本發明屬于發酵技術領域，特別是涉及一種利用灰色鏈霉菌發酵生產阿維菌素的培養基。
背景技術：
阿維菌素是由日本北里大學大村智等和美國Merck公司首先開發的一類具有殺蟲、殺螨、殺線蟲活性的十六元大環內酯化合物，由鏈霉菌中灰色鏈霉菌Streptomyces avermitilis發酵產生。天然阿維菌素中含有8個組分，主要有4種即A1a、A2a、B1a和B2a，其總含量≥80%；對應的4個比例較小的同系物是A1b、A2b、B1b和B2b，其總含量≤20%。其中B1a為主要殺蟲成分，故而阿維菌素含量以B1a的含量來標定。阿維菌素具有農 、牧、醫三用的特點。有很強的驅蟲、殺蟲活性，是世界上目前最有效的殺寄生蟲劑、殺螨蟲劑和殺昆蟲劑。阿維菌素在自然條件下容易降解,對人畜安全,對天敵影響小,屬于綠色生物農藥。
目前，國內阿維菌素的發酵生產采用三級發酵模式，存在的主要問題有以下幾點：
1 發酵單位低，一般較好水平在5500u/ml左右。阿維菌素發酵前期，起步效價低，發酵后期，產素能力弱，效價增幅小，影響發酵效價總體放罐水平。
2發酵周期長，一般在240h左右，導致能耗較高，增加了生產成本。
技術實現要素：
本發明的目的就在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種利用灰色鏈霉菌發酵生產阿維菌素的培養基，包括二級種子培養基，發酵中、后期補料培養基，通過提供適宜的二級種子培養基，發酵中、后期補料培養基，提高菌種活力，促進菌絲生長和代謝，有效提高發酵單位，縮短發酵周期，降低生產成本。
為實現上述目的所采取的技術方案為：
一種利用灰色鏈霉菌發酵生產阿維菌素的培養基，包括二級種子培養基及補料培養基，其特征在于所述二級種子培養基組成為：玉米淀粉26～32g/L、發酵豆粕10～13g/L、酵母粉10g/L、玉米漿16～20g/L、硫酸銨0.8～1.2g/L、氯化鈷0.025～0.027 g/L、鉬酸銨0.04～0.08g/L、乳酸鋅0.02～0.06g/L、磷酸二氫鉀0.3～0.7g/L、輕質碳酸鈣2～6g/L、糖化酶0.05～0.09g/L、聚醚改性硅0.008～0.012g/L。
所述補料培養基是由發酵中期補料培養基和發酵后期補料培養基組成，其中
發酵中期補料培養基組成為：質量濃度為45%的玉米淀粉液化糖900～1200g/L、硫酸銨38～42g/L、大豆蛋白胨15～19g/L；
發酵后期補料培養基組成為：質量濃度為45%的玉米淀粉液化糖160～180g/L、大豆蛋白胨12～16g/L。
所述發酵豆粕質量指標為內含70%生物活性小肽和50-55%粗蛋白。
所述乳酸鋅質量符合Q/LST001-2004標準。
所述二級種子培養基滅菌后的質量要求為：氨基氮60～80mg/100ml、溶磷70～90ug/ml、總糖3.2～3.5g/100ml、pH6.5～7.5。
所述發酵中期是指發酵90～180h,發酵后期是指發酵181h～放罐。
本發明的技術優勢：
1 本發明確認了利用灰色鏈霉菌發酵生產阿維菌素的二級種子培養基的碳源、氮源最佳配伍比例。
2 本發明二級種子培養基中使用了發酵豆粕、乳酸鋅，提高菌種活力，促進菌絲生長和代謝，有效提高發酵單位，進而提高二級種子液質量，有利于提高發酵起步效價。
3本發明在發酵中、后期進而補料，且補料培養基中使用了大豆蛋白胨，該大豆蛋白胨中富含氨基酸，尤其含有頡氨酸、色氨酸，有利于阿維菌素生物合成，提高B1a組份含量。
4采用本發明的培養基生產阿維菌素，最終使得阿維菌素發酵單位（發酵罐186m3）達到6200u/ml以上，同國內技術相比，發酵單位提高了18.2%以上；發酵周期控制在230h以內。
具體實施方法
下面用實例予以說明本發明，應該理解的是，實例是用于說明本發明而不是對本發明的限制。本發明的范圍與核心內容依據權利要求書加以確定。
下述實施例的菌種選用二級種子液的質量要求為：菌體濃度35～40%、pH值6.8～7.6，移種比例為1:0.10～0.12（V/V）。
發酵培養工藝：
發酵溫度：28±0.5℃；空氣流量1300-1800m3/h；攪拌轉速100-120r/min；pH控制在6.2-6.5，菌體濃度25-35%。
發酵補料工藝：
發酵PH6.2～6.4，糖濃度1.0～3.0g/100ml，氨基氮30～60mg/100ml。
發酵培養結束要求：
阿維菌素發酵單位達到6000u/以上，發酵周期控制在230h以內。
實施例1
一級種子培養：種子培養基有效體積2m3。
種子培養基：玉米淀粉60kg、黃豆餅粉16kg、花生餅粉70kg、酵母浸膏8kg、氯化鈷0.06 kg、α-淀粉酶0.08kg。
首先，將一級種子培養基121℃滅菌，保壓30分鐘，冷卻至25℃，用無菌空氣保壓，一級種子培養基滅菌后的質量要求為：氨基氮42mg/100ml、總糖2.8g/100ml、pH7.2。然后在火焰保護下，將已經培養好的灰色鏈霉素母瓶發酵液按照0.1L的接種量接入一級種子培養基中進行種子培養，一級種子培養條件為：罐壓0.03～0.05MPa；罐溫28±0.5℃；空氣流量180m3/h；攪拌轉速160r/min。至菌體濃度25.2%、pH值6.6，培養時間33h移種。
二級種子培養：二級種子培養基體積21m3。
玉米淀粉546kg、發酵豆粕210kg、酵母粉210、玉米漿336kg、硫酸銨16.8kg、氯化鈷0.525kg、鉬酸銨0.84kg、乳酸鋅0.42kg、磷酸二氫鉀6.3kg、輕質碳酸鈣42kg、糖化酶1.05kg、聚醚改性硅0.168kg。
二級種子培養：首先將二級種子培養基121℃滅菌，保壓30分鐘，冷卻至25℃，用無菌空氣保壓，二級種子培養基滅菌后的質量要求為：氨基氮62mg/100ml、總糖3.3g/100ml、pH6.9。然后，用壓差法將培養好的一級種子接入二級種子培養基中進行種子培養，移種比例為10%（V/V），二級種子培養條件為：罐壓0.03～0.05MPa；空氣流量150m3/h；攪拌轉速120r/min；至菌體濃度35%、pH值6.8、培養時間20h后停止二級種子培養。
發酵培養：發酵培養基有效體積140m3。
玉米淀粉19600kg、高溫黃豆粉3500kg、酵母粉1400kg、氯化鈷28kg、硫酸錳0.336kg、鉬酸鈉3.22kg、淀粉酶5.6kg、輕質碳酸鈣42kg、聚醚改性硅140kg、磷酸二氫鉀30kg。
發酵中期補料培養基：7m3。
45%（w/w）液糖6300kg、硫酸銨266kg、大豆蛋白胨105kg。
補料從發酵90h起至180h，殘糖低于1.0g/100ml起補入，間隔4小時補入，補加量300L/h。
發酵后期補料培養基：4m3。
45%（w/w）液糖640kg、大豆蛋白胨48kg。
補料從發酵181h起至放罐前8小時，殘糖低于1.0g/100ml起補入，間隔4小時補入，補加量300L/h。
二級種子液的質量結果：菌體濃度35.6%、pH值6.84，移種量為14.7m3。
發酵過程中，發酵溫度28±0.5℃；空氣流量1300-1800m3/h；攪拌轉速100-120r/min；pH控制在6.2-6.5，菌體濃度25-35%。
發酵培養結束，阿維菌素發酵單位6120u/ml，發酵周期226h。
實施例2
一級種子培養：種子培養基有效體積2m3。
種子培養基：玉米淀粉60kg、黃豆餅粉16kg、花生餅粉70kg、酵母浸膏8kg、氯化鈷0.06 kg、α-淀粉酶0.08kg。
首先，將一級種子培養基121℃滅菌，保壓30分鐘，冷卻至25℃，用無菌空氣保壓，一級種子培養基滅菌后的的質量要求為：氨基氮42mg/100ml、總糖2.8g/100ml、pH7.2。然后在火焰保護下，將已經培養好的灰色鏈霉素母瓶發酵液按照0.1L的接種量接入一級種子培養基中進行種子培養，一級種子培養條件為：罐壓0.03～0.05MPa；罐溫28±0.5℃；空氣流量180m3/h；攪拌轉速160r/min。至菌體濃度24.6%、pH值6.7、培養時間31h移種。
二級種子培養：二級種子培養基體積21m3。
玉米淀粉588kg、發酵豆粕231kg、酵母粉210、玉米漿358kg、硫酸銨18.9kg、氯化鈷0.546kg、鉬酸銨1.05kg、乳酸鋅0.63kg、磷酸二氫鉀8.4kg、輕質碳酸鈣63kg、糖化酶1.26kg、聚醚改性硅0.189kg。
二級種子培養：首先將二級種子培養基121℃滅菌，保壓30分鐘，冷卻至25℃，用無菌空氣保壓，二級種子培養基滅菌后的質量要求為：氨基氮68mg/100ml、總糖3.4g/100ml、pH7.1。然后，用壓差法將培養好的一級種子接入二級種子培養基中進行種子培養，移種比例為10%（V/V），二級種子培養條件為：罐壓0.03～0.05MPa；空氣流量150m3/h；攪拌轉速120r/min；至菌體濃度35%、pH值6.8、培養時間20h后停止二級種子培養。
發酵培養：發酵培養基有效體積140m3。
玉米淀粉19600kg、高溫黃豆粉3500kg、酵母粉1400kg、氯化鈷28kg、硫酸錳0.336kg、鉬酸鈉3.22kg、淀粉酶5.6kg、輕質碳酸鈣42kg、聚醚改性硅140kg、磷酸二氫鉀30kg。
發酵中期補料培養基：7m3。
45%（w/w）液糖7000kg、硫酸銨273kg、大豆蛋白胨112kg。
補料從發酵90h起至180h，殘糖低于1.0g/100ml起補入，間隔4小時補入，補加量300L/h
發酵后期補料培養基：4m3。
45%（w/w）液糖680kg、大豆蛋白胨52kg。
補料從發酵181h起至放罐前8小時，殘糖低于1.0g/100ml起補入，間隔4小時補入，補加量300L/h。
二級種子液的質量結果：菌體濃度36.8%、pH值6.91，移種量為15.5m3。
發酵過程中，發酵溫度28±0.5℃；空氣流量1300-1800m3/h；攪拌轉速100-120r/min；pH控制在6.2-6.5，菌體濃度25-35%。
發酵培養結束，阿維菌素發酵單位6320u/ml，發酵周期224h。
實施例3
一級種子培養：種子培養基有效體積2m3。
種子培養基：玉米淀粉60kg、黃豆餅粉16kg、花生餅粉70kg、酵母浸膏8kg、氯化鈷0.06 kg、α-淀粉酶0.08kg。
首先，將一級種子培養基121℃滅菌，保壓30分鐘，冷卻至25℃，用無菌空氣保壓，一級種子培養基滅菌后的的質量要求為：氨基氮42mg/100ml、總糖2.8g/100ml、pH7.2。然后在火焰保護下，將已經培養好的灰色鏈霉素母瓶發酵液按照0.1L的接種量接入一級種子培養基中進行種子培養，一級種子培養條件為：罐壓0.03～0.05MPa；罐溫28±0.5℃；空氣流量180m3/h；攪拌轉速160r/min。至菌體濃度26.4%、pH值6.9、培養時間34h移種。
二級種子培養：二級種子培養基體積21m3。
玉米淀粉630kg、發酵豆粕252kg、酵母粉210、玉米漿378kg、硫酸銨21kg、氯化鈷0.567kg、鉬酸銨1.26kg、乳酸鋅0.84kg、磷酸二氫鉀10.5kg、輕質碳酸鈣84kg、糖化酶1.47kg、聚醚改性硅0.21kg。
二級種子培養：首先將二級種子培養基121℃滅菌，保壓30分鐘，冷卻至25℃，用無菌空氣保壓，二級種子培養基滅菌后的質量要求為：氨基氮71mg/100ml、總糖3.5g/100ml、pH7.2。然后，用壓差法將培養好的一級種子接入二級種子培養基中進行種子培養，移種比例為10%（V/V），二級種子培養條件為：罐壓0.03～0.05MPa；空氣流量150m3/h；攪拌轉速120r/min；至菌體濃度35%、pH值6.8、培養時間20h后停止二級種子培養。
發酵培養：發酵培養基有效體積140m3。
玉米淀粉19600kg、高溫黃豆粉3500kg、酵母粉1400kg、氯化鈷28kg、硫酸錳0.336kg、鉬酸鈉3.22kg、淀粉酶5.6kg、輕質碳酸鈣42kg、聚醚改性硅140kg、磷酸二氫鉀30kg。
發酵中期補料培養基：7m3。
45%（w/w）液糖7700kg、硫酸銨280kg、大豆蛋白胨119kg。
補料從發酵90h起至180h，殘糖低于1.0g/100ml起補入，間隔4小時補入，補加量300L/h。
發酵后期補料培養基：4m3。
45%（w/w）液糖720kg、大豆蛋白胨56kg。
補料從發酵181h起至放罐前8小時，殘糖低于1.0g/100ml起補入，間隔4小時補入，補加量300L/h。
二級種子液的質量結果：菌體濃度37.1%、pH值6.95，移種量為16.2m3。
發酵過程中，發酵溫度28±0.5℃；空氣流量1300-1800m3/h；攪拌轉速100-120r/min；pH控制在6.2-6.5，菌體濃度25-35%。
發酵培養結束，阿維菌素發酵單位6330u/ml，發酵周期228h。
實施例4
一級種子培養：種子培養基有效體積2m3。
種子培養基：玉米淀粉60kg、黃豆餅粉16kg、花生餅粉70kg、酵母浸膏8kg、氯化鈷0.06 kg、α-淀粉酶0.08kg。
首先，將一級種子培養基121℃滅菌，保壓30分鐘，冷卻至25℃，用無菌空氣保壓，一級種子培養基滅菌后的的質量要求為：氨基氮42mg/100ml、總糖2.8g/100ml、pH7.2。然后在火焰保護下，將已經培養好的灰色鏈霉素母瓶發酵液按照0.1L的接種量接入一級種子培養基中進行種子培養，一級種子培養條件為：罐壓0.03～0.05MPa；罐溫28±0.5℃；空氣流量180m3/h；攪拌轉速160r/min。至菌體濃度27.5%、pH值7.30、培養時間33h移種。
二級種子培養：二級種子培養基體積21m3。
玉米淀粉672kg、發酵豆粕273kg、酵母粉210、玉米漿400kg、硫酸銨23.1kg、氯化鈷0.546kg、鉬酸銨1.47kg、乳酸鋅1.05kg、磷酸二氫鉀1.26kg、輕質碳酸鈣105kg、糖化酶1.68kg、聚醚改性硅0.231kg。
二級種子培養：首先將二級種子培養基121℃滅菌，保壓30分鐘，冷卻至25℃，用無菌空氣保壓，二級種子培養基滅菌后的質量要求為：氨基氮75mg/100ml、總糖3.4g/100ml、pH7.4。然后，用壓差法將培養好的一級種子接入二級種子培養基中進行種子培養，移種比例為10%（V/V），二級種子培養條件為：罐壓0.03～0.05MPa；空氣流量150m3/h；攪拌轉速120r/min；至菌體濃度35%、pH值6.8、培養時間20h后停止二級種子培養。
發酵培養：發酵培養基有效體積140m3。
玉米淀粉19600kg、高溫黃豆粉3500kg、酵母粉1400kg、氯化鈷28kg、硫酸錳0.336kg、鉬酸鈉3.22kg、淀粉酶5.6kg、輕質碳酸鈣42kg、聚醚改性硅140kg、磷酸二氫鉀30kg。
發酵中期補料培養基：7m3。
45%（w/w）液糖8400kg、硫酸銨287kg、大豆蛋白胨126kg。
補料從發酵90h起至180h，殘糖低于1.0g/100ml起補入，間隔4小時補入，補加量300L/h。
發酵后期補料培養基：4m3。
45%（w/w）液糖660kg、大豆蛋白胨60kg。
補料從發酵181h起至放罐前8小時，殘糖低于1.0g/100ml起補入，間隔4小時補入，補加量300L/h。
二級種子液的質量結果：菌體濃度39.2%、pH值7.25，移種量為16.5m3。
發酵過程中，發酵溫度28±0.5℃；空氣流量1300-1800m3/h；攪拌轉速100-120r/min；pH控制在6.2-6.5，菌體濃度25-35%。
發酵培養結束，阿維菌素發酵單位6260u/ml，發酵周期227h。
實施例5
一級種子培養：種子培養基有效體積2m3。
種子培養基：玉米淀粉60kg、黃豆餅粉16kg、花生餅粉70kg、酵母浸膏8kg、氯化鈷0.06 kg、α-淀粉酶0.08kg。
首先，將一級種子培養基121℃滅菌，保壓30分鐘，冷卻至25℃，用無菌空氣保壓，一級種子培養基滅菌后的的質量要求為：氨基氮42mg/100ml、總糖2.8g/100ml、pH7.2。然后在火焰保護下，將已經培養好的灰色鏈霉素母瓶發酵液按照0.1L的接種量接入一級種子培養基中進行種子培養，一級種子培養條件為：罐壓0.03～0.05MPa；罐溫28±0.5℃；空氣流量180m3/h；攪拌轉速160r/min。至菌體濃度26.1%、pH值6.8、培養時間34h移種。
二級種子培養：二級種子培養基體積21m3。
玉米淀粉609kg、發酵豆粕252kg、酵母粉210、玉米漿378kg、硫酸銨21kg、氯化鈷0.546kg、鉬酸銨1.26kg、乳酸鋅0.84kg、磷酸二氫鉀10.5kg、輕質碳酸鈣84kg、糖化酶1.47kg、聚醚改性硅0.21kg。
二級種子培養：首先將二級種子培養基121℃滅菌，保壓30分鐘，冷卻至25℃，用無菌空氣保壓，二級種子培養基滅菌后的質量要求為：氨基氮70mg/100ml、總糖3.3g/100ml、pH7.0。然后，用壓差法將培養好的一級種子接入二級種子培養基中進行種子培養，移種比例為10%（V/V），二級種子培養條件為：罐壓0.03～0.05MPa；空氣流量150m3/h；攪拌轉速120r/min；至菌體濃度35%、pH值6.8、培養時間20h后停止二級種子培養。
發酵培養：發酵培養基有效體積140m3。
玉米淀粉19600kg、高溫黃豆粉3500kg、酵母粉1400kg、氯化鈷28kg、硫酸錳0.336kg、鉬酸鈉3.22kg、淀粉酶5.6kg、輕質碳酸鈣42kg、聚醚改性硅140kg、磷酸二氫鉀30kg。
發酵中期補料培養基：7m3。
45%（w/w）液糖7350kg、硫酸銨294kg、大豆蛋白胨133kg。
補料從發酵90h起至180h，殘糖低于1.0g/100ml起補入，間隔4小時補入，補加量300L/h。
發酵后期補料培養基：4m3。
45%（w/w）液糖700kg、大豆蛋白胨64kg。
補料從發酵181h起至放罐前8小時，殘糖低于1.0g/100ml起補入，間隔4小時補入，補加量300L/h。
二級種子液的質量結果：菌體濃度38.7%、pH值7.10，移種量為16.2m3。
發酵過程中，發酵溫度28±0.5℃；空氣流量1300-1800m3/h；攪拌轉速100-120r/min；pH控制在6.2-6.5，菌體濃度25-35%。
發酵培養結束，阿維菌素發酵單位6350u/ml，發酵周期226h。