本發明屬于醫學影像技術領域，具體涉及一種核素標記的靶向探針化合物及其制備方法。

背景技術：

肝纖維化是由于反復的肝損傷引起的并伴隨著細胞外基質(主要為膠原蛋白)的沉積。在受損的肝組織中，細胞外基質蛋白會通過形成纖維瘢痕替代壞死組織，最終導致肝臟結構紊亂和肝功能異常。肝星狀細胞的活化和增值在肝纖維化發病機理中起主要作用。活化的肝星狀細胞的特征表現為增值加快、過表達α平滑肌肌動蛋白(a-sma)、持續合成細胞外基質蛋白以及分泌趨化因子和促纖維因子。因此，通過對活化的肝星狀細胞進行顯像是一種良好的評估肝纖維的策略。

有文獻報道n-乙酰葡萄糖胺(nag)對細胞表面的波形蛋白和肌間線蛋白有很強的親和力(glycobiology，2010，20(7)：843-864)。重要的是，活化的肝星狀細胞波形蛋白和肌間線蛋白的表達量遠高于靜息狀態的肝星狀細胞和其他非實質細胞。波形蛋白和肌間線蛋白都屬于iii型中間絲蛋白家族，在維持細胞結構中起重要作用。除了存在于細胞質中，在病理條件下這些蛋白還會被招募到細胞表面。在肝星狀細胞活化階段，波形蛋白和肌間線蛋白的表達會大幅上調。經確認nag可以結合到細胞膜表面的波形蛋白和結蛋白的rodii結構域。在體外培養中，連有nag的聚合物可以結合新鮮分離的肝星狀細胞并抑制其活化(biomaterials，2012；33：2154-64)。同時，有專利(cn201510979220.8)公布了o-乙酰葡萄糖胺糖基化修飾在防治肝纖維化中的應用。此發明通過增強o-乙酰葡萄糖胺糖基化修飾抑制肝星狀細胞過度活化和增殖，抑制肝臟中α-平滑肌肌動蛋白和i型膠原的表達以及纖維間隔的形成。

最近有文獻(biomaterials，2013；34：6504-14)報道了一種含有n-乙酰葡萄糖胺結構的復合物用于肝纖維化的熒光成像和治療。但是，此探針需要非常長肝臟積累的時間，而成像時間慢、熒光信號淬滅快、成像效果差。此外，光學成像穿透深度比較低，無法用于人體肝纖維化檢測。

然而，在現有的放射性標記的化合物中，尚未有靶向活化肝星狀細胞波形蛋白和肌間線蛋白的探針報道。雖然已有文獻(journalofhepatology，2013；58(6)：1119-24)報道一種放射性探針¹⁸f-fdgal，通過pet成像監測肝硬化患者的肝臟代謝功能來評估肝硬化。此放射性示蹤劑在評估晚期肝纖維化和肝硬化中有用，但是由于其不能直接反應纖維化的程度，對于早期和中期的纖維化檢測并不是很靈敏。另有文獻(hepatology，2011；54(3)：1020-30)報道基于rgd多肽的放射性示蹤劑通過靶向活化的肝星狀細胞表面的整合素受體αvβ3，用于肝纖維化spect成像。作為肝星狀細胞靶向的探針，可以反應纖維化程度以及對早期肝纖維化進行檢測。但是，此探針在腎臟中有非常高的攝取影響了肝臟成像質量，不利于肝臟攝取的定量分析。同時，高的腎攝取引起的醫學內照射劑量也不可忽視。

在上述現有技術中，存在諸多缺陷例如穿透深度低、成像時間慢、成像質量差、對早期纖維化靈敏度低以及腎攝取高等。這些都制約了其在臨床中的應用。現有技術中需要一種兼具成像時間快、成像質量高、藥代動力學性質適宜以及成像深度不受限等特點的探針化合物以及由其制得的顯像劑。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術缺陷，提供一種核素標記的靶向探針化合物。

本發明的另一目的在于提供上述核素標記的靶向探針化合物的制備方法。

本發明的再一目的在于提供上述核素標記的靶向探針化合物的應用。

本發明的技術方案如下：

一種核素標記的靶向探針化合物，分子量為1kda～50kda，具有聚乙烯亞胺骨架和衍生自n-乙酰葡萄糖胺或二乙酰基殼二糖酸的靶向基團，由放射性核素x標記與聚乙烯亞胺骨架上的亞氨基配位從而實現標記，其具體結構式如下：

其中，x、y、z為整數，x＞0且y、z中至少一個不為0。

在本發明的一個優選實施方案中，所述放射性核素x為^99mtc、¹⁷⁷ru、¹¹¹in、¹⁵⁷gd、⁶⁴cu和^67/68ga中的至少一種。

一種上述靶向探針化合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)殼二糖酸的制備：室溫下，1當量殼二糖用1～5當量的體積比1∶3～1∶5的水和甲醇的混合溶液進行溶解，接著加入碘的甲醇溶液混合均勻，上述碘的甲醇溶液為2～5當量的碘溶于10～25當量的甲醇，然后加入2～10wt％koh的甲醇溶液直到碘的顏色消失，進而用2～5當量乙醚進行重結晶12～48h得到殼二糖酸鉀，最后將殼二糖酸鉀通過離子交換柱獲得殼二糖酸；

(2)標記前體nag-pei的制備：將1當量上述殼二糖酸在2～5當量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)作為催化劑的情況下與1～5當量聚乙烯亞胺室溫反應24～72h，制得標記前體nag-pei；

(3)核素標記的靶向探針化合物的制備：將1當量上述標記前體nag-pei和0.1～0.5當量溶于0.1～0.2mhcl溶液的sncl2混勻，然后每100μg前體nag-pei加入185～370mbq新鮮的放射性核素x前體20～100℃反應20～40分鐘后，制得所述的核素標記的靶向探針化合物。

在本發明的一個優選實施方案中，所述放射性核素x前體為na^99mtco4、¹⁷⁷rucl3、¹¹¹incl3、¹⁵⁷gdcl3、⁶⁴cucl2和^67/68gacl3中的至少一種。

在本發明的一個優選實施方案中，所述步驟(2)為：將1當量上述殼二糖酸溶于含有2～5當量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的四甲基乙二胺(temed)溶液中，然后使其與1～5當量聚乙烯亞胺進行反應24～72h，在室溫下攪拌至反應完全，再將反應后得到的物料放入透析袋中進行透析，透析完后將透析袋中的溶液凍干得所述標記前體nag-pei。

上述靶向探針化合物在制備肝星狀細胞及相關疾病的顯像劑中的應用。

本發明的有益效果：

1、本發明的核素標記的靶向探針化合物可用于體內肝纖維化檢測，具有更短的成像時間、更高的成像質量、更廣的成像深度以及更少的腎臟放射性積累等優點，更有利于早期肝纖維化的檢測。同時，通過聯合ct成像可得到精確的解剖學結構信號和功能信息，有利于肝纖維化的評估以及精確分期。

2、本發明的核素標記的靶向探針標記條件溫和、標記時間短、標記產率高等特點，無須后續純化即可使用，更加有利于標記物的商業化應用與臨床推廣。

3.本發明的核素標記的靶向探針中的多聚體有利于提高比活度，通過spect儀器掃描能夠得到高質量的顯像結果，能夠在體實時動態監測肝纖維化進展及其逆轉。

4、本發明的核素標記的靶向探針的制備思路擴展性強，靶向基團可任意替換為其他常用靶向分子，從而獲得不同靶向功能的可用于不同核素標記的分子靶向探針。

5、與現有探針相比，本發明的核素標記的靶向探針化合物具有更短的成像時間、更高的成像質量以及更廣的成像深度等優點，更利于其在臨床中的應用。

附圖說明

圖1為本發明實施例1的基本原理圖，其中，a為nag-pei的合成路線圖，b為^99mtc-nag-pei標記示意圖。

圖2為本發明實施例2中^99mtc-nag-peispect/ct肝臟區域動態掃描結果圖，其中，a為^99mtc-nag-peispect/ct動態掃描肝臟攝取曲線圖，b為^99mtc-nag-peispect/ct動態掃描圖。

圖3為本發明實施例2中^99mtc-nag-peispect/ct全身靜態掃描結果圖，其中，a為^99mtc-nag-peispect/ct靜態掃描圖，b為^99mtc-nag-peispect/ct靜態掃描肝臟攝取值圖，c為spect/ct肝臟攝取與天狼星紅染色結果相關性分析圖，d為spect/ct肝臟攝取與肝臟羥脯氨酸含量相關性分析圖。

圖4為本發明實施例3中組織切片及天狼星紅染色結果圖，其中，a為肝組織切片天狼星紅染色圖，b為天狼星紅染色定量結果圖，c為^99mtc-nag-pei肝組織切片放射性自顯影圖，d為^99mtc-nag-pei肝組織切片放射性自顯影定量結果圖。

圖5為本發明實施例4的實驗結果圖，其中，a為^99mtc-nag-pei肝纖維化小鼠生物分布圖，b為^99mtc-nag-pei正常小鼠生物分布圖。

圖6是為本發明實施例5中^99mtc-nag-pei細胞攝取及抑制實驗曲線圖；

圖7為本發明實施例5中免疫熒光實驗結果圖，其中，a為肝組織切片α-sma免疫熒光圖，b為肝組織切片desmin免疫熒光圖，其中藍色：dapi、綠色：fitc、紅色：cy5.5。

圖8為本發明實施例5中，nag-pei肝星狀細胞攝取及抑制實驗熒光圖，其中藍色：dapi、紅色：cy5.5；

圖9為本發明實施例6的實驗結果圖，其中，a為^99mtc-nag-pei治療響應spect/ct靜態掃描圖，b為^99mtc-nag-pei肝攝取值定量分析圖，c為纖維化肝組織cd68免疫熒光圖；藍色：dapi、綠色：fitc、紅色：cy5.5，d為治療后纖維化肝組織天狼星紅染色圖。

具體實施方式

以下通過具體實施方式結合附圖對本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。

實施例1nag-pei的制備與^99mtc標記

1、nag-pei的合成

室溫下，0.1g殼二糖用水和甲醇的混合溶液進行溶解。將0.285g碘溶于4ml甲醇中，與上述的殼二糖溶于混勻。將溶液中加入4％的koh溶液直到碘的顏色消失。將溶液用乙醚進行重結晶得到殼二糖酸鉀。產物在通過ir-120離子交換柱獲得殼二糖酸[(nag)2-cooh]。殼二糖酸在edc作為催化劑的情況下與pei(分子量：1800)進行連接。簡單的說，25％摩爾比的殼二糖酸[(nag)2-cooh]溶于含有edc的temed的溶液中與pei進行反應，室溫下攪拌72h。溶液放入透析袋(mwco：2500)中透析3天，凍干得nag-pei。如圖1a所示。

2、glcnac-pei的表征

首先，取10mg合成的nag-pei進行了核磁共振氫譜分析，并與pei進行對比。nag-pei的乙酰基在1.81-1.88ppm有特異性吸收峰，nhch2ch2在2.41-2.66ppm有吸收峰。而pei沒有1.81-1.88ppm的吸收峰，可以證明材料合成成功。實驗完成后將材料回收，重新凍干。然后做了modi-tof-ms質譜分析，測得nag-pei的平均分子量為3300。接下來，采用苯酚-濃硫酸法測定了nag-pei中的糖含量。制作標準曲線：準確稱取nag20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸餾水補至2.0ml，然后加入6％苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml，搖勻冷卻，沸水浴顯色15min以后于490nm測光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，以糖含量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線，求出標準直線方程。通過計算得出glcnac-pei中的糖含量為43.5％。

3、nag-pei的^99mtc標記與鑒定

^99mtc-nag-pei標記如圖1b所示。標記過程簡單的說，將100μg/100μl的nag-pei和20μlsncl2(2mg/ml溶于0.1mhcl)在青霉素小瓶中混勻。然后將185mbq新鮮的na^99mtco4加入混合液中。室溫反應30分鐘。然后用薄層層析(tlc)對標記率進行檢測，itlc-sg紙條作為固定相，acd溶液(0.068m檸檬酸鈉，0.074m葡萄糖，ph5.0)作為流動相。標記物的穩定性也用同樣的方法進行檢測。然后所有的紙條用miniscan進行檢測。同時我們檢測了^99mtc-nag-pei在血清和磷酸鹽緩沖液(pbs)中的穩定性。簡單的說，去少量新鮮標記的^99mtc-nag-pei溶液18～36kbq在血清或pbs溶液中孵育4h(標記物與溶液比值為1∶9)，孵育過后用tlc進行檢測，固定相和流動相同上所述。^99mtco4^-的rf值為0.9-1之間，而標記物^99mtc-nag-pei的rf值為0-0.1之間，可以說明標記成功，統計軟件分析測得^99mtc-nag-pei標記率大于97％，且在血清和pbs溶液中有良好的穩定性。

實施例2^99mtc-nag-peispect/ct顯像評估小鼠肝纖維化

1、肝纖維小鼠模型的構建

實驗所用小鼠為雌性c57bl/6小鼠，購于廈門大學實驗動物中心。ccl4被用于誘導小鼠的肝纖維化。簡單的說，ccl4溶于橄欖油中(1∶4)，c57bl/6的雌性小鼠腹腔注射5ml/kg的ccl4溶液，每周2次。對照組給予相同劑量的橄欖油。每組5只小鼠，分別4周和8周。

2、^99mtc-nag-peispect/ct肝臟區域動態掃描

動態spect/ct掃描小鼠分組為：對照組3只以及8周纖維化組3只。將小鼠先用異氟烷進行麻醉，然后將小鼠置于spect/ct內掃描，全程異氟烷進行麻醉，氧氣流速為0.8ml/min，麻醉藥氣濃度為2％。先進行ct掃描，選定掃描范圍，使用滯留針尾靜脈注射500μci的^99mtc-nag-pei馬上進行spect掃描。ct參數為：能量峰50kv，670μa，480投影，中等變焦；spect參數為：能量峰值為140kev，20個掃描，5s/幀，掃描時間0-50分鐘。

為了明確^99mtc-nag-pei在肝臟中攝取隨時間的變化我們進行了0-50分鐘動態spect/ct的掃描，如圖2a所示。通過肝臟放射性攝取曲線可以看出，纖維化組的肝臟放射性攝取值明顯高于對照組。纖維化組的攝取在25-30分鐘到達峰值，隨后趨于穩定，肝攝取50分鐘內沒有降低；而對照組的肝攝取值遠低于纖維化組，肝臟攝取在20分鐘左右達峰值，隨后肝臟攝取開始降低。圖2b為不同時間點的動態掃描圖像，從圖像中可也可以看出隨著時間增加肝臟攝取值隨著增加，且肝纖維化組的肝臟攝取值明顯高于對照組。

3、^99mtc-nag-peispect/ct全身靜態掃描

靜態spect/ct掃描小鼠分組情況為：對照組、4周纖維化組以及8周纖維化組，每組4只。spect/ct顯像操作：首先，小鼠尾靜脈注射18mbq的^99mtc-nag-pei30分鐘后將小鼠先用異氟烷進行麻醉，然后將小鼠置于spect/ct內進行掃描，全程異氟烷進行麻醉，氧氣流速為0.8ml/min，麻醉藥氣濃度為2％。先進行ct掃描，然后進行spect掃描。所有操作均安裝操作說明進行。ct參數為：能量峰50kv，670μa，480投影，中等變焦；spect參數為：能量峰值為140kev，窗口寬度為20％，矩陣為256×256，中等變焦，30s/幀。

根據spect/ct動態掃描的結果，肝纖維化小鼠肝攝取在35-30分鐘達到峰值，因此我們選擇尾靜脈注射探針30分鐘進行全身靜態掃描。spect/ct顯像圖如圖3a所示，除了脾臟以及膀胱有較高的攝取外^99mtc-nag-pei在肝臟部位特異性高攝取。隨著ccl4誘導時間的增加，肝纖維化小鼠的肝臟攝取值也隨之增加。ccl4誘導8周的肝纖維化小鼠的肝臟攝取值明顯高于誘導4周的肝纖維化小鼠(468±11.1mbq/mlvs330±16.0，p＜0.01)，遠高于對照組小鼠(468±11.1mbq/mlvs234±11.4mbq/ml，p＜0.001)；如圖3b所示。同時我們對spect掃描結果與組織學檢測指標進行了相關性分析。分析結果表明spect肝臟攝取值與天狼星紅染色定量結果之間具有良好的相關性(r＝0.92，圖3c)，同時spect肝臟攝取值與肝臟中的羥脯氨酸含量之間也具有良好的相關性(r＝0.87，圖3d)。所用小鼠停止給藥一周后進行顯像，避免ccl4的急性影響。

實施例3纖維化肝組織切片天狼星紅染色及放射性自顯影

1、組織切片及天狼星紅染色

組織包埋：首先，取將顯像完的對照組和纖維化組的小鼠引頸處死，取出肝臟，每個肝臟用刀片切兩塊1.5×1.5厘米近似方形肝組織，要求組織邊緣平整，用pbs溶液洗兩次，去除血細胞，然后將肝組織放入含有4毫升4％的多聚甲醛溶液的離心管中固定過夜。pbs溶液洗2次后過梯度酒精進行脫水，酒精濃度從50％至100％每次30分鐘。如果有事情需要中斷實驗，可以在70％酒精這一步放入4℃過夜。脫水完后用二甲苯進行透明，酒精：二甲苯1∶1混合液透明30分鐘，然后在二甲苯中透明2次，每次40分鐘。透明時注意觀察透明的情況，組織血管是否清楚，組織透明是否徹底，可根據組織實際情況增加或減少透明時間。透明完后組織浸蠟，二甲苯/石蠟(1∶1)混合液中浸蠟30分鐘，然后在液體石蠟中浸蠟兩次，每次1h。浸蠟過程在67℃烘箱里面進行，石蠟需要提前放入烘箱融化。最后，將組織放入包埋盒里面，倒入液體石蠟進行包埋。讓包埋好的蠟塊室溫凝固過夜。

組織切片：將包埋好的蠟塊固定在石蠟切片機上，先將切片厚度調至20μm進行修片。當蠟塊暴露出組織后，見切片厚度調至5μm進行連續切片，每個組織塊切20張片子，切好的片子放入37℃水浴鍋里面進行展片，然后用載玻片撈片，做好標記，放入標本架上，放入37℃烘箱烘片2h。最后將組織切片放入標本盒保存。

天狼星紅染色：首先，將組織切片在二甲苯中脫蠟兩次，每次5分鐘。然后過梯度酒精，濃度100％至50％每次2分鐘，最后放入蒸餾水2分鐘。接下來用0.5％天狼星紅苦味酸溶液染色15-30分鐘，水洗至無色，如果需要染核，1％鹽酸酒精分色7秒，自來水沖洗5分鐘，然后用蘇木素復染2分鐘，水洗至無色。接下來過梯度酒精脫水，50％至100％每次1分鐘，然后二甲苯透明2次，每次5分鐘，最后將組織切片用中性樹脂進行固封。鏡下觀察，拍片，然后將組織切片放入標本盒保存。

天狼猩紅染色的結果可以看出隨著ccl4誘導時間的增加，膠原纖維的面積逐漸增多。對照組的小鼠肝臟中膠原纖維只是存在于匯管區，當ccl4誘導4周，膠原纖維從匯管區延小葉邊界延伸，形成短小的膠原瘢痕，纖維化發展到中期，當ccl4誘導8周后，膠原瘢痕逐漸橋聯在一起，形成小葉間隔，纖維化發展到晚期；如圖4a所示。然后我們使用軟件對天狼星紅的面積進行了定量，ccl4誘導8周組天狼星紅面積要高于ccl4誘導4周組，明顯高于對照組(對照vs4w纖維化＝1.04±0.12vs2.26±0.15，p＜0.05；對照vs8w纖維化＝1.04±0.12vs3.24±0.28，p＜0.01)，如圖4b所示。

2、^99mtc-nag-pei肝組織放射性自顯影

首先將肝組織切片，在二甲苯中脫蠟，5分鐘2次，然后過梯度酒精，濃度從100％到50％，每次2分鐘，然后蒸餾水總浸泡2分鐘。接下來將組織加入18kbq^99mtc-nag-pei孵育15分鐘，然后pbs溶液洗三次，每次5分鐘。將組織放入儲磷屏中暗盒里曝光1h，然后將曝光后的儲磷屏在成像儀中進行掃描，結果如圖4c所示。纖維化組的放射性攝取值明顯高于對照組，如圖4d(對照組放射性攝取值vs纖維化組放射性攝取值＝3724±512vs1754±419，p＜0.05)。

實施例4^99mtc-nag-pei小鼠生物分布實驗

1、^99mtc-nag-pei肝纖維化小鼠生物分布實驗

肝纖維化模型構建同實施例2，每只小鼠注射37kbq的^99mtc-nag-pei，1h后，將小鼠斷頸處死，然后去其臟器(包括：心、肝、脾、肺、腎、腸、肌肉、胃)進行稱重，γ計數器測定各個臟器的放射性計數。生物分布結果表明，隨ccl4誘導時間的增加^99mtc-nag-pei在肝臟的攝取隨著增加(對照組vs4w纖維化＝2.54±0.401vs4.904±0.579；p＜0.01對照組vs8w纖維化＝2.54±0.401vs7.74±0.764；p＜0.01)，另外^99mtc-nag-pei在脾臟中有較高的攝取，而其他臟器的攝取值都很低；如圖5a所示。

2、^99mtc-nag-pei正常小鼠生物分布實驗

正常8周齡的balb/c小鼠購于廈門大學實驗動物中心，被用于生物分布實驗研究。每只小鼠注射37kbq的^99mtc-nag-pei，30分鐘、1h和2h之后，將小鼠斷頸處死，然后去其臟器(包括：心、肝、脾、肺、腎、腸、肌肉、胃)進行稱重，γ計數器測定各個臟器的放射性計數。生物分布結果表明，正常小鼠中^99mtc-nag-pei在脾臟中有較高的攝取，而其他臟器的攝取值都很低，隨著時間的增加，^99mtc-nag-pei在脾臟中的攝取降低；如圖5b所示。

實施例5^99mtc-nag-pei肝星狀細胞特異性實驗

1、競爭性細胞結合實驗

從纖維化小鼠的肝組織中分離肝星狀細胞，在37℃co2細胞培養箱進行擴增。接下來將擴增的細胞消化，接種的24孔板，每孔接種10⁵細胞。24h后，將細胞用bindingbuffer(pbs+0.5％bsa)洗2次，實驗組加入1.8kbq^99mtc-pei-nag，抑制組加入1.8kbq^99mtc-pei-nag和500μmolnag-pei，37℃孵育15、30、60、90、120、180、240分鐘。孵育完之后，細胞用bindingbuffer洗2次，然后用1n的naoh溶解，收集到液體。γ-counter測放射性計數。

競爭性細胞結合實驗結果表明，^99mtc-pei-nag在細胞中的攝取值隨著時間的增加而增加，當加入冷配體pei-nag進行抑制后，^99mtc-pei-nag在細胞中的攝取值明顯降低；如圖6所示。

2、免疫熒光實驗

取對照組和纖維化組小鼠的肝臟組織用組織包埋劑包埋，凍于-80℃冰箱。24h后將組織塊用冰凍切片機切成7μm切片。肝組織切片用4％對聚甲醛固定10分鐘，然后用5％的bsa封閉0.5h，pbs洗三次，然后加入1∶50desmin(靶向蛋白)或1∶200α-sma(活化肝星狀細胞表面標志物)的單克隆抗體4％孵育過夜。第二天將切片拿到室溫，pbs洗三次；然后用fitc熒光二抗和連有cy5.5的nag-pei孵育30分鐘，pbs洗三次。接下來用dapi染核10分鐘，pbs洗3次，50％甘油封片。將組織切片在共聚焦顯微鏡下觀察。

如圖7a所示，纖維化組α-sma(活化的肝星狀細胞表面標志物)表達以及nag-pei-cy5.5攝取明顯高于對照組肝組織，同時α-sma與nag-pei-cy5.5有明顯的共定位(箭頭所指的位置)。同樣，desmin在纖維化肝組織中表達遠高于對照組，并且desmin與nag-pei-cy5.5有明顯的共定位，如圖7b所示。以上結果可以表明，nag-pei可以特異性的靶向活化肝星狀細胞表面的desmin。

3、nag-pei肝星狀細胞攝取抑制實驗

將肝星狀細胞(2×10⁶/孔)接種到培養板(6孔板，每個孔底部一個滅過菌的蓋玻片，用于細胞爬片)，培養24h，鏡下觀察等細胞成長到密度80％左右時，小心吸出所有培養基，洗去表面死去或脫落的細胞，然后向每個孔板中加入0.5ml新的培養基。這時將孔板舉起，透過光線從底部觀察，可看見孔板底部有一層均勻的細胞膜，以均勻且沒有明顯脫落的區域為好。將6孔板按實驗需要分好區域，在板蓋表面上做好記號，實驗分為兩組，每組三個重復。首先向抑制組孔板中加入100μlnag溶液(1mg/ml)孵育30min，然后取1～3μlnag-pei-cy5.5(1μg/μl)加入培養基(總體積500μl)中，加蓋在37℃孵育30min。培養結束后，將孔板中所有的培養基完全吸出，然后向其中的抑制組和對照組孔板中加入0.5ml冰冷的pbs(含0.2％bsa)洗兩次，dapi染核10分鐘，pbs洗3次，將培養板中的蓋玻片取出，貼在載玻片上，50％甘油封片。將載波片在共聚焦顯微鏡下觀察。實驗結果如圖8所示，加入nag抑制之后，肝星狀細胞對靶向探針nag-pei的攝取有明顯減少，進一步證明了靶向探針nag-pei的特異性。

實施例6^99mtc-nag-pei監視肝纖維的治療響應

缺少非侵入式的監視肝纖維化進程的方法限制的抗纖維化藥物的開發。因此評估本發明^99mtc-nag-pei能否監視肝纖維的治療響應。氯磷酸鹽脂質體(sigmaaldrich，usa)被用于小鼠肝纖維化的治療。之所以用氯磷酸鹽脂質體治療肝纖維化是因為氯磷酸鹽脂質體可殺死肝組織中的巨噬細胞。根據文獻報道，巨噬細胞能夠產生促纖維化因子(例如轉化生長因子tgf-β1、血小板樣生長因子pdgf)，通過調節金屬蛋白酶mmp和金屬蛋白酶組織抑制劑的表達控制ecm沉積的反轉。ccl4誘導8周的纖維化小鼠尾靜脈注射5ml/kg的氯磷酸鹽脂質體，每周一次持續2周。對照組給予相同劑量的pbs脂質體。每組5只小鼠。^99mtc-nag-peispect/ct靜態掃描表明，氯磷酸鹽處理后纖維化小鼠肝臟的放射性攝取明顯降低，氯磷酸鹽處理組vs對照組231.7±17.6vs356.7±20.7mbq/ml(spect/ct靜態掃描操作同實施例2)，如圖9a、b所示。免疫熒光結果顯示的氯磷酸鹽處理后纖維化肝組織中cd68的表達以及nag-pei攝取都有明顯降低(免疫熒光操作同實施例5)，如圖9c所示。同時肝組織切片天狼猩紅染色結果表明，經過氯磷酸鹽處理后纖維化肝組織中的膠原纖維的量明顯減少(天狼猩紅染色操作同實施例4)，如圖9d所示。

目前臨床是用于檢測肝纖維化的金標準還是活檢，是一種侵入式的手段常伴隨著疼痛和出血。傳統影像學如超聲、ct和mri主要通過檢測形態的改變，但發生以上改變時疾病往往已經發展到肝硬化階段，其對于早期纖維化的診斷缺乏靈敏性。^99mtc-nag-pei作為一種分子靶向探針可以可靠的區分正常肝臟和早期纖維化，可以用于早期纖維化診斷；同時可以用于抗纖維化藥物的療效檢測。

肝星狀細胞的活化和增值在肝纖維化發病機理中起主要作用，通過對活化的肝星狀細胞進行顯像是一種良好的評估肝纖維的策略。^99mtc-nag-pei對活化的肝星狀細胞表面的波形蛋白和肌間線蛋白有很強的親和力，能夠用于早期肝纖維化的診斷及治療響應的監測。本核素標記的靶向探針化合物具有標記能力強、標記時間短、標記產率高等特點，無須后續純化即可使用，更加有利于標記物的商業化應用與臨床推廣。

本領域普通技術人員可知，本發明的技術方案在下述范圍內變化時，仍然能夠得到與上述實施例相同或相近的技術效果，仍然屬于本發明的保護范圍：

一種核素標記的靶向探針化合物，分子量為1kda～50kda，具有聚乙烯亞胺骨架和衍生自n-乙酰葡萄糖胺或二乙酰基殼二糖酸的靶向基團，由放射性核素x標記與聚乙烯亞胺骨架上的亞氨基配位從而實現標記，其具體結構式如下：

其中，x、y、z為整數，x＞0且y、z中至少一個不為0。

所述放射性核素x為^99mtc、¹⁷⁷ru、¹¹¹in、¹⁵⁷gd、⁶⁴cu和^67/68ga中的至少一種。

上述靶向探針化合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)殼二糖酸的制備：室溫下，1當量殼二糖用1～5當量的體積比1∶3～1∶5的水和甲醇的混合溶液進行溶解，接著加入碘的甲醇溶液混合均勻，上述碘的甲醇溶液為2～5當量的碘溶于10～25當量的甲醇，然后加入2～10wt％koh的甲醇溶液直到碘的顏色消失，進而用2～5當量乙醚進行重結晶12～48h得到殼二糖酸鉀，最后將殼二糖酸鉀通過離子交換柱獲得殼二糖酸；

(2)標記前體nag-pei的制備：將1當量上述殼二糖酸在2～5當量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽作為催化劑的情況下與1～5當量聚乙烯亞胺室溫反應24～72h，制得標記前體nag-pei；優選的，該步驟為：將1當量上述殼二糖酸溶于含有2～5當量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的四甲基乙二胺溶液中，然后使其與1～5當量聚乙烯亞胺進行反應24～72h，在室溫下攪拌至反應完全，再將反應后得到的物料放入透析袋中進行透析，透析完后將透析袋中的溶液凍干得所述標記前體nag-pei；

(3)核素標記的靶向探針化合物的制備：將1當量上述標記前體nag-pei和0.1～0.5當量溶于0.1～0.2mhcl溶液的sncl2混勻，然后每100μg前體nag-pei加入185～370mbq新鮮的放射性核素x前體20～100℃反應20～40分鐘后，制得所述的核素標記的靶向探針化合物；上述放射性核素x前體為na^99mtco4、¹⁷⁷rucl3、¹¹¹incl3、¹⁵⁷gdcl3、⁶⁴cucl2和^67/68gacl3中的至少一種。

以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的范圍，即依本發明專利范圍及說明書內容。