本發明涉及微生物制劑領域，尤其是一種用于垃圾除臭的EM菌液制備方法。
背景技術：
：EM菌(EffectiveMicroorganisms)是由多種有益微生物（主要是光合細菌、乳酸菌、酵母菌、絲狀真菌和放線菌）復合而成的有機組合，可在使用處形成良好的微生態環境，因而可以應用于環保、種植、畜牧、水產、飼料及人體家庭保健等方面，起到抑制病原菌、除異臭、改良土壤、改善水質、增強抗病性、促生長、改善產品品質等功效。目前，環保、種植、畜牧等行業所用的EM菌并沒有本質上的差異，只是不同用戶所使用的品牌不同，其中的微生物種類及各菌種比例差異不顯著。這種同一性使EM菌的針對性使用效果不理想，或者使用量過大，使用成本較高。EM菌的菌種組成復雜，其中的光合細菌等多種微生物對除臭無作用，但在除臭過程中發揮重要作用的酵母、乳酸菌以及產生抗生素的微生物含量過低；而且由于菌種間的拮抗作用，傳統的發酵方法生產的產品中菌體濃度通常較低，培養時間長，生產成本較高。市場急需一種專一性高、除臭效果好、用量少、成本低的EM菌產品。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種在垃圾處理、畜牧養殖、污水處理等過程中除臭用的EM菌液制備方法，該菌液中活菌總數不低于109cfu/mL。為了達成上述目的，本發明的技術方案如下：一種除臭用EM菌液制備方法，將常規的EM菌種分為DFA和DFB兩個部分，分別在糖蜜培養基中培養48小時；其中：DFA培養溫度為37℃，不通氣培養；DFB培養溫度為30℃，通氣培養；培養后DFA和DFB按9:1的體積比混合，隨后，30℃密閉發酵，培養24h，即得除臭用EM菌液。其中：DFA為不含酵母菌，以細菌和放線菌為主要成分的復合菌種；DFB為以酵母菌和絲狀真菌為主要成分的復合菌種。本發明所使用的出發菌液為市售EM菌液。所述DFA的制備，包括以下步驟：取常規EM菌液4℃下靜置30天后的上層液體按1%接種至無菌的糖蜜培養基（按質量百分比計，糖蜜8%，蛋白胨2%，K2HPO40.6%，CaCO33%，自然pH）中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，密閉發酵，37℃振蕩培養7天后顯微鏡檢，取無酵母的樣品作DFA組分一；取常規EM菌液按1%接種量接種至高溫滅菌的LB培養基（按質量百分比計，胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，Nacl1%,培養基pH控制在7.4）中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，密閉發酵，37℃振蕩培養7天后傳代，重復上述操作，取顯微鏡檢無酵母菌的樣品作組分二；利用LB固體培養基（按質量百分比計，胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，Nacl1%,瓊脂1.0%~1.5%，培養基pH控制在7.4）與PDA培養基（按質量百分比計，馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%~2.0%，自然pH）分離常規EM中菌種，除酵母菌外，分別培養分離得到的菌株后按相同比例接種至無菌的糖蜜培養基中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，密閉發酵，自然協調菌種比例，37℃振蕩培養7天作為組分三；以上所得的三種無酵母發酵液均按3%接種量混合接種至高溫滅菌的糖蜜培養基（培養基配方同前）中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，密閉發酵，37℃振蕩培養3天即得新鮮DFA，新鮮DFA與無菌保護液（蔗糖100g/L、脫脂奶粉100g/L）等體積混合后-80℃真空冷凍干燥24h制成菌粉。所述DFB的制備：取常規EM菌液4℃下靜置30天后的菌泥，按1%接種量接種至無菌的糖蜜培養基（培養基配方同前）中，按25%裝液量裝入錐形瓶中，通氧發酵，30℃振蕩培養3天即得新鮮DFB，新鮮DFB與無菌保護液（蔗糖100g/L、脫脂奶粉100g/L）等體積混合后-80℃真空冷凍干燥24h制成菌粉。新鮮DFA菌液按2%量直接接種至無菌的糖蜜培養基（培養基配方同前）中，凍干菌粉需經種子培養（采用糖蜜培養基，培養基配方同前），90%裝液量，1%接種量，37℃密閉振蕩培養）24h后按10%量接種至無菌的糖蜜培養基（培養基配方同前）中，發酵罐裝液量為70%，密閉發酵，每隔24小時攪拌10分鐘（攪拌時打開放氣閥放出氣體，防止過壓），37℃培養48小時；新鮮DFB菌液按2%量直接接種至無菌的糖蜜培養基（培養基配方同前）中，凍干菌粉需經種子培養（采用糖蜜培養基，培養基配方同前），25%裝液量，1%接種量，30℃通氣振蕩培養）24h后按10%量接種至無菌的糖蜜培養基（培養基配方同前）中，30℃通氣攪拌/振蕩培養48小時；發酵后的DFA和DFB按9:1（V/V）混合后按70%裝液量裝入發酵罐或無菌密閉容器，30℃密閉發酵，每隔6小時攪拌10分鐘（攪拌時打開放氣閥放出氣體，防止過壓）培養24h即得除臭用EM菌液。本發明使用時，根據待處理樣品差異選擇不同的使用方法。待處理樣品為固體，如垃圾、糞便或養殖場時，將除臭用EM菌液用20-30℃溫水稀釋10倍，靜置1h后噴灑表面，按照其臭味濃烈程度，原液使用量為待處理樣品質量的0.1%-1%。待處理樣品為液體，如生活污水、便池、工業廢水等時，將除臭用EM菌液用20-30℃溫水稀釋3倍，靜置1h后傾倒至待處理液體中，按照其臭味濃烈程度，原液使用量為待處理樣品質量的0.001%-0.1%。本發明菌液中酵母類真菌占總微生物比例為市售EM菌液中的10倍以上。本發明通過通氣培養，將酵母菌和霉菌等在除臭過程中起主要作用的好氧菌從EM菌中分離出來制成DFB，不含酵母菌的EM菌不通氣培養制成DFA，DFA和DFB分別培養至高菌體濃度后復配培養制成除臭用EM菌，稀釋后噴灑或傾倒至待處理樣品中。本發明的有益效果是：（1）菌體濃度高；在培養的前48h內無酵母菌和其他菌株間營養的競爭以及代謝產物（乙醇、乙酸和乳酸等）所導致的相互之間的抑制作用，并為生長需求不同的菌種提供了不同的培養條件，使菌體生長旺盛，成品中活菌總數可達109數量級以上。（2）生產周期短，72小時即可完成發酵。（3）提高了對除臭有顯著效果的酵母和霉菌的比例，經檢測，本產品菌液中酵母類真菌占總微生物比例為市售EM菌液中的10倍以上，增強了EM菌的除臭效果。具體實施方式實施例一：液體菌種制備與發酵。步驟一、DFA的制備：1、取EM菌液500mL，分裝至25支無菌試管中，密封于4℃下靜置30天后的取上層液體按1%分別接種至無菌的糖蜜培養基中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，每組2個平行樣，密閉發酵，37℃振蕩培養7天后顯微鏡檢，得到無酵母的樣品按相同體積比混合后作為組分一。2、取EM菌液按1%接種量接種至高溫滅菌的LB培養基中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，每組10個平行樣，密閉發酵，37℃振蕩培養7天后傳代，重復上述操作至第三次傳代得到2個鏡檢無酵母菌樣品混合作為組份二。3、利用LB固體培養基與PDA培養基分離純化EM中菌種，得到15株細菌、2株放線菌、8株霉菌、1株酵母菌，除酵母菌與霉菌外，分別在LB液體培養基中培養48h后按0.5%（V/V）接種至無菌的糖蜜培養基中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，密閉發酵，自然協調菌種比例，37℃振蕩培養7天作為組分三。以上所得的三種無酵母發酵液均按3%接種量混合接種至無菌的糖蜜培養基中，按90%裝液量裝入錐形瓶中，密閉發酵，37℃，100rpm振蕩培養7天得DFA。步驟二、DFB的制備：取EM菌液4℃下靜置30天后的菌泥，按1%接種量接種至無菌的糖蜜培養基中，按25%裝液量裝入錐形瓶中，30℃，200rpm振蕩培養3天得DFB。步驟三、取DFA按2%接種量接種至無菌的糖蜜培養基中，按70%裝液量裝入發酵罐，密閉發酵，每隔24h攪拌30min，37℃培養48h，經檢測，活菌總數達1.53×109cfu/ml。取DFB按2%接種量接種至無菌的糖蜜培養基中，30℃通氣攪拌培養48h，經檢測，酵母菌濃度達9.30×108cfu/ml，總活菌數達1.78×109cfu/ml。發酵后的DFA和DFB按9:1混合后裝入空消后的發酵罐，裝液量70%，30℃密閉發酵，每隔6小時攪拌10分鐘，培養24h后得除臭用高密度EM菌液，經檢測，活菌總數達3.73×109cfu/ml，其中酵母菌總數為1.65×109cfu/ml。實施例二：固體菌種制備與發酵。DFA凍干粉劑的制備與培養：DFA新鮮菌液與無菌保護液按1:1（V/V）混合后于-80℃預凍4h，預凍后的樣品于-80℃真空冷凍干燥48h，檢測其含水量為3.74%，菌體存活率為87.5%。取保存6個月的凍干菌粉按1%量接種至無菌的糖蜜培養基，按90%裝液量裝入500mL錐形瓶，37℃，150rpm振蕩培養1天后按10%接種量接種至50L發酵罐中，接種后裝液量約為35L，培養基為糖蜜培養基，每隔24h攪拌30min，37℃培養48h，經檢測，活菌總數達1.27×109cfu/ml。DFB凍干粉劑的制備與培養：DFB新鮮菌液與無菌保護液按1:1（V/V）混合后于-80℃預凍4h，預凍后的樣品于-80℃真空冷凍干燥48h，檢測其含水量為3.37%，菌體存活率為84.3%。取保存6個月的凍干菌粉按1%量接種至無菌的糖蜜培養基，容器為500mL錐形瓶，25%裝液量，30℃，200rpm振蕩培養1天后按10%接種量接種至5L發酵罐中，接種后裝液量約為3.5L，培養基為糖蜜培養基，30℃下，300rpm通氣攪拌培養，通氣比1:1，培養48h，經檢測，活菌總數達1.96×109cfu/ml，其中酵母菌總數1.22×109cfu/ml。從DFA發酵罐內放料3.5L，將3.5LDFB導入DFA發酵罐內，30℃密閉發酵，每隔6小時攪拌10分鐘，培養24h后得除臭用高密度EM菌液，經檢測，活菌總數達4.65×109cfu/ml，其中酵母菌總數為1.95×109cfu/ml。實施例三：固體垃圾除臭實驗。從生活區垃圾場采集垃圾100kg，其組成包括廢紙、塑料制品、動物內臟、食物殘渣等，攪拌混勻后均勻分為5份，每份20kg，分別裝入5個100kg塑料桶中，桶蓋上留有8cm2氣窗，分別編號1-5。處理方法：1號；取除臭用EM菌液，離心、過濾除菌后取20g濾液加入30℃溫水180g，混勻靜置1h后均勻噴灑至垃圾表面，蓋上桶蓋。2號；取除臭用EM菌液20g加入30℃溫水180g，混勻靜置1h后均勻噴灑至垃圾表面，蓋上桶蓋。3號；取除臭用EM菌液，離心、過濾除菌后取200g濾液加入30℃溫水1800g，混勻靜置1h后均勻噴灑至垃圾表面，蓋上桶蓋。4號；取除臭用EM菌液200g加入30℃溫水1800g，混勻靜置1h后均勻噴灑至垃圾表面，蓋上桶蓋。5號；不作處理，直接蓋上桶蓋。將5個桶置于室外，3d后取氣體樣品檢測其中硫化氫和氨（GB/T14678-93，GB/T14679-93）。采氣時用硅膠管伸入桶中部采集氣體。實驗過程中無下雨，溫度16-28℃，無陽光直射，檢測結果如表1所示。表1除臭實驗檢測結果實驗組氨(mg/m3)硫化氫(mg/m3)14.782.4821.140.2435.262.7140.440.1154.652.53結果分析：除臭用EM菌液表現出良好的除臭效果，顯著的降低了實驗桶中的氨和硫化氫這兩種主要的臭味形成氣體，且氨和硫化氫的去除率隨用量的升高而增加，通過2和1，4和3的對照可以看出，菌液的除臭作用依賴于其中的微生物。3中氨和硫化氫均高于1和5可能系菌液中殘留的培養基促進了垃圾中產臭微生物的生長，同時3噴灑的水量較大，有助于產臭微生物的繁殖。當前第1頁1 2 3