本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及早實枳mir172家族基因的分離及在植物成花調控中的應用。本發明分離到早實枳mir172基因家族中的3個成員，分別命名為ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c，它們的核苷酸序列依次為seqidno：1、seqidno：2和seqidno：3，長度分別為212bp、305bp和298bp。遺傳轉化煙草后，ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c均明顯地縮短了煙草的營養生長期，促進煙草早花。這些基因對于加快多年生木本果樹的育種和遺傳改良將發揮重要的作用。

背景技術：

開花結實是植物生命周期中重要的生物學過程，是植物自身發育過程的中心環節，也是果樹生產及果業產品加工的基礎。大部分的木本果樹均為多年生的植物，從種子播種、萌發到具備正常的開花能力，需要經歷一個漫長的階段，即童期(cerveraetal.1998)。不同種類的果樹童期長短不同，桃三李四橘八年，而像銀杏等實生繁殖樹從播種到開花則需更長時間(penaetal.2001)。木本果樹一般體積大、遺傳背景復雜、童期相對較長等原因，很大程度上制約了多年生果樹，尤其是以收獲生殖器官為主的果樹和經濟林木的育種進程及新品種的推廣。因此，揭示木本植物從營養生長到生殖生長轉變的分子機制，對于果樹品種改良及花期調控有著重要的理論意義和實踐價值。

植物成花是其成功進入生殖階段的標志，目前在擬南芥中發現有五條主要調控植物成花的途徑：光周期途徑、春化途徑、ga途徑、自主途徑和年齡途徑(khanetal.2014)。micrornas(mirnas)是一類大小只有21-24nt的單鏈小分子rna，是動植物中最重要的基因表達調控因素之一，通過特異地降解或者抑制靶基因的翻譯來調控基因的表達(nozawaetal.2012)。近年來的研究發現，mir156和mir172在植物由營養生長向生殖生長的轉變期扮演著關鍵的角色，二者可以靶定目標基因的dna轉錄因子起作用(lauteretal.2005)。mir156在植物幼年期呈現很高的表達量，在進入成年期后含量逐漸降低，而mir172有著相反的表達模式(fornaraetal.2009)，這表明mir156和mir172有著互補的調節關系。mir156的過表達可以對spl基因造成負調控作用，推遲幼年期向成年期和成年期向生殖期的轉變(khanetal.2014；wuetal.2009)。spl基因是多個成花信號調控并形成年齡成花途徑的分子輸出通道(wangetal.2009)。在擬南芥中，mir172對成花的調控機制已有較多報道，主要通過調控ap2和ap2-like基因的轉錄水平來調節植物的成花(mathieuetal.2009)，而在木本植物中，mir172的調控作用還不完全清楚。

mir172除了調控植物的成花時間，對植物的花器官形成也有一定的影響。擬南芥的花朵有四輪花器官，從外到內依次是萼片(第一輪)、花瓣(第二輪)、雄蕊(第三輪)和雌蕊(第四輪)。花器官的形成由a、b和c三類基因進行調控(causieretal.2010)。ap2屬于a類基因，它特異調控第一輪花器官萼片的生長，并與ap3和pi共同調控第二輪花器官花瓣的生長(wollmannetal.2010)。ap2是mir172的靶基因，mir172可以通過調節ap2的表達來對花器官的形成進行控制，mir172該部分的作用已有實驗進行證實。

mirna在植物的整個生長發育過程中都有著重要的作用，其中mir172在植物的成花過程中是年齡途徑中的重要控制基因，mir172在擬南芥中的作用機理目前已經研究的較為透徹，但關于mir172在木本植物中對成花的研究卻不是很多。柑橘作為世界上第一大果樹，有著重要的經濟價值，但其童期長(從栽植到第一次開花的時間)且大部分品種一年成花一次，嚴重制約了其育種進程。本申請人所在的華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室在前期研究中發現普通枳的早花突變體早實枳(aietal.2012；lietal.2010；zhangetal.2011)，它的童期只有一至兩年，而且可以一年多次成花。早實枳的發現為研究柑橘一年多次成花的機理提供了良好的材料。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，通過轉基因手段對早實枳mir172基因家族的3個成員進行分離和功能研究，在模式植物煙草中驗證mir172基因家族成員的功能并探索該基因家族成員之間功能的差異，以期獲得3個成員的超表達轉化材料，進而探究mir172家族基因對柑橘成花的影響，并豐富柑橘的成花網絡。

本發明分離到早實枳(一種枳的芽變材料—本發明稱之為早實枳，分類命名：poncirustrifoliata(l.)raf.文獻參見梁遂權等，1999)mir172基因家族中的3個功能基因，分別命名為ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c，它們的核苷酸序列依次為seqidno：1、seqidno：2和seqidno：3，序列長度分別為212bp、305bp和298bp。

同時采用real-timepcr檢測了總ptmir172基因即ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c的總和及其靶基因ptap2(ciclev10025364)在早實枳成花不同時期的表達量，發現ptap2的表達模式與ptmir172相反，表明在早實枳中ptmir172可能通過靶向調節ptap2的表達，從而調控成花。

ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c在煙草中超表達后均可以明顯促進成花，值得注意的是ptmir172a基因株系具有花器官和葉形變異等表型。因此申請人獲得了可使植物早花的ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c超表達重組載體，所構建的載體含有如seqidno：1、seqidno：2和seqidno：3所示的核苷酸序列，同時還獲得了ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c超表達的轉基因植株。

本發明通過轉化煙草表明ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c均可明顯促進成花，縮短了植物的開 花時間，這些基因的應用為多年生木本果樹提早開花(即縮短童期)和相關育種縮短了進程，在植物的遺傳改良中發揮著重要作用。

附圖說明

序列表seqidno：1是本發明分離得到的mir172家族基因中ptmir172a的核苷酸序列。序列長度為212bp。

序列表seqidno：2是本發明分離得到的mir172家族基因中ptmir172b的核苷酸序列。序列長度為305bp。

序列表seqidno：3是本發明分離得到的mir172家族基因中ptmir172c的核苷酸序列。序列長度為298bp。

圖1：早實枳mir172家族基因ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c的擴增膠圖。附圖標記說明：第1泳道為marker；第8-12泳道為ptmir172a基因的擴增；第14-18泳道為ptmir172b基因的擴增；第20-24泳道為ptmir172c基因的擴增。

圖2：采用實時定量pcr檢測早實枳花發育不同時期總ptmir172及其靶基因ptap2的相對表達量。在早實枳花芽分化之前開始采樣，直至花芽分化完成花朵開放。附圖標記說明：圖2中的a圖是總ptmir172的表達量；圖2中的b圖是靶基因ptap2的表達量。圖中橫坐標標記1、2、3分別是直徑大為2mm、4mm和6mm的花芽，4是完全開放的花朵。

圖3：是原始載體pcambia1302圖譜和本發明構建的重組載體pcambia1302+ptmir172a、pcambia1302+ptmir172b和pcambia1302+ptmir172c的圖譜。附圖標記說明：圖3中的a圖是原始載體pcambia1302的圖譜；圖3中的b圖分別是構建的重組載體pcambia1302+ptmir172a、pcambia1302+ptmir172b和pcambia1302+ptmir172c的圖譜。

圖4：是mir172家族基因轉基因煙草開花時間表型觀察的結果。附圖標記說明：圖4中的a圖左邊植株是野生型煙草(非轉基因)植株，右邊是轉ptmir172a基因的煙草；圖4中的b圖的植株從左至右依次是野生型(非轉基因)植株、轉ptmir172b基因和轉ptmir172c基因的煙草植株。

圖5：是轉ptmir172a基因煙草表型觀察的結果。附圖標記說明：圖5中的a圖是野生型煙草(非轉基因)；圖5中的b圖是轉ptmir172a基因的煙草；圖5中的c圖和e圖是轉ptmir172a基因煙草花器官特異的表型；圖5中的d圖是轉ptmir172a基因煙草葉片特異的表型。

具體實施方式

實施例1從早實枳中分離ptmir172家族基因

早實枳是普通枳的早花變異植株(梁遂權等，1999；zhangetal.2011)，與普通枳相比，早實枳童期縮短。根據本申請人所在的華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室前期對早實枳轉錄組測序(zhangetal.2011)，結果顯示早實枳mir172基因家族中的3個成員，它們的核心序列如表1所示，為我們在早實枳中分離mir172基因家族的基因提供了有價值的參考。

為了克隆得到早實枳中ptmir172基因家族，用mirna的核心序列(見表1)對克里曼丁基因組數據庫(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)進行搜索，對搜索到的高度同源序列，采用primerprimer5.0軟件進行引物設計，利用早實枳的dna對ptmir172家族基因進行擴增。早實枳葉片基因組dna的抽提采用前期報道的方法(chengetal.2003)以此dna為模板，采用保真性高的dna聚合酶進行ptmir172家族基因的擴增，所采用的擴增ptmir172家族基因引物對的序列如表2所示。

表1早實枳mir172家族基因的核心序列

表2擴增ptmir172家族基因的引物序列

擴增到的基因片段采用1％的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(如圖1所示)，目的片段利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購于上海捷瑞生物工程有限公司，codeno.gk2042)回收純化(方法按照試劑盒說明書)。對回收產物進行at克隆，并轉化大腸桿菌dh5α。陽性菌落先進行pcr檢測(按常規方法)，然后再送樣并進行測序(由深圳華大基因科技武漢分公司完成)。隨后將測序結果與已知數據庫里面的dna序列進行對比，以保證基因序列的一致性。

實施例2ptmir172及其靶基因ptap2的表達分析

很多研究表明mir172調控花芽分化(zhaoetal.2007)，因此我們通過rt-pcr方法，以早實枳不同時期 的花芽為材料，分析花芽形成及分化前后總mir172(ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c的總和)相對表達量的差異及表達模式。同時也分析其靶基因ptap2(ciclev10025364)在花芽分化過程中的表達模式。rt-pcr所采用的引物序列見表3。

1、早實枳組織總rna的提取：分別對華中農業大學標本園基地的早實枳花發育不同時期進行采樣，采取的是直徑分別為2mm、4mm、6mm的花苞和完全開放的花。采完后立即用液氮速凍，并保存于-80℃冰箱內備用。rna的提取采用rnaisoplus試劑盒(購自寶生物工程大連有限公司，codeno.9108)，按操作按照試劑盒說明書進行，并用rnase-freednaseⅰ(購自寶生物工程大連有限公司，codeno.2270a)消化15min以去除基因組dna。通過瓊脂糖凝膠進行rna的完整性檢測，核酸的濃度用nanodrop分光光度計測定，a260/a230值為大于2.0，a260/a280值為介于1.8-2.0之間。

表3rt-pcr鑒定引物

2、第一條鏈cdna的合成：cdna第一條鏈的合成采用revertraaceqpcrrtkit反轉錄試劑盒(購于東洋紡上海生物科技有限公司,codeno.fsq-101)。在rnase-free的0.2ml離心管中加入5μl(約1μg)總rna，1μloligodt，混勻后70℃變性5min，取出后迅速置于冰上冷卻2min；再依次加入dntp2μl，5×rtbuffer4μl，42℃放置2min；最后加入revertraace反轉錄酶1μl，反復吸打混勻后42℃孵育60min，70℃加熱10min以終止反應。反轉錄后的cdna為模板，用β-actin引物進行pcr檢測cdna質量，-20℃保存備用。

3、rt-pcr：在lightcycler480上進行實時熒光定量pcr，反應程序為：95℃預變性2min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，循環次數為45。每個樣品4個重復，以β-actin基因(ciclev10025866m)為內參，反應體系如表4。

表4rt-pcr反應體系

從圖2所顯示的定量結果來看，在早實枳的成花轉變階段，ptmir172在花發育的不同時期表達量差別 較大：花芽分化初期表達量較高，隨著花芽的形成表達量逐漸降低，開花時表達量逐漸上升。靶基因ptap2的表達量分析結果顯示：ptap2的表達模式與ptmir172相反，花芽分化初期表達量較低，隨后逐漸升高，開花時又有所下降。表明在早實枳中ptmir172可能通過靶向調節ptap2的表達，從而調控成花。

實施例3早實枳ptmir172家族基因對煙草進行遺傳轉化

(1)載體的構建：為了驗證ptmir172家族基因的功能，依據pcambia1302載體(購自澳大利亞的cambia實驗室)的多克隆位點和ptmir172家族基因的序列，用primerpremier5.0軟件設計引物，在正向和反向引物的5'端分別加上酶切位點，引物序列見表5所示。

分別以ptmir172家族基因ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c片段為模板，以表5中的引物序列分別進行pcr擴增，獲得加入酶切位點的ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c基因片段，用于后續載體的構建(原始載體和構建的重組載體的構建方法及其示例見圖3所示)。pcr反應的退火溫度為60℃。pcr反應條件為：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，90s；72℃，10min。35個循環。擴增的片段分別用1％瓊脂糖凝膠進行分離，采用上海捷瑞生物有限公司膠回收試劑盒回收，按照試劑盒說明書操作。將回收的目的基因

表5構建ptmir172家族三個基因的載體所用引物序列

的產物通過at克隆分別連接到通用載體pmd18-t(購自寶生物大連有限公司)上，連接體系為10μl(t4ligase1μl，10×t4緩沖液1μl，pmd18-t0.5μl和目的片段7.5μl)，將各組分用移液器反復吸打混勻，16℃連接過夜。對檢測為陽性的菌液進行質粒的提取，然后分別進行雙酶切。雙酶切體系為：反應總體積為40μl，體系為：pcambia1302質粒10μl，10×h緩沖液(購自寶生物工程大連有限公司)4μl，bglii和bsteii各1μl，雙蒸水24μl。37℃酶切3h后進行瓊脂糖凝膠的分離并進行純化回收，回收產物進行下一步的連接實驗。在連接反應體系中，ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c基因片段分別與載體pcambia1302的摩爾比為3:1，反應總體積為10μl，其中10×buffer1μl，t4dna連接酶1μl，ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c基因的雙酶切回收產物4μl，pcambia1302載體的雙酶切回收產物2μl，雙蒸水2μl。于16℃反應14-16小時。連接產物分別轉化大腸桿菌菌株dh5α，在含有50mg/l卡那霉素的lb固體平板中篩選陽性克隆，抽提質粒進行酶切及pcr鑒定，測序確定沒有突變，從而獲得含有目的片段的重組載體 pcambia1302+ptmir172a、pcambia1302+ptmir172b和pcambia1302+ptmir172c。應用凍融法(sambrooketal.1989)將重組載體這三個重組載體分別導入農桿菌菌株eha105中，并對農桿菌菌液進行-80℃下保存備用，以便后續的轉化應用。

(2)煙草的轉化：

1)農桿菌菌液的準備：取出儲存于-80℃保存含有重組載體pcambia1302+ptmir172a、pcambia1302+ptmir172b和pcambia1302+ptmir172c的農桿菌菌液，在28℃培養箱中振蕩活化2h。用無菌接種環分別蘸取少量菌液在三個含有50mg/l卡那霉素的lb固體培養基上劃線，風干后在28℃培養箱倒置培養3d。用無菌手術刀刮取菌落，分別融于ms液體懸浮培養基中，28℃180r/min振蕩培養約1h，使農桿菌分散形成均勻的懸浮液，顏色為乳白色為最佳。用紫外分光光度計測得菌液的od值，并用ms懸浮培養基調節od600為0.8左右，分別置于無菌三角瓶中備用。

2)煙草與農桿菌共培養：在超凈工作臺上將無菌煙草取出，選取完全舒展的大而鮮綠的葉片置于無菌濾紙上，一端用鑷子固定，然后用手術刀迅速切除葉緣造成傷口部位便于農桿菌浸染，將葉片切成2cm×2cm的正方形小塊，置于備好的三個農桿菌菌液里，保證菌液與葉片的充分接觸，輕輕搖晃10min，取出煙草葉片，放在無菌濾紙上吸干表面菌液，然后分別接種于不含任何激素和抗生素的ms固體培養基上，于24℃暗培養3d。

3)轉化煙草的篩選培養：共培養3d后，用無菌鑷子分別將ms培養基上的葉片取出，用400μg/ml的頭孢水清洗2次，每次5min，期間不停地輕輕搖晃，去除表面殘留的農桿菌菌液。然后用無菌水清洗3次，放于濾紙上吸干葉片表面的水分，分別接種于含有5mg/l潮霉素和400μg/ml頭孢的ms篩選培養基上，23℃光下培養。每20d繼代一次，直至長出抗性芽。

4)生根培養：將長出來的抗性芽在無菌條件下轉移到含有5mg/l潮霉素和400μg/ml頭孢的生根培養基上，大約20d后可以移栽。

注：煙草轉化培養基的配方如下：

基本培養基：ms+蔗糖30g/l；

懸浮培養基：基本培養基；

共培養培養基：基本培養基+6-ba2.0mg/l+naa0.3mg/l+瓊脂7g/l；

篩選培養基：基本培養基+6-ba2.0mg/l+naa0.3mg/l+瓊脂7g/l+hygb5mg/l+cef400mg/l；

生根培養基：基本培養基+瓊脂7g/l；

繼代培養基：基本培養基+瓊脂7g/l；

以上各種培養基ph均為5.8～6.0。培養溫度為25℃，需要光照條件的培養環境中光照強度為1500～2000lx，光照時間為長日照(16h光照/8h黑暗。黑暗是指不需要光照或在培養室內將培養材料用黑布遮擋)。

3)煙草的移栽與鑒定：首先取一些小花盆，裝滿基質土，再用水澆透，確保基質土濕潤透氣。用鑷子小心將煙草嫩苗從組培瓶中取出，用水洗凈根基部的培養基，移栽到事先準備好的小花盆中。放于25℃的光照培養箱里煉苗7d，然后對這些苗子(t1代)進行dna和rna水平上的pcr鑒定。鑒定出的陽性苗移栽，用帶孔的塑料杯罩住，利于幼苗的保濕防護。一周后去掉罩杯，放于溫室中繼續生長。t1代種子會由于染色體的自由組合出現性狀分離，故用相同的篩選方法篩選t2代可去除非抗性苗。對t2代苗進行dna和rna水平上的驗證，獲得煙草轉基因t2代種子后，選取3個株系進行播種，每個株系選取生長一直的幼苗進行移栽。在轉基因煙草和野生型煙草的整個生長周期中，長勢良好，便于進行表型統計。

4)結果分析：轉基因煙草與野生型煙草同時移栽至溫室，在相同的環境下生長，確保煙草的生長條件的一致性。本發明主要觀察轉基因煙草開花時間(即從移栽成活到形成第一個花苞的時間)和其他相關形態特征。圖4的結果顯示所有轉基因煙草(ptmir172a、ptmir172b和ptmir172c)的開花時間與野生型煙草(非轉基因煙草)相比，開花時間均提前。具體統計結果如表6所示，野生型煙草開花時間約為140天左右，而mir172家族基因轉基因株系較野生型煙草均明顯早花，早花約110天左右。

從圖5的結果可以看出，與野生型煙草相比較，轉ptmir172a基因株系除了具有早花性狀外，還具有明顯的器官變異性狀。轉ptmir172a基因植株在花苞剛剛形成時，花苞是閉合狀態，隨著花苞的漸漸長大可以發現花朵中的柱頭和雄蕊處于外露狀態，使得花苞不能閉合，如圖5中的e圖所示。在花朵逐漸生長直至完全開放時，可以發現柱頭伸長至花朵外，整個柱頭的長度約有花朵長度的1.5倍，如圖5中的c圖

表6ptmir172家族轉基因煙草開花時間的統計

所示，而此時的雄蕊卻未伸長至花朵的外部，其它部分的花器官如花瓣，萼片等未發現變異。除了煙草花柱頭的變異，基因植株的葉片也發生了明顯的變化。如圖5中的d圖所示：野生型煙草的葉片從基部至頂端，葉片形狀、大小基本一致，葉片健壯肥厚，表面有絨毛，而且葉片間距平均一致；而轉ptmir172a基因植株葉片與野生型葉片表面一樣有絨毛存在，但由基部至頂端葉片卻是不斷地變得細長和狹小。在植株生長初期，轉ptmir172a基因植株葉片與野生型植株葉片一樣寬大肥厚，隨著花苞的形成植株不斷長高，葉片由下至上就開始不斷的變窄變短，整個葉形由寬大變成最后的針形葉；在葉片逐漸變狹小的同時，葉片間距也逐漸變大。這些結果表明，ptmir172a不僅可以促進煙草早花，還可以影響花器官及葉片的形態。主要參考文獻

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