公司，購自北京科創匯達生物科技有限公司，產品編號分別為6008和6038。

纖維素酶R-10的比活力為1000U/g。

纖維素酶R-10酶活力定義：纖維素酶R-10在25℃條件下，每分鐘催化1μmol纖維素轉化為多糖所需要的酶量為1U。

果膠酶Y-23的比活力為1000U/g。

果膠酶Y-23酶活力定義為：果膠酶Y-23在25℃條件下，每分鐘催化1μmol果膠轉化為多糖所需要的酶量為1U。

封片液由1體積份50％(體積百分比)甘油水溶液和1體積份0.5％(質量體積比)FeCl₃水溶液組成。

玉米具體為玉米品種鄭單958，其為北京德農種業有限公司的產品。

杉木具體為廣西融水杉木，記載在如下文獻中：謝汝根等.杉木不同優良品種苗期對比研究.福建林業科技，2009，36(3)，124-127.

微波爐為格蘭仕集團產品，產品型號為P70F23P-G5(SO)。

實施例1、玉米根內皮層凱氏帶的分離及檢測

一、采用本發明提供的方法從玉米根內皮層中分離凱氏帶

采用本發明提供的方法從玉米根中提取凱氏帶的步驟如下：

1、取萌發4天的玉米幼苗的初生根，切成1cm的根段，用去離子水沖洗2～3次。

2、完成步驟1后，取20段步驟1得到的根段，置于2mL離析液中，抽氣(目的是使根段下沉，以實現充分浸泡)，32℃浸泡處理1h(根尖透明呈米黃色)，收集固態物質，用去離子水沖洗2～3次。

3、取步驟2得到的固態物質，采用頻率為2450MHz的微波處理2min。

具體實現方法為：將步驟2得到的固態物質置于微波爐中，設置微波爐的輸出功率為600W，微波處理時間為2min。

4、用酶解液浸泡處理步驟3的固態物質。

具體步驟：完成步驟3的固態物質置于酶解液中，42℃浸泡處理5h，收集固態物質，用去離子水沖洗2～3次。

5、振蕩處理

具體步驟：將步驟4得到的固態物質置于去離子水中，28℃、振蕩(搖速為150rpm，旋轉半徑為50mm)2.5h，收集固態物質。

6、取步驟5得到的固態物質，在解剖鏡下用解剖針分離固態物質，然后用去離子水清洗2～3次，使用冷凍干燥機進行冷凍干燥后封裝，得到玉米根內皮層凱氏帶。

二、玉米根內皮層凱氏帶的檢測

1、將步驟一分離的玉米根內皮層凱氏帶用小檗堿-甲苯胺藍對染法(具體步驟記載于如下文獻中：徐建華等.植物根內皮層凱氏帶染色的小檗堿-苯胺藍對染法。植物生理學通訊，2004，40(4)，479-482.)染色，然后用封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察。

實驗結果表明，步驟一分離的玉米根內皮層凱氏帶具有網狀結構(圖1)，其木栓質加厚(圖2)。

2、將步驟一分離的玉米根內皮層凱氏帶用溴化鉀壓片，然后在Spectrum 100D紅外光譜儀下測量其紅外吸收光譜。凱氏帶的主要成分是木栓質和木質素，其中木栓質的特征吸收峰是甲基、亞甲基CH₂非對稱伸縮振動，在玉米根的外部組織中出現在2925cm^-1和2850cm^-1；木質素的特征吸收峰是其組成成分松柏醇和芥子醇的苯環振動，在玉米根的外部組織出現在1631cm^-1。

實驗結果表明，在步驟一分離的玉米根內皮層凱氏帶中檢測到木栓質和木質素成分(圖6)，可見，分離得到的固態物質確實為玉米根內皮層凱氏帶。

三、采用對照方法從玉米根內皮層中分離凱氏帶

采用對照方法從玉米根中提取凱氏帶的步驟如下：

1、同步驟一中1。

2、同步驟一中2。

3、用酶解液浸泡處理步驟2的固態物質。

具體步驟：完成步驟2的固態物質置于酶解液中，42℃浸泡處理3d，收集固態物質，用去離子水沖洗2～3次。

4、同步驟一中5。

5、取步驟4得到的固態物質，在解剖鏡下用解剖針分離固態物質，然后用去離子水清洗2～3次，使用冷凍干燥機進行冷凍干燥后封裝，得到玉米根內皮層凱氏帶。

按照步驟二中2的方法，得到采用對照方法從玉米根內皮層中分離凱氏帶的紅外吸收光譜。

實驗結果表明，步驟一采用本發明提供的方法從玉米根內皮層分離凱氏帶和步驟三采用對照方法從玉米根內皮層分離凱氏帶的狀態基本一致(圖6，微波為本發明提供的方法，無微波為對照方法)。可見，經過步驟一中3的微波處理，能夠迅速獲得玉米根內皮層凱氏帶，且不會影響其成分。

實施例2、杉木根內皮層凱氏帶的分離及檢測

一、分離杉木根內皮層凱氏帶

分離杉木根內皮層凱氏帶的步驟如下：

1、取萌發15天的杉木幼苗的初生根，切成1cm的根段，用去離子水沖洗2～3次。

2、完成步驟1后，取20段步驟1得到的根段，置于2mL離析液中，抽氣(目的是使根段下沉，以實現充分浸泡)，34℃浸泡處理1h(根尖透明呈米黃色)，收集固態物質，用去離子水沖洗2～3次。

3、取步驟2得到的固態物質，采用頻率為2450MHz的微波處理2min。

具體實現方法為：將步驟2得到的固態物質置于微波爐中，設置微波爐的輸出功率為600W，微波處理時間為2min。

4、用酶解液浸泡處理步驟3的固態物質。

具體步驟：完成步驟3的固態物質置于酶解液中，46℃浸泡處理5h，收集固態物質，用去離子水沖洗2～3次。

5、振蕩處理

具體步驟：將步驟4得到的固態物質置于去離子水中，28℃、振蕩(搖速為150rpm，旋轉半徑為50mm)3h，收集固態物質。

6、取步驟5得到的固態物質，在解剖鏡下用解剖針分離固態物質，然后用去離 子水清洗2～3次，使用冷凍干燥機進行冷凍干燥后封裝，得到杉木根內皮層凱氏帶。

二、杉木根內皮層凱氏帶的檢測

1、將步驟一分離的杉木根內皮層凱氏帶用小檗堿-甲苯胺藍對染法(具體步驟記載于如下文獻中：徐建華等.植物根內皮層凱氏帶染色的小檗堿-苯胺藍對染法。植物生理學通訊，2004，40(4)，479-482.)，然后封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察。

實驗結果表明，步驟一分離的杉木根內皮層凱氏帶具有網狀結構(圖3)，其木栓質加厚(圖4)。

2、將步驟一分離的杉木根內皮層凱氏帶用溴化鉀壓片，然后在Spectrum 100D紅外光譜儀下測量其紅外吸收光譜。凱氏帶的主要成分是木栓質和木質素，其中木栓質的特征吸收峰是甲基、亞甲基CH₂非對稱伸縮振動，在杉木根的外部組織中出現在2923cm^-1和2850cm^-1；木質素的特征吸收峰是其組成成分松柏醇和芥子醇的苯環振動，在杉木根的外部組織出現在1600cm^-1。

實驗結果表明，在步驟一分離的杉木根內皮層凱氏帶中檢測到木栓質和木質素成分(圖5)，可見，分離得到的固態物質確實為杉木根內皮層凱氏帶。