本發明涉及血清制備技術領域，具體是用于體外細胞培養的胎牛血清及其制備方法。

背景技術：

血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。

牛血清是細胞培養中用量最大的天然培養基，含有豐富的細胞生長必須的營養成份，常用于動物細胞的體外培養，具有極為重要的功能。提供對維持細胞指數生長的激素，基礎培養基中沒有或量很少的營養物，以及主要的低分子營養物。提供結合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結合或調變它們所結合的物質活力。有些情況下結合蛋白質能與有毒金屬和熱原質結合，起到解毒作用。是細胞貼壁、鋪展在塑料培養基質上所需因子來源。起酸堿度緩沖液作用。提供蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害。

其中胎牛血清應取自剖腹產的胎牛，胎牛血清是品質最高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。現有的胎牛血清制備工藝復雜、成本高，且純度低，不利于體外細胞培養。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供工藝簡單、易操作、各參數易控制、生產成本低、純度高、收率高的用于體外細胞培養的胎牛血清及其制備方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

用于體外細胞培養的胎牛血清的制備方法，包括以下步驟：

1）采集懷孕母牛的胎牛血液獲得血漿，具體步驟如下：

11）采用含有體積含量4-6%葡萄糖的注射液、含有質量含量0.2-0.6%檸檬酸鈉的水溶液進行混合，將混合后混合液A置入取血容器內充分滋潤容器內壁；

12）將胎牛血液置入上述滋潤過的取血容器內，搖動使其與胎牛血液均勻混合；

13）將混合均勻的含有胎牛血液的混合液B置入采血試管，保持血液在40℃以下恒溫狀態，然后將采血試管在離心機中以3000-14000r/min轉速旋轉5-30分鐘，分離出血漿、血小板、血球，將所得血漿、血小板、血球分別采用采血試管分離存放；

14）將已存放血漿的采血試管置入-20~0℃環境下保存備用；

2）將血漿分離提取胎牛血清，具體步驟如下：

21）取6-12g氯化鈉、0.1-0.5g磷酸二氫鉀和1.4-2.4g磷酸二氫鉀放入容器中，向其中加入300-700mL去離子水，攪拌均勻，使用質量分數為10-20%的鹽酸溶液調節pH為7.0-7.3，將上述所收集的血漿倒入容器中，攪拌均勻，溫度設定為25-38℃，靜置8-20min，得混合液C；

22）將上述的混合液C放入離心機中離心分離8-20min，轉速設定為3000-10000r/min，取上清液，在容器中部安裝一半透膜，將上清液倒在半透膜上方，密封，對容器頂部加壓至0.8-2.4MPa，溫度設定為38-47℃，待無液體從半透膜析出時，停止加壓，收集半透膜上部殘留物備用；

23）將半透膜上部殘留物按0.3-10.0%的體積比例加入辛酸液，調節pH至4.0-7.5，攪拌時間0.3-5小時；處理完畢，按100ml溶液加入0.3-1.0g硅藻土，攪拌均勻后，將消化液泵入板框式壓濾機進行過濾分離，過濾收集上清液即得胎牛血清。

作為本發明進一步的方案：步驟11）中，采用含有體積含量5%葡萄糖的注射液、含有質量含量0.4%檸檬酸鈉的水溶液進行混合得混合液A。

作為本發明進一步的方案：步驟11）中，含有體積含量4-6%葡萄糖的注射液、含有質量含量0.2-0.6%檸檬酸鈉的水溶液的體積比為1:0.3-4。

作為本發明進一步的方案：步驟13）中，將采血試管在離心機中以5000-14000r/min轉速旋轉10-25分鐘。

作為本發明進一步的方案：步驟14）中，將已存放血漿的采血試管置入-15~0℃環境下保存備用。

作為本發明進一步的方案：步驟21）中，取8-10g氯化鈉、0.2-0.4g磷酸二氫鉀和1.6-2.0g磷酸二氫鉀放入容器中，向其中加入400-600mL去離子水，鹽酸溶液的質量分數為15%。

作為本發明進一步的方案：步驟22）中，將上述的混合液C放入離心機中離心分離10-15min，轉速設定為4000-5000r/min。

作為本發明進一步的方案：步驟23）中，將半透膜上部殘留物按0.5-8.0%的體積比例加入辛酸液。

作為本發明進一步的方案：步驟23）中，按100ml溶液加入0.5-0.8g硅藻土。

本發明的另一目的是提供上述制備方法制得的胎牛血清。

作為本發明進一步的方案：制得的胎牛血清于56°C溫度下加熱30分鐘用于補充滅活。

作為本發明進一步的方案：制得的胎牛血清其FBS和供體牛血清的內毒素水平≤ 10 EU/mL。

作為本發明進一步的方案：制得的胎牛血清適用于專業的研究和試驗，包括干細胞研究、免疫分析和抗體生產。

作為本發明進一步的方案：制得的胎牛血清血紅蛋白≤10 毫克/升。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

本發明制備胎牛血清的工藝簡單、易操作，各參數易控制，且保證胎牛血清的性質穩定、生產成本低，胎牛血清純度高，收率高，制得的胎牛血清極適于體外細胞的培養，該血清經細胞培養認證專業檢測合格率高，適用于專業的研究和試驗，包括干細胞研究、免疫分析和抗體生產。同時具有最低的病毒風險，對牛病毒性腹瀉病毒含量要求非常低的學校、工業與前臨床研究來說是首選；而且FBS和供體牛血清的內毒素水平≤10 EU/mL。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例1

本發明實施例中，用于體外細胞培養的胎牛血清，其制備過程，包括以下步驟：

1）采集懷孕母牛的胎牛血液獲得血漿，具體步驟如下：

11）采用含有體積含量4%葡萄糖的注射液、含有質量含量0.2%檸檬酸鈉的水溶液進行混合，將混合后混合液A置入取血容器內充分滋潤容器內壁。其中注射液、水溶液的體積比為1:0.3。

12）將胎牛血液置入上述滋潤過的取血容器內，搖動使其與胎牛血液均勻混合。

13）將混合均勻的含有胎牛血液的混合液B置入采血試管，保持血液在40℃以下恒溫狀態，然后將采血試管在離心機中以3000r/min轉速旋轉5分鐘，分離出血漿、血小板、血球，將所得血漿、血小板、血球分別采用采血試管分離存放。

14）將已存放血漿的采血試管置入-20℃環境下保存備用。

2）將血漿分離提取胎牛血清，具體步驟如下：

21）取6g氯化鈉、0.1g磷酸二氫鉀和1.4g磷酸二氫鉀放入容器中，向其中加入300mL去離子水，攪拌均勻，使用質量分數為10%的鹽酸溶液調節pH為7.0，將上述所收集的血漿倒入容器中，攪拌均勻，溫度設定為25℃，靜置8min，得混合液C。

22）將上述的混合液C放入離心機中離心分離8min，轉速設定為3000r/min，取上清液，在容器中部安裝一半透膜，將上清液倒在半透膜上方，密封，對容器頂部加壓至0.8MPa，溫度設定為38℃，待無液體從半透膜析出時，停止加壓，收集半透膜上部殘留物備用。

23）將半透膜上部殘留物按0.3%的體積比例加入辛酸液，調節pH至4.0，攪拌時間0.3小時；處理完畢，按100ml溶液加入0.3g硅藻土，攪拌均勻后，將消化液泵入板框式壓濾機進行過濾分離，過濾收集上清液即得胎牛血清。

實施例2

本發明實施例中，用于體外細胞培養的胎牛血清，其制備過程，包括以下步驟：

1）采集懷孕母牛的胎牛血液獲得血漿，具體步驟如下：

11）采用含有體積含量6%葡萄糖的注射液、含有質量含量0.6%檸檬酸鈉的水溶液進行混合，將混合后混合液A置入取血容器內充分滋潤容器內壁。其中注射液、水溶液的體積比為1:4。

12）將胎牛血液置入上述滋潤過的取血容器內，搖動使其與胎牛血液均勻混合。

13）將混合均勻的含有胎牛血液的混合液B置入采血試管，保持血液在40℃以下恒溫狀態，然后將采血試管在離心機中以14000r/min轉速旋轉30分鐘，分離出血漿、血小板、血球，將所得血漿、血小板、血球分別采用采血試管分離存放。

14）將已存放血漿的采血試管置入0℃環境下保存備用。

2）將血漿分離提取胎牛血清，具體步驟如下：

21）取12g氯化鈉、0.5g磷酸二氫鉀和2.4g磷酸二氫鉀放入容器中，向其中加入700mL去離子水，攪拌均勻，使用質量分數為20%的鹽酸溶液調節pH為7.3，將上述所收集的血漿倒入容器中，攪拌均勻，溫度設定為38℃，靜置20min，得混合液C。

22）將上述的混合液C放入離心機中離心分離20min，轉速設定為10000r/min，取上清液，在容器中部安裝一半透膜，將上清液倒在半透膜上方，密封，對容器頂部加壓至2.4MPa，溫度設定為47℃，待無液體從半透膜析出時，停止加壓，收集半透膜上部殘留物備用。

23）將半透膜上部殘留物按10.0%的體積比例加入辛酸液，調節pH至7.5，攪拌時間5小時；處理完畢，按100ml溶液加入1.0g硅藻土，攪拌均勻后，將消化液泵入板框式壓濾機進行過濾分離，過濾收集上清液即得胎牛血清。

實施例3

本發明實施例中，用于體外細胞培養的胎牛血清，其制備過程，包括以下步驟：

1）采集懷孕母牛的胎牛血液獲得血漿，具體步驟如下：

11）采用含有體積含量4.5%葡萄糖的注射液、含有質量含量0.3%檸檬酸鈉的水溶液進行混合，將混合后混合液A置入取血容器內充分滋潤容器內壁。其中注射液、水溶液的體積比為1:1。

12）將胎牛血液置入上述滋潤過的取血容器內，搖動使其與胎牛血液均勻混合。

13）將混合均勻的含有胎牛血液的混合液B置入采血試管，保持血液在40℃以下恒溫狀態，然后將采血試管在離心機中以5000r/min轉速旋轉10分鐘，分離出血漿、血小板、血球，將所得血漿、血小板、血球分別采用采血試管分離存放。

14）將已存放血漿的采血試管置入-15℃環境下保存備用。

2）將血漿分離提取胎牛血清，具體步驟如下：

21）取8g氯化鈉、0.2g磷酸二氫鉀和1.6g磷酸二氫鉀放入容器中，向其中加入400mL去離子水，攪拌均勻，使用質量分數為10%的鹽酸溶液調節pH為7.0，將上述所收集的血漿倒入容器中，攪拌均勻，溫度設定為25℃，靜置10min，得混合液C。

22）將上述的混合液C放入離心機中離心分離10min，轉速設定為4000r/min，取上清液，在容器中部安裝一半透膜，將上清液倒在半透膜上方，密封，對容器頂部加壓至1MPa，溫度設定為40℃，待無液體從半透膜析出時，停止加壓，收集半透膜上部殘留物備用。

23）將半透膜上部殘留物按1.0%的體積比例加入辛酸液，調節pH至5.5，攪拌時間1小時；處理完畢，按100ml溶液加入0.5g硅藻土，攪拌均勻后，將消化液泵入板框式壓濾機進行過濾分離，過濾收集上清液即得胎牛血清。

實施例4

本發明實施例中，用于體外細胞培養的胎牛血清，其制備過程，包括以下步驟：

1）采集懷孕母牛的胎牛血液獲得血漿，具體步驟如下：

11）采用含有體積含量5.5%葡萄糖的注射液、含有質量含量0.5%檸檬酸鈉的水溶液進行混合，將混合后混合液A置入取血容器內充分滋潤容器內壁。其中注射液、水溶液的體積比為1:3。

12）將胎牛血液置入上述滋潤過的取血容器內，搖動使其與胎牛血液均勻混合。

13）將混合均勻的含有胎牛血液的混合液B置入采血試管，保持血液在40℃以下恒溫狀態，然后將采血試管在離心機中以14000r/min轉速旋轉25分鐘，分離出血漿、血小板、血球，將所得血漿、血小板、血球分別采用采血試管分離存放。

14）將已存放血漿的采血試管置入0℃環境下保存備用。

2）將血漿分離提取胎牛血清，具體步驟如下：

21）取10g氯化鈉、0.4g磷酸二氫鉀和2.0g磷酸二氫鉀放入容器中，向其中加入600mL去離子水，攪拌均勻，使用質量分數為18%的鹽酸溶液調節pH為7.3，將上述所收集的血漿倒入容器中，攪拌均勻，溫度設定為35℃，靜置15min，得混合液C。

22）將上述的混合液C放入離心機中離心分離15min，轉速設定為5000r/min，取上清液，在容器中部安裝一半透膜，將上清液倒在半透膜上方，密封，對容器頂部加壓至2MPa，溫度設定為45℃，待無液體從半透膜析出時，停止加壓，收集半透膜上部殘留物備用。

23）將半透膜上部殘留物按6.0%的體積比例加入辛酸液，調節pH至6.5，攪拌時間4小時；處理完畢，按100ml溶液加入0.8g硅藻土，攪拌均勻后，將消化液泵入板框式壓濾機進行過濾分離，過濾收集上清液即得胎牛血清。

實施例5

本發明實施例中，用于體外細胞培養的胎牛血清，其制備過程，包括以下步驟：

1）采集懷孕母牛的胎牛血液獲得血漿，具體步驟如下：

11）采用含有體積含量5%葡萄糖的注射液、含有質量含量0.4%檸檬酸鈉的水溶液進行混合，將混合后混合液A置入取血容器內充分滋潤容器內壁。其中注射液、水溶液的體積比為1:2。

12）將胎牛血液置入上述滋潤過的取血容器內，搖動使其與胎牛血液均勻混合。

13）將混合均勻的含有胎牛血液的混合液B置入采血試管，保持血液在40℃以下恒溫狀態，然后將采血試管在離心機中以10000r/min轉速旋轉15分鐘，分離出血漿、血小板、血球，將所得血漿、血小板、血球分別采用采血試管分離存放。

14）將已存放血漿的采血試管置入-10℃環境下保存備用。

2）將血漿分離提取胎牛血清，具體步驟如下：

21）取9g氯化鈉、0.2g磷酸二氫鉀和1.8g磷酸二氫鉀放入容器中，向其中加入500mL去離子水，攪拌均勻，使用質量分數為15%的鹽酸溶液調節pH為7.3，將上述所收集的血漿倒入容器中，攪拌均勻，溫度設定為38℃，靜置20min，得混合液C。

22）將上述的混合液C放入離心機中離心分離12min，轉速設定為5000r/min，取上清液，在容器中部安裝一半透膜，將上清液倒在半透膜上方，密封，對容器頂部加壓至2.4MPa，溫度設定為47℃，待無液體從半透膜析出時，停止加壓，收集半透膜上部殘留物備用。

23）將半透膜上部殘留物按4.0%的體積比例加入辛酸液，調節pH至5，攪拌時間3小時；處理完畢，按100ml溶液加入0.6g硅藻土，攪拌均勻后，將消化液泵入板框式壓濾機進行過濾分離，過濾收集上清液即得胎牛血清。

對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。