本發明涉及一種自旋標記駱駝寧堿A化合物，以及這種化合物的制備方法和其在制備抗腫瘤藥物中的用途。屬于醫藥領域。
背景技術：
駱駝寧堿A是1997年從中國藥用植物駱駝蒿(Peganum nigellastrum Bunge.)中分離出的一種天然喹唑啉類生物堿。科研工作者對駱駝寧堿A的關注，主要是因為發現駱駝寧堿A與具有抗癌活性的喜樹堿有類似的化學結構，而且在體外對小鼠腫瘤細胞P388細胞系有抑制作用(IC501.8μg/mL)，并證明了它有類似喜樹堿的抑制拓撲異構酶I活性((1)Molecules,2011,16,4861-4883)。基于此，近年來科研工作者以駱駝寧堿A為先導模型，系統開展了駱駝寧堿A及其衍生物的全合成、結構優化以及抗腫瘤活性評價研究((1)Org.Biomol.Chem.,2007,5,2486–2490；(2)Bioorganic&Medicinal Chemistry,2007,15,4237–4246；(3)Tetrahedron Letters,2011,52,1592–1596；(4)Tetrahedron Letters 2004,45,6721–6723；(5)TetrahedronLetters，1998,39,9097-9098)。盡管近年來科研工作者在駱駝寧堿的衍生合成和抗腫瘤構效關系做了大量的研究工作，然而駱駝寧堿A作為一個抗腫瘤先導分子，仍存在抗腫瘤活性低和活性譜窄的問題，甚至經衍生與結構修飾后，衍生物抗腫瘤活性得不到有效改善或完全喪失。而截至目前仍未有一個有效的修飾和優化策略來改善該類分子的抗腫瘤效果。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種新的自旋標記駱駝寧堿化合物，同時，本發明的另一目的是提供這種化合物的制備方法及其在抗腫瘤藥物中的用途。
本發明所述的一種新的自旋標記駱駝寧堿化合物具有式1所示的化學結構，記為自旋標記駱駝寧堿A化合物：
近年來，大量實驗證實了穩定氮氧自由基具有明確的抗腫瘤活性，在體內外對多種腫瘤具有選擇性抑制作用，能增加化療和放療效果并降低其副作用，最令人鼓舞的是應用穩定氮氧自由基能夠長期預防和延緩腫瘤的發生而無明顯副作用，被認為是最具臨床應用潛力的領域((1)J.Heterocyclic Chem.2005,42,437～449；(2)FreeRadic.Biol.&Med.2007,42,1632～1650.)。特別是將穩定氮氧自由基標記于抗腫瘤藥物分子中以改善其藥效學特性成為其優化設計抗腫瘤藥物的一種重要策略(Pure&Appl.Chem.1990,62,289～294.)。穩定氮氧自由基標記(或稱為自旋標記)的噻替哌、亞硝基脲、氮芥、順鉑類烷化劑(Acta Pharm.Sin.1988,23,792～798)；鬼臼毒素類似物((1)Anticancer Drug Des.1993,8,193～202；(2)Europ.J.Med.Chem.2014,75,282～288)、5-氟脲嘧啶(高等學校化學學報，1992，13，1561～1563.)、阿霉素(高等學校化學學報，2000，21，884～887)、魚藤酮(Bioorg.Med.Chem.Lett.2012,22,920～923)以及CA-4(Bioorg.Med.Chem.2013,21,1248～1256)等抗腫瘤分子被大量衍生合成，其藥理活性評價表明：一些穩定氮氧自由基能迅速穿越細胞膜和血腦屏障，將其作為載體與一些抗癌藥物相連，能促使運載藥物優先穿過細胞膜，易于積累于腫瘤組織中，從而使其藥物的抗癌活性保持甚至增加，使母體藥物能更好發揮抗腫瘤活性。
據此，為了提高駱駝寧堿A的抗腫瘤活性，以現有駱駝寧堿A的抗腫瘤構效關系為線索，本發明在保留駱駝寧堿A先導結構所具有的生物相容性和類藥性基礎上,通過全合成設計了一種“嵌合”型的自旋標記駱駝寧堿A化合物，經進一步評價實驗表明本發明的這種化合物對人肺腺癌細胞(A549)、人乳腺癌細胞株(MDA-MB-468)、人卵巢癌細胞(SKOV3)和人結腸癌細株(HCT 116)4種腫瘤細胞株具有理想的抑制活性。
本發明制備方法按如下化學反應式進行：
自旋標記駱駝寧堿化合物制備方法如反應式2所示，即將鄰苯二甲酸酐1和芐胺溶于適量的冰醋酸中，加熱回流獲得中間體2，然后將中間體2溶于適量的二甲苯中，惰性氣體保護下在60～70℃之間下在前述液體內緩慢加入甲基碘化鎂，再將反應液逐漸加熱至165℃～180℃回流反應2小時，反應結束后在此溫度下減壓蒸除大部分溶劑，然后冷卻至室溫，向其中加入大量石油醚得渾濁液，將其通過硅藻土抽濾，收集所有濾液，將濾液置于空氣中24小時后再用堿性氧化鋁進行層析，經濃縮后得到產物3，再在產物3中加入20～30毫升的冰醋酸使其溶解，然后加入10％的鈀碳，攪拌均勻后將反應體系在4個大氣壓的惰性氣體保護下進行充分反應，將反應液固液分離后濃縮得到淡黃色中間產品4，將中間體4溶于50毫升的甲醇/乙腈＝14/1(體積比)中，然后依次加入碳酸氫鈉(15eq)，二水合鎢酸鈉(0.55eq)，最后加入30％(體積比)的雙氧水溶液，此渾濁反應液在常溫下充分攪拌反應，反應結束后加入少量水淬滅反應，除去溶劑，加入適量的水和1N的硫酸溶液進行萃取，合并有機相，以硫酸鎂干燥過濾后，減壓濃縮后得到黃色產品5，在冰浴條件下在中間體5中緩慢，將加入濃硫酸并攪拌，在冰浴條件下攪拌30分鐘后將其置于60℃的油浴中反應20分鐘，然后再將其置于冰浴中，將發煙硝酸逐滴加入到上述溶液中，滴加完畢后，在冰浴條件下攪拌反應30分鐘后再常溫下攪拌過夜，次日，將此橘紅色反應液加熱至100℃反應20分鐘，然后置于冰浴中，將10％(質量比)的氫氧化鈉溶液緩慢加入其中調節pH值至8左右，用氯仿將其進行萃取，合并有機相，以硫酸鎂干燥后過濾，減壓濃縮得黃色固體6，將中間體6用甲醇溶解，再在其中加入10％的干鈀碳，攪拌均勻，用氫氣加壓至1個大氣壓，攪拌反應6小時，反應結束后過濾，減壓濃縮濾液得到黃色固體7，再將中間體7溶于甲醇中，然后加入醋酸銅醋酸銅(0.128eq)，常溫下攪拌反應3小時，反應結束后用氯仿淬滅反應，濃縮后得固體殘渣，以石油醚/乙酸乙酯為洗脫劑經柱層析得到淡黃色的固體純品8，將化合物9先溶于干燥的二氯甲烷當中，加入催化量的DMF，然后將草酰氯溶于30～50毫升的干燥二氯甲烷中，冰浴條件下以緩慢滴將其滴入上述反應液中，反應1.5小時后將反應液減壓濃縮得固體結晶，將其再溶于干燥二氯甲烷中，并在冰浴條件下緩慢滴入含中間體8(1.5eq)，、碳酸氫鈉(4.5eq)的30～50毫升干燥二氯甲烷溶液中反應，反應結束后加入水淬滅反應，并用氯仿萃取反應液，合并有機相，以硫酸鎂干燥過濾后減壓濃縮得固體殘渣，以氯仿/甲醇為洗脫劑經柱層析純化得到黃色固體產品10，將產物10(3.6mmol)溶于甲苯(50mL)和水(0.2mL)中，然后依次加入碳酸鉀(7.2mmol)，溴化鋰(7.2mmol)，TBAB(0.4mmol)，溴丙炔(5.7mmol)，然后將反應升溫至80℃充分反應，反應結束后將反應液減壓濃縮的固體殘渣，以氯仿/甲醇為洗脫劑經柱層析純化得到橘黃色固體產品11，將三苯基氧膦(2.75eq)溶于30～50毫升干燥二氯甲烷中，在冰浴條件下將三氟甲磺酸酐(1.38eq)溶于30～50毫升的干燥二氯甲烷中，再將溶有三氟甲磺酸酐的二氯甲烷緩慢地滴加進入溶有三苯基氧膦的二氯甲烷溶液，在零攝氏度下攪拌反應30分鐘，將中間體11溶于30～50毫升的干燥二氯甲烷中，在冰浴條件下將其緩慢滴加到溶有三氟甲磺酸酐的二氯甲烷溶液中，攪拌并充分反應，反應完畢后加入10％(體積比)的碳酸氫鈉水溶液淬滅反應，減壓濃縮后得固體殘渣，以氯仿/甲醇為洗脫劑經柱層析純化得到橘黃色目標化合物12。
經體外抗腫瘤活性篩選結果表明，與駱駝寧堿A相比，本發明所合成的自旋標記駱駝寧堿A化合物對人肺腺癌細胞(A549)、人乳腺癌細胞株(MDA-MB-468)、人卵巢癌細胞(SKOV3)和人結腸癌細株(HCT 116)表現出較強的抑制活性。因此，本發明合成的化合物可用于制備抗腫瘤的藥物。本發明所述的自旋標記駱駝寧堿A化合物結構新穎、產品純度高，對腫瘤細胞表現出較強的抑制作用，具有很好的應用前景。
以下通過具體實施方式，對本發明的上述內容做進一步的詳細說明。但不應將此理解為對本發明的限。
具體實施方式
一、本發明的自旋標記駱駝寧堿化合物的制備方法
以下是本發明的自旋標記駱駝寧堿化合物最佳制備方法：
1)中間體2的合成：將鄰苯二甲酸酐(1.69eq)置于適量的冰醋酸中，然后將芐胺(2.3eq)緩慢的加入其中。將此混合物加熱回流反應5小時后，將熱的反應液直接倒入冰水中，出現大量沉淀，抽濾后用冷水將濾餅沖洗幾遍，晾干后得化合物2(參考Chemistry–A European Journal,2009,15(47):12960-12962)，參見式6。
2)中間體3的合成：首先，將整個反應裝置抽成真空，并用氬氣置換3～5次，然后將甲基碘化鎂(6eq)用注射器打入圓底燒瓶內，將其加熱至90攝氏度，減壓抽去溶劑乙醚，直至圓底燒瓶內的液體不再冒泡為止，恢復常壓并將其降至60攝氏度。然后將中間體2(1eq)溶于適量的二甲苯中，將其用注射器緩慢地打入反應瓶內，保持反應液得溫度在60～70攝氏度之間。注射完畢后，將反應液加熱至165攝氏度回流反應2小時后，在此溫度下減壓蒸去一半溶劑；然后將反應溫度升至180攝氏度在回流反應2小時，反應結束后在此溫度下減壓蒸除大部分溶劑，然后冷卻至室溫，向其中加入大量石油醚得渾濁液，將其通過硅藻土抽濾，并用石油醚沖洗濾餅若干次，收集所有濾液，將濾液置于空氣中24小時后，溶液呈現紫羅蘭色。將此紫色有機溶劑用堿性氧化鋁進行層析，再次收集所有層析后的有機溶劑，減壓濃縮后得到最終產品，熱的狀態下呈無色油狀，冷卻后呈白色固體結晶3(參考Chemistry–A European Journal,2009,15(47):12960-12962)，參見式7。
3)中間體4的合成：將中間體3(621mg)置于高壓釜的內襯中，加入適量冰醋酸使其溶解，然后加入10％的干鈀碳(56.5mg)，攪拌均勻后將高壓釜密封，將反應體系內部用氫氣置換3～5次，最后將體系內充氫氣直到4個大氣壓為止。反應5小時后，將此反應液過濾，濾餅用二氯甲烷沖洗，將濾液減壓濃縮后溶于水中，然后用10％的氫氧化鈉溶液調節pH值到9左右，用氯仿萃取3次，合并萃取液，用硫酸鎂干燥過濾后，減壓濃縮后得到淡黃色產品4(參考Australian Journal ofChemistry,1983,36(2):397-401)，參見式8。
4)中間體5的合成：將中間體4(18.8eq)溶于適量的甲醇/乙腈＝14/1中，然后依次加入碳酸氫鈉(15eq)，二水合鎢酸鈉(0.55eq)，最后加入30％的雙氧水溶液(62eq)，此渾濁反應液在常溫下攪拌反應兩天，反應結束后加入少量水淬滅反應。減壓蒸去溶劑，加入適量的水和1N的硫酸溶液進行萃取，合并有機相，以硫酸鎂干燥過濾后，減壓濃縮后得到黃色產品5(參考Australian Journal ofChemistry,1983,36(2):397-401)，參見式9。
5)中間體6的合成：將中間體5(7.07mmol)置于圓底燒瓶中，在冰浴條件下將濃硫酸(13.5mL)緩慢滴入其中并攪拌，此時溶液呈紅褐色。在冰浴條件下攪拌半小時左右后將其置于60攝氏度的油浴中反應20分鐘，然后再將其置于冰浴中。待其冷卻至零攝氏度，將發煙硝酸(19.1mmol)逐滴加入到上述溶液中，滴加完畢后，在冰浴條件下攪拌反應30分鐘后再常溫下攪拌過夜。次日，將此橘紅色反應液加熱至100攝氏度反應20分鐘，然后置于冰浴中，將10％的氫氧化鈉溶液緩慢加入其中調節pH值至8左右。用氯仿將其進行萃取，合并有機相，以硫酸鎂干燥后過濾，減壓濃縮得黃色固體6(參考(1)Australian Journal ofChemistry,1983,36(2):397-401；(2)Bioconjugate Chemistry,2013,24(6):1110-1117)，參見式10。
6)中間體7的合成：將中間體6(6.38mmol)置于高壓釜內襯中并以適量甲醇溶解，加入10％的干鈀碳(150mg)，攪拌均勻，用氫氣將高壓釜內部置換3～5次，最終用氫氣加壓至1個大氣壓，攪拌反應6小時。反應結束后過濾，減壓濃縮濾液得到黃色固體7(參考Organic&Biomolecular Chemistry,2013,11(25):4147-4153.)，參見式11。
7)中間體8的合成：將中間體7(6.38eq)溶于適量的甲醇中，然后加入醋酸銅(0.128eq)，常溫下攪拌反應3小時。反應結束后用氯仿淬滅反應，減壓濃縮后得固體殘渣，以石油醚/乙酸乙酯為洗脫劑經柱層析得到淡黃色的固體純品8(參考(1)Organic&Biomolecular Chemistry,2013,11(25):4147-4153；(2)Journal of the American Chemical Society,1975,97(5):1273-1274)，參見式12。
8)中間體10的合成：將化合物9(3eq)先溶于干燥的二氯甲烷當中，加入催化量的DMF，然后將草酰氯(9eq)溶于適量的干燥二氯甲烷中，冰浴條件下以恒壓漏斗逐滴將其滴入上述反應液中。反應1.5小時后將反應液減壓濃縮得固體結晶，將其再溶于干燥二氯甲烷中，并將其在冰浴條件下逐滴滴入含中間體8(1.5eq)，碳酸氫鈉(4.5eq)的干燥二氯甲烷溶液中。TLC監測反應進程，反應結束后加入水淬滅反應，并用氯仿萃取反應液，合并有機相，以硫酸鎂干燥過濾后減壓濃縮得固體殘渣，以氯仿/甲醇為洗脫劑經柱層析純化得到黃色固體產品10，參見式13。
9)中間體11的合成：將中間體10(3.6mmol)溶于甲苯(50mL)和水(0.2mL)中，然后依次加入碳酸鉀(7.2mmol)，溴化鋰(7.2mmol)，TBAB(0.4mmol)，溴丙炔(5.7mmol)，然后將反應升溫至80攝氏度，反應2小時。反應結束后將反應液減壓濃縮的固體殘渣，以氯仿/甲醇為洗脫劑經柱層析純化得到橘黃色固體產品11，參見式14。
10)自旋標記的駱駝寧堿12的合成：將三苯基氧膦(2.75eq)溶于干燥的二氯甲烷中，在冰浴條件下將三氟甲磺酸酐(1.38eq)溶于適量的干燥二氯甲烷中并緩慢地滴加進入上述溶液，在零攝氏度下攪拌反應30分鐘。將中間體11(0.92eq)溶于適量的干燥二氯甲烷中，在冰浴條件下將其緩慢滴加進入上述溶液中。TLC監測反應進程，反應完畢后加入10％的碳酸氫鈉水溶液淬滅反應。減壓濃縮后得固體殘渣，以氯仿/甲醇為洗脫劑經柱層析純化得到橘黃色目標化合物12。
IR(KBr):3438,2982,1678,1628,1609,1576,1487,1468,1442,1385,1367(NO·),1239,776,694,638cm-1；MS-ESI m/z:399.2[M+2H]+；ESR:g＝2.0079.
二、自旋標記駱駝寧堿的抗腫瘤活性的試驗方法及結果
本發明的藥理實驗采用磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)比色法。腫瘤細胞培養選用10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基，將腫瘤細胞接種于96孔板，每個孔培養3-5×103個細胞，加入不同濃度的待測試目標化合物溶液。培養72小時后，每孔加入預冷的三氯乙酸溶液(50％，w/v)固定細胞，冰箱中固定30分鐘。待96孔板室溫下晾干后，每孔加入0.04％(w/v)的SRB染液(1％的乙酸配制，購自Sigma Chemical公司)，染色30分鐘后倒掉染液，用乙酸沖洗4次，去除未結合的染料，室溫晾干。用100μL非緩沖Tris-base堿液溶解與細胞蛋白結合的染料，水平搖床上振蕩20分鐘，采用ELx800吸收光酶標儀(美國Bio-Tek公司生產，操作軟件Gen5)測定515nm處吸收值。所有試驗設3個平行組或重復三次。自旋標記駱駝寧堿(12)的細胞毒活性測試結果見表1。
表1自旋標記駱駝寧堿A(12)和駱駝寧堿A的細胞毒活性試驗結果
注：(1)篩選方法：磺酰羅丹明B比色法；(2)作用時間：72小時。
對4腫瘤細胞株體外細胞毒活性測試結果顯示：與駱駝寧堿A相比，本發明所合成的自旋標記駱駝寧堿A化合物對人肺腺癌細胞(A549)的抑制活性提高了16倍以上；對人乳腺癌細胞株(MDA-MB-468)的抑制活性提高了7倍以上、對人卵巢癌細胞(SKOV3)的抑制活性提高了2倍以上；對人結腸癌細株(HCT 116)的抑制活性提高近14倍，基于上述活性測試，進一步說明通過本發明的這種優化策略，可顯著提高駱駝寧堿A的抗腫瘤活性，為進一步開發高活性自旋標記駱駝寧堿A衍生物提供了理論依據。且本發明所述化合物表現出較好的應用前景。