本發明屬于生物醫藥領域，涉及紫杉醇的多肽偶合物及其制備方法，具體涉及紫杉醇伐普肽偶合物及其制備方法和在治療腫瘤方面的應用。

背景技術：

紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是從紅豆杉屬植物的樹皮中分離提取的二萜類天然產物，為近二十年來所研發上市的最有效的化學抗癌藥物之一。通過特異性結合到細胞微管小管的β位，使微管聚合為團塊或束狀，紫杉醇可有效抑制微管網的正常重組，使細胞的分裂，繁殖及生長受到阻礙并停滯在G2期和M期，從而抑制癌細胞的有絲分裂和增殖。作為國際上廣泛認可的高效化學抗癌藥物，紫杉醇已被眾多國家批準用于臨床，以治療包括乳腺癌，卵巢癌，結腸癌，食道癌，非小細胞肺癌，膀胱癌，前列腺癌，黑素瘤，淋巴瘤，白血球過多癥及胃癌等多種癌癥[R.M.straubinger,Biopharmaceutics of paclitaxel(taxol):formulation,activity and pharmacokinetics,in:M.Suffness(Sd.),Taxol:Science and Applications,CRC Press,New York,pp.237-54(1995)]。但是紫杉醇與普通化藥一樣，存在選擇性低、毒副作用大、水溶性差的缺點，嚴重影響了藥物藥效；由于紫杉醇在體內分布廣泛，尤其是在正常器官和組織中有較多的分布，不僅給患者帶來了痛苦，更降低了藥物生物利用度。此外，紫杉醇在水中的溶解性較差(小于1μg/ml)，極大的影響了藥效的發揮，目前上市的劑型多利用非離子型表面活性劑吐溫-80增溶，經13％的乙醇稀釋后注射使用。但是吐溫-80具有溶血性且粘度較大，在臨床應用中，以發現該制劑具有外周神經毒性和肌肉骨骼毒性，以及中性粒細胞減少等一系列過敏反應。因此，解決紫杉醇的選擇性低、水溶性差等問題，控制該藥物釋放速率及提高靶向性，對于提高紫杉醇抗癌活性具有重要意義。

當前，因靶向化療比全身化療具有高效低毒的特點，而成為當前癌癥治療的研究熱點。將化療藥物與生長抑素類似物連接，對于表達SSTR的腫瘤具有廣闊的治療前景與極高的醫學價值。伐普肽是化學合成的生長抑素的八肽類似物，與SSTR2、SSTR3及SSTR5具有更強的結合力，選用伐普肽與化療藥物偶聯可以有效實現靶向治療腫瘤細胞。此外，伐普肽作為生長抑素類似物，本身也具有直接和間接的抗腫瘤作用。

隨著紫杉醇的臨床廣泛應用，其在臨床顯現的不良反應如：骨髓抑制、神經毒性等越來越明顯，可以解決紫杉醇水溶性差、選擇性低、毒副作用大的缺點，臨床亟需一款新型的靶向抗癌化合物為廣大的腫瘤患者減輕經濟與精神負擔。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一款紫杉醇伐普肽偶合物，所述的紫杉醇伐普肽偶合物是一款新型的靶向抗癌藥物，從根本上解決了紫杉醇選擇性低、毒副作用大、水溶性差等缺點，具有選擇性高、水溶性好、毒副作用小、藥效高等優異性能。

本發明的另一目的是提供上述紫杉醇伐普肽偶合物的制備方法。

本發明的又一目的是提供上述紫杉醇伐普肽偶合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發明公開了紫杉醇伐普肽偶合物，所述的偶合物是由紫杉醇在2’位羥基通過鏈接序列與伐普肽氨基相連而得。

所述的紫杉醇的結構式為：

所述的連接序列為：

其中，n＝1、3、5、7、9。

所述小分子多肽伐普肽的結構式為：

所述的紫杉醇伐普肽偶合物為：PTX-1-伐普肽偶合物、PTX-5-伐普肽偶合物、(PTX)₂-伐普肽偶合物中的一種。

進一步，所述的PTX-1-伐普肽偶合物的結構式為：

進一步，所述的PTX-5-伐普肽偶合物的結構式如下：

進一步，所述的(PTX)₂-伐普肽偶合的結構式如下：

本發明還公開了上述紫杉醇伐普肽偶合物的制備方法，所述技術方案如下：

(1)中間體PTX-Linker的化學合成，合成路線圖如下：

具體操作方法如下：

1)將紫杉醇溶于無水二氯甲烷，加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，丁二酸酐，在一定條件下反應一段時間后加入乙酸乙酯，并用鹽酸調至pH3-4，反應液依次用飽和食鹽水萃取1次、水萃取3次，最后用無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓回收乙酸乙酯；

2)所得殘余物用丙酮-乙醚重結晶，即得到目標產物紫杉醇-2’-丁二酸酯純品(中間體PTX-Linker)。

上述操作的有益效果是：選用的無水二氯甲烷溶劑為關鍵性溶劑，該溶劑可以使紫杉醇完全溶解，并促進與丁二酸酐充分的接觸，提高反應效率，副產物少。

進一步，所述的操作方法中，所述的步驟1)中無水二氯甲烷溶劑與4-二甲基氨基吡啶(DMAP)的體積比范圍為(15.5:1)-(20:1)，其中無水二氯甲烷與DMAP的最佳體積比是18:1。

進一步，所述的操作方法中，所述的步驟1)中反應條件為：反應溫度為：(8-15)℃，轉速為：(700-1000)r/min，攪拌時間為：(30-45)h，其中反應溫度為10℃、轉速為800r/min，攪拌時間為35h為最佳，此反應條件的有益效果是，紫杉醇與丁二酸酐的反應更加充分，目標產物收率高。

(2)紫杉醇伐普肽偶合物的化學合成

將PTX-Linker與伐普肽反應合成不同類型的紫杉醇-伐普肽偶合物即：PTX-1-伐普肽偶合物、PTX-5-伐普肽偶合物、(PTX)₂-伐普肽偶合物，整體的工藝路線圖見說明書附圖1。

進一步，所述的PTX-1-伐普肽偶合物的合成路線如下：

具體實驗操作方法為：

1)選用特殊的固相合成樹脂，用-Trt基團保護的巰基(-SH)在I₂/DIEA條件下可在固相合成樹脂上形成分子內二硫鍵，用側鏈保護的伐普肽樹脂在特定的脫除劑作用下，選擇性脫除N-端的Fmoc-氨基保護基，得到-Lys⁵-側鏈氨基受保護、N-端側鏈氨基酸游離的伐普肽樹脂，并將其置于固相合成反應器中，用無水二氯甲烷浸洗后抽取溶劑并通入干燥氮氣；

2)將紫杉醇-2’-丁二酸酯(PTX-Linker)溶于無水二氯甲烷，加入特定的高效偶合試劑，低速攪拌10min后，滴入上述通有氮氣的固相合成反應器中，在特定條件下反應一段時間；

3)將反應后溶液減壓濃縮，將濃縮液依次用二甲基甲酰胺洗滌6次，用二氯甲烷洗滌5次，用乙醚、石油醚、環己烷、正己烷中的一種或任意比例的混合溶劑洗滌3次，再次減壓濃縮除去多余溶劑即得到PTX-Linker-NH-伐普肽-固相合成樹脂；

4)目標產物從固相合成樹脂上解離步驟如下：將干燥樹脂加入一定的溶劑中，攪拌1小時后過濾；

5)目標產物純化步驟如下：過濾物再用無水二氯甲烷洗滌過濾，合并上述濾液后減壓濃縮，濃縮物用溶劑萃取，抽濾收集溶劑不溶的固體，干燥后得到純凈的目標產物PTX-1-伐普肽偶合物。

進一步，所述操作方法中，所述步驟1)中N-端氨基保護基脫除劑為DMAP的N,N-二甲基甲酰溶液，DMAP的質量分數為20％-40％，其中最佳質量比為30％；采用上述脫除劑的有益效果為：在脫除N-端保護基的同時，其它保護基不受影響，確保了目標產物的高效合成。

進一步，所述操作方法中，所述的步驟2)中溶解PTX-Linker的溶劑二氯甲烷或三氯甲烷的一種或任意比例混合溶劑；特定的高效偶合試劑為HOBt、DMC、DIC、DIEA按一定比例的混合溶劑，其中V_DMC:V_HOBt＝(5:1)-(10:1)，V_DIC:V_DIEA＝(3:1)-(8:1)。

進一步，所述操作方法中，所述的步驟2)中反應條件為：反應溫度為：(30-40)℃，攪拌速度為：(500-1000)r/min，攪拌時間為：(25-45)min，其中最佳反應條件為：反應溫度為35℃，攪拌速度為800r/min，攪拌時間為30min。

進一步，所述操作方法中，所述步驟4)中解離溶劑為2％-10％三氟乙酸的二氯甲烷溶液，其中最佳質量比為5％；所述步驟4)中解離反應條件如下：反應溫度為：(18-30)℃，攪拌速度為：(200-900)r/min，攪拌時間為：(1.5-2.5)h，其中最佳條件為：其中最佳反應條件為：反應溫度23℃，攪拌速度為：450r/min，攪拌時間為：2.0h，本操作的有益效果是：將目標產物從樹脂上切除，同時避免了目標產物結構遭到破壞，確保了目標產物的高效合成。

進一步，所述操作方法中，所述步驟5)中萃取溶劑為乙醚、石油醚、環己烷、正己烷中的一種或幾種任意比例的混合溶劑。

進一步，PTX-5-伐普肽偶合物的合成路線如下：

進一步，具體操作方法如下：

1)選用NH₂-Rink-Linker-Resin特殊的固相合成樹脂，用-Trt基團保護的巰基(-SH)在I₂/DIEA條件下可在固相合成樹脂上形成分子內二硫鍵，用烯丙甲酯基(AllylO-CO)保護Lys⁵側鏈的氨基，在加入特定的催化劑選擇性脫除烯丙甲酯基，得到N-端氨基受保護、Lys⁵-側鏈氨基游離的伐普肽樹脂，并將其置于固相合成反應器中，用無水二氯甲烷浸洗后抽取溶劑并通入干燥氮氣；

2)將紫杉醇-2’-丁二酸酯(PTX-Linker)溶于無水二氯甲烷或三氯甲烷中，加入BOP[苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽]，在一定條件下反應一段時間，滴入上述通有氮氣的固相合成反應器中；

3)將反應后的溶液減壓濃縮，濃縮液依次用二氯甲烷洗滌5次，二甲基甲酰胺洗滌6次，乙醚、石油醚、環己烷、正己烷的一種或任意比例的混合溶劑洗滌3次，減壓濃縮后即得到伐普肽Lys⁵(PTX-Linker-NH)-固相合成樹脂；

4)目標產物從固相合成樹脂上解離步驟如下：將干燥的樹脂加入一定的溶劑中，攪拌1小時后過濾，將過濾后的物質用無水三氯甲烷洗滌過濾；

5)目標產物純化步驟如下：合并上述濾液后減壓濃縮，濃縮物用溶劑萃取，抽濾收集溶劑不溶的固體，干燥后得到目標產物即PTX-5-伐普肽偶合物。

進一步，所述操作方法中，所述步驟1)中烯丙甲酯基脫除反應的催化劑為：Pd(OAc)₂、P(t-Bu)₃中的一種或兩種任意比例混合物，其中摩爾比2:1為最佳，采用上述脫除劑的有益效果為：脫除烯丙甲酯基的同時，其他保護基不受影響，確保了目標產物的高效合成。

進一步，所述操作方法中，所述步驟2)中溶解PTX-Linker的二氯甲烷可用無水二氯乙烷替換，其中無水二氯乙烷與無水二氯甲烷的替換摩爾比為：(1:2)-(4:1)；反應體系溶劑DIEA可用N,N-二甲基甲酰胺替換，其中N,N-二甲基甲酰胺與DIEA的替換摩爾比為：(1:2)-(4:1)。

進一步，所述操作方法中，所述步驟2)中反應條件為：反應溫度為：(30-50)℃，攪拌速度為：(500-1000)r/min，攪拌時間(25-45)min，其中最佳反應條件為：反應溫度為35℃，攪拌速度為800r/min，攪拌時間為30min。

進一步，所述操作方法中，所述步驟4)中解離試劑為質量分數為5％-15％的三氟乙酸的三氯甲烷或二氯乙烷溶液，其中最佳質量比為8％；所述步驟4)中解離反應條件為：反應溫度為：(30-50)℃，攪拌速度為：(500-1000)r/min，攪拌時間為：(1.2-2.0)h，最佳反應條件為：反應溫度為：35℃，攪拌速度為：800r/min，攪拌時間為：1.5h。所述的本操作方法的有益效果是將目標產物從樹脂上切除，同時避免了目標產物結構遭到破壞，確保了目標產物的高效合成。

進一步，所述操作方法中，所述的步驟5)中萃取溶劑為正丁基鋰、四氫呋喃中的一種或任意比例的混合溶劑。

進一步，(PTX)₂-伐普肽偶合物的合成路線如下：

述的(PTX)₂-伐普肽偶合物液相合成的技術方案如下：

1)將PTX-5-伐普肽偶合物粗品加入到特定溶劑中，在室溫下滴入高效偶合試劑，低速攪拌，滴加中間體PTX-linker，在特定條件下反應一段時間；

2)將反應后的溶液進行減壓蒸餾，除去多余的溶劑，將殘余物滴入冰水中，減壓濃縮，收集水中析出的固體并用蒸餾水洗滌3次。所得固體用特定的溶劑進行重結晶，得到目標產物(PTX)₂-伐普肽偶合物。

進一步，所述操作方法中，所述步驟1)中特定溶劑是指二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯中一種或兩種的混合溶劑，所述步驟1)中高效偶合試劑為HOBt、DCC、MMF按一定比例的混合溶劑，其中V_DCC:V_HOBt:V_MMF＝(3:2:1)-(8:6:1)。

進一步，所述操作方法中，所述步驟1)中反應條件為：反應溫度為：(30-45)℃，攪拌速度為：(800-1000)r/min，攪拌時間為(25-45)min，其中最佳反應條件為：反應溫度為35℃、攪拌速度為900r/min、攪拌時間30min。

進一步，所述操作方法中，所述步驟2)中重結晶溶劑為乙醇、四氫呋喃任意比例混合的溶劑。

所述的(PTX)₂-伐普肽偶合物固相合成的具體技術方案如下：

1)按照權利要求6制備出伐普肽-Lys⁵(PTX-Linker-NH)-固相合成樹脂后，在室溫下加入高效偶合試劑，低速攪拌，滴加中間體PTX-Linker進行反應，在特定條件下反應一段時間；

2)將反應后溶液進行減壓濃縮，將濃縮物滴入冰水中，抽濾收集水中析出的固體并用蒸餾水洗滌3次，所得固體用四氫呋喃或乙醇進行重結晶，即得到(PTX)₂-伐普肽-固相合成樹脂；

3)目標產物(PTX)₂-伐普肽偶合物從固相合成樹脂上解離反應步驟如下：將干燥的樹脂加入質量分數為5％-20％的三氟乙酸的三氯甲烷溶液中，攪拌2小時后過濾，過濾物再用三氯甲烷洗滌過濾；

4)目標產物純化步驟如下：合并上述濾液后減壓濃縮，濃縮物用溶劑萃取，抽濾收集溶劑不溶的固體，干燥后得到純凈的目標產物(PTX)₂-伐普肽偶合物。

進一步，所述操作方法中，所述步驟1)中高效偶合試劑為：HOBt、DCC、MMF按一定比例的混合溶劑，其中V_DCC:V_HOBt:V_MMF＝(3:2:1)-(8:6:1)。

進一步，所述操作方法中，所述步驟1)中反應條件如下：反應溫度為：(25-40)℃，攪拌速度為：(500-1000)r/min，攪拌時間為(25-45)min，其中最佳反應條件是：反應溫度為30℃、攪拌速度為800r/min、攪拌時間35min。

進一步，所述操作方法中，所述步驟4)中萃取溶劑為乙酸乙酯、四氫呋喃中的一種或任意比例的混合溶劑。

本發明采用的上述技術方案，具有的有益效果在于：

本發明所述的紫杉醇-伐普肽偶合物的合成方法工藝簡便，安全清潔，目標產物合成效率高。本發明產品紫杉醇伐普肽偶合物具有選擇性高、毒副作用小、水溶性好的優異性能，從根本上克服了紫杉醇存在的缺點，很好的達到紫杉醇細胞毒性與伐普肽在癌細胞表面受體的高選擇性的優勢互補，提高了藥效，其具有的水溶性為劑型制備及給藥方式提供了更多選擇。本發明所述的紫杉醇伐普肽偶合物，患者用藥后，將濃集于腫瘤部位，更有效地提高抗癌效率。本發明制備的紫杉醇伐普肽偶合物為癌癥治療指明了方向，新型靶向抗癌藥物將成為未來與癌癥抗爭的新型武器。

說明書附圖

附圖1中間體PTX-Linker的化學合成工藝流程圖。

附圖2 PTX-1-伐普肽偶合物的化學合成工藝流程圖。

附圖3 PTX-5-伐普肽偶合物的化學合成工藝流程圖。

附圖4(PTX)₂-伐普肽偶合物的化學合成工藝流程圖。

附圖5紫杉醇-伐普肽偶合物的總體合成工藝流程圖。

附圖6實施例2-5產物及PTX濃度及培養時間對A549細胞增值抑制率的影響。

具體實施方式

實施例1紫杉醇-2’-丁二酸酯的合成

紫杉醇(2.562g，3.0mmol)溶于無水二氯甲烷(40ml)，加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP，4.0mol)，丁二酸酐(0.600g，6.0mmol)，于0℃攪拌26小時后，加入乙酸乙酯400ml，并用鹽酸(1.2mol/L)調至pH3-4，依次用60ml的飽和食鹽水萃取3次，80ml的蒸餾水洗滌3次，用無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓回收乙酸乙酯。所得殘余物用丙酮-乙醚重結晶，得到紫杉醇-2’-丁二酸酯純品2.436g，收率85.1％。HPLC：9.50min，質譜分析：MS：954.3[M+H]⁺，Mw：953.99(C₅₁H₅₅NO₁₇)。

實施例2 PTX-1-伐普肽偶合物的合成

將與固相合成樹脂NH₂-Rink-Linker-Resin相連，用-Trt基團保護的巰基(-SH)在I₂/DIEA條件下可在固相合成樹脂上形成分子內二硫鍵，側鏈保護Lys⁵-端氨基受保護、N-端氨基游離的伐普肽樹脂(含有伐普肽0.15mmol)置于固相合成反應器中，加入DMAP/N,N-二甲基甲酰(質量比為2:5)，再用無水二氯甲烷浸洗后抽取溶劑并通入干燥氮氣，將紫杉醇-2’-丁二酸酯(0.5445g，0.6mmol)溶于無水二氯甲烷(25ml)，加入DMC(0.162g，1.8mmol)，HOBt(0.234g，0.45mmol)，DIC(0.252g，2.0mmol)，DIEA(0.0585g，0.45mmol)，低速攪拌30min，滴入上述固相合成反應器中并用干燥氮氣進行攪拌，在攪拌速度為700r/min、反應溫度為35℃的條件下反應0.5h，再將反應溶液中的溶劑減壓濃縮，抽干溶劑，將過濾后物質依次用10ml二氯甲烷洗滌5次，5ml乙醚洗滌3次，5ml的二甲基甲酰胺洗滌6次后減壓濃縮，除去多余溶劑，將干燥的樹脂加入到40ml質量分數為3％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，攪拌2.0小時后過濾，將樹脂再用15ml的二氯甲烷洗滌并過濾3次，濾液合并后減壓抽干，殘余物用15ml的乙醚洗滌3次，抽濾收集乙醚不溶的固體，干燥后即得紫杉醇-2’-丁二酰-伐普肽偶合物純品即PTX-1-伐普肽偶合物，收率達到95.8％。HPLC：18.47min，MS：2068.4[M+H]⁺，Mw：2067.36(C₁₀₈H₁₂₃N₁₃O₂₅)。

實施例3 PTX-5-伐普肽偶合物的合成

將與固相合成樹脂NH₂-Rink-Linker-Resin相連，用-Trt基團保護的巰基(-SH)在I₂/DIEA條件下可在固相合成樹脂上形成分子內二硫鍵，在Pd[P(C₆H₅)₃]₄/C₆H₅SiH₃條件下選擇性脫除烯丙甲酯基，得到側鏈N-端氨基受保護、Lys⁵-端氨基游離的伐普肽樹脂(含有伐普肽0.2mmol)，將其置于固相合成反應器中，用無水三氯甲烷浸洗后抽取溶劑并通入干燥氮氣。將紫杉醇-2’-丁二酸酯(3.632g，4.0mmol)溶于無水二氯甲烷(200ml)，加入BOP(4.80mmol)，N,N-二甲基甲酰胺(0.472g，6.40mmol)，并攪拌20分鐘后，滴入上述固相合成反應器中并用干燥氮氣進行攪拌。2.0小時后將溶劑抽干，將樹脂依次用80ml的二甲基甲酰胺洗滌6次，100ml乙醚洗滌3次，180ml二氯甲烷洗滌5次后減壓濃縮，抽干多余溶劑。將干燥的樹脂加入350ml的質量分數為5％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，在溫度為23℃，攪拌速度為500r/min的條件下，攪拌反應1.5小時后過濾，將過濾物用250ml的二氯甲烷洗滌并過濾3次，合并上述濾液后減壓抽干，殘余物用250ml的四氫呋喃洗滌3次，抽濾收集四氫呋喃不溶的固體，干燥后即得到目標產品：紫杉醇-2’-丁二酰-伐普肽偶合物純品即PTX-5-伐普肽偶合物，收率達到95.9％。HPLC：18.59min，MS：2068.4[M+H]⁺，Mw：2067.36(C₁₀₈H₁₂₃N₁₃O₂₅)。

實施例4(PTX)₂-伐普肽偶合物的液相合成

PTX-5-伐普肽偶合物0.207g(0.1mmol)加入無水二甲基甲酰胺6ml。將紫杉醇-2’-丁二酸酯(0.114mg，0.12mmol)溶于DIEA(8ml)加入4ml的HOBt，3ml的DCC，1.0mlMMF攪拌12min后滴入上述溶液。在反應溫度為24℃、攪拌速度為400r/min的條件下，反應0.5小時，將反應后的溶液減壓濃縮除去DIEA，將殘余物滴入100ml的冰水中，抽濾收集水中析出的固體并用30ml的蒸餾水洗滌3次。所得固體用四氫呋喃重結晶，得(PTX)₂-伐普肽偶合物純品0.283g，收率為94.2％。HPLC：23.25min，MS：3004.3[M+H]⁺，Mw：3003.29(C₁₅₉H₁₇₆N₁₄O₄₁)。

實施例5(PTX)₂-伐普肽偶合物的固相合成

將伐普肽-Lys⁵(PTX-Linker-NH)-固相合成樹脂(含有伐普肽0.20mmol)溶于24ml的無水二氯甲烷后加入固相合成反應器中，再加入4mlHOBt、5mlDCC、1mlMMF的混合溶劑，室溫攪拌，不斷滴加紫杉醇-2’-丁二酸酯(PTX-Linker，0.34g，0.36mol)，在反應溫度為35℃、攪拌速度為900r/min的條件下攪拌反應0.5小時，進行減壓蒸餾，將殘余物滴入300ml冰水中，抽濾收集水中析出的固體并用80ml蒸餾水洗滌3次，所得固體用100ml乙醇重結晶后，加入80ml質量分數為5％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液，攪拌1.2h后過濾，再用40ml無水二氯甲烷洗滌過濾，濾液合并后減壓濃縮，殘余物用160ml乙醚洗滌3次，抽濾收集溶劑不溶的固體，干燥得到純凈的目標產物0.826g，收率為94.5％。HPLC：23.35min，MS：3004.16[M+H]⁺，Mw：3003.29(C₁₅₉H₁₇₆N₁₄O₄₁)。

生物活性實施例

實施例6實施例5產物的細胞毒性試驗

實驗方法：

應用Cell Counting Kit-8試劑(簡稱CCK-8法)檢測實施例4制備(PTX)₂-伐普肽偶合物的對人非小細胞肺癌A549細胞的增殖抑制作用。CCK-8試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

實驗結果：

本實驗測試了實施例5制備的(PTX)₂-伐普肽偶合物對人非小細胞肺癌A549細胞的增殖抑制作用。實驗結果如下圖所示，(PTX)₂-伐普肽偶合物對人非小細胞肺癌A549細胞表現出很強的細胞增殖抑制作用，IC50值約為14.75nM。

實驗結論：

(PTX)₂-伐普肽偶合物能明顯抑制人非小細胞肺癌A549細胞細胞的增殖，其IC50為14.75nM，說明(PTX)₂-伐普肽偶合物對人非小細胞肺癌A549細胞具有明顯的細胞毒性作用。

實施例7實施例4產物的SD大鼠急性毒性試驗

實驗動物：SD大鼠24只，雌雄各半，體重140-160g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可號：SCXK(京)2012-0001，飼養于IVC獨立送回風系統中，試驗動物質量合格證號：11400700146158；

劑量選擇及受試物給與方式：尾靜脈注射；按照成人70kg計算，臨床最大用藥量為0.0286mg/kg，根據人與大鼠等效據體表面積換算大鼠等效臨床劑量約為0.1716mg/kg；先將SD大鼠隨機分為5組，測試組每組5只SD大鼠，依次分別設定SD大鼠給藥劑量為：2500mg/kg、833mg/kg、4000mg/kg、5000mg/kg；空白對照組為4只SD大鼠，注射等體積生理鹽水進行對比試驗。其中試驗組動物每次靜脈注射不同濃度劑量藥物后觀察SD大鼠狀態，并確定下次劑量的選擇。

實驗方法：先配制指定濃度的溶液，稱取一定質量的受試物，在超凈工作臺內置入10ml無菌離心管中，然后加入一定體積的0.9％氯化鈉注射液，振搖后約1min左右，可見受試物充分溶解，溶液呈澄明透亮，得到指定濃度的受試物溶液。對給藥SD大鼠進行稱重，按照10ml/kg給藥體積給指定濃度的上述溶液，給藥后連續觀察1h未見明顯異常癥狀，連續觀察21d，動物一般狀態良好。

注射前16小時禁食不禁水，注射完畢2小時后喂食。按分組情況，分別給每組大鼠尾部靜脈注射相應偶合物及相應濃度的樣本或0.9％生理鹽水1次，進針后緩慢推注，用時80s-100s。

實驗結論：FPSDM-TP-5偶合物SD大鼠單次靜脈注射給藥急性毒性研究結果表明：833mg/kg劑量(相等于人臨床最大用藥量的29130倍和大鼠等效臨床劑量的4850倍)動物一般狀態良好；2500、4000和5000mg/kg劑量(分別相等于臨床最大用藥劑量的87410、

139860、174830倍，相等于大鼠等效臨床劑量的14570、23310、29140倍)的實施例4的產物可引起SD大鼠呼吸急促、俯臥、呼吸困難、豎毛等異常癥狀，上述異常癥狀藥后30min左右基本恢復正常；不同劑量給藥動物連續觀察21d，存活率為100％；證實靜脈注射高劑量的或者更高劑量的本品可引起SD大鼠的耐受，該受試物應無嚴重急性中毒的危險性，說明了該受試物FPSDM-TP-5偶合物的毒性較小。

實施例8實施例2-5產物及PTX對A549細胞增殖的影響

原料準備：將實施例2-5產物：

PTX-1-伐普肽偶合物、PTX-5-伐普肽偶合物、(PTX)₂-伐普肽偶合物與紫杉醇(PTX)分別溶解于無水乙醇，保持于-20℃待用。

細胞培養：A549細胞用含10％小牛血清的1640培養液置于含5％CO₂的37℃培養箱中培養，布滿培養瓶時，用0.05％的胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化為單細胞懸液后傳代，2-3次/周。

實驗操作：將PTX、PTX-1-伐普肽偶合物、PTX-5-伐普肽偶合物、(PTX)₂-伐普肽偶合物溶解于無水乙醇，保持于-20℃待用。

將A549細胞接種于96孔板，每孔4000個細胞，培養24h后加入不同濃度的藥物作用不同時間。藥物處理組，每種藥物設3個濃度：1、100、1000nmol/L，同時設空白調零孔及對照孔，每組7孔。分別加入上述不同濃度的DTX、DTX-VRT及2DTX-VRT分別培養24h、72h后棄上清夜，加入10％小牛血清的1640培養液200μL，并加入相同體積的5.0mg/mLMTT溶液，在37℃條件下繼續孵育4h，吸棄孔內培養上清液，每孔加入相同體積的DMSO，震蕩30min。用酶標儀測儀在490nm波長處測定吸光度A值。增殖抑制率＝[1-(A_實驗-A_空白)/(A_對照-A_空白)]。

統計學處理:數據的表達采用表示，采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，數據比較采用t檢驗，以P<0.05為有顯著性差異。

實驗結果及分析：由附圖7可知，PTX及其偶合物細胞毒性的濃度依賴性。在相同培養時間條件下，A549細胞的增殖抑制率隨著PTX及其偶合物濃度的增加逐漸升高。在藥物濃度大于1nmol/L的條件下，采用相同濃度藥物培養A549細胞相同時間時，(PTX)₂-伐普肽偶合物培養的細胞增殖抑制率高于另外兩種物質，具有顯著性差異(P<0.05)。

由圖7可知，PTX及其偶合物細胞毒性的時間依懶性。1nmol/L的PTX作用72h后，A549細胞增殖抑制率升高，有顯著性差異(P<0.05)。1nmol/L的兩種偶合物作用72h后，A549細胞增殖抑制率無明顯變化。延長100nmol/L、1000nmol/L PTX及其偶合物作用時間從24h至72h，A549細胞增殖抑制率升高，有顯著性差異(P<0.05)。

以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，所作出了任何修改、等同替換、改進等，都應視為屬于本發明的保護范圍。