本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種煙草akt1基因及其制備方法和應用。

背景技術：

鉀離子通道是允許鉀離子特異通透質膜的離子通道，而阻礙其他離子通透-特別是鈉離子。這些通道一般由兩部分組成：一部分是通道區，選擇并允許鉀離子通過，而阻礙鈉離子；另一部分是門控開關，根據環境中的信號而開關通道。

現有技術對于鉀離子通道基因的研究在模式植物擬南芥中比較廣泛，例如，研究表明擬南芥鉀通道基因akt1編碼一個內向整流通道，可以形成同源多聚體，主要在擬南芥根的表皮和皮層細胞中表達(bassetetal.,1995；lagardeetal.,1996)；akt1負責介導擬南芥根細胞從土壤中吸收鉀營養，akt1的功能缺失造成akt1突變體植株k⁺吸收能力降低，從而使得akt1突變體冠部的k⁺含量顯著降低，導致幼苗在低鉀脅迫下表現出冠部失綠黃化的低鉀敏感表型(lagardeetal.,1996；hirschetal.,1998；spaldingetal.,1999；xuetal.,2006)。

煙草是一種耗鉀量很大的作物，煙葉鉀含量是衡量煙葉品質的的重要指標，目前，對于煙草中鉀離子通道的研究較少，煙草akt1的功能未知。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供煙草akt1基因及其制備方法和應用。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種煙草akt1基因，所述akt1基因的序列如seqidno.1所示。

本發明提供了上述技術方案所述akt1基因的制備方法，包括以下步驟：設計pcr擴增引物，所述的pcr擴增引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的核苷酸序列為：5’-atgccgttgccagagacaccga-3’，所述的反向引物的核苷酸序列為5’-tcaaaagatatacaagcgatc-3’；提取煙草細胞總rna；合成煙草細胞的cdna；以所述煙草細胞cdna為模板進行akt1基因的pcr擴增，得到目的片段，測序后得到akt1基因序列。

優選的，所述pcr擴增引物的設計是以ncbireferencesequence:

xm_009802835.1為參考序列，使用軟件primer5設計得到的，所述

xm_009802835.1的核苷酸序列如seqidno.2所示。

優選的，所述的pcr擴增的體系為20μl體系，包括premixextaq10μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，煙草細胞cdna1μl，ddh2o8μl。

優選的，所述的pcr擴增的反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35個循環。

優選的，所述的目的片段在測序之前還包括，將所述目的片段導入大腸桿菌dh5α感受態細胞中進行菌落pcr驗證，驗證為陽性克隆后進行測序。

優選的，所述菌落pcr驗證使用的正向引物核苷酸序列為：5’-atgccgttgccagagacaccga-3’，菌落pcr驗證使用的反向引物核苷酸序列為：5’-tcaaaagatatacaagcgatc-3’。

優選的，所述菌落pcr驗證的體系為10μl，包括premixextaq5μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，ddh2o4μl。

本發明還提供了一種煙草akt1基因在促進煙草植株鉀離子吸收和轉運方面的應用。

優選的，將所述的煙草akt1基因轉入到煙草植株中，使akt1基因超量表達以提高煙草植株的煙葉中鉀離子的含量。

本發明的有益效果：本發明提供的akt1基因，是通過同源克隆的方法制備獲得的，所述的akt1基因全長1908bp，經功能驗證，本發明提供的akt1基因轉入鉀吸收缺陷型酵母突變株r5421后的重組酵母具有鉀離子吸收，轉運功能。本發明實施例中，3個akt1基因轉基因煙草葉中鉀離子的質量含量分別是1.61％，1.63％和1.65％，非轉基因的煙草葉中鉀離子的質量含量是0.84％，轉基因的煙草葉中鉀離子的含量顯著高于非轉基因的，可見，煙草植株中超量表達akt1基因可促進煙草對鉀離子的吸收。因此，本發明提供的akt1基因具有促進鉀離子吸收和轉運的功能。

附圖說明

圖1為實施例2中akt1基因轉入鉀吸收缺陷型酵母突變株r5421后的重組酵母在鉀離子濃度為0mm和2mm的培養基上的生長情況；其中圖1a為鉀離子濃度為0mm的培養基上的生長情況，圖1b為鉀離子濃度為2mm的培養基上的生長情況；

圖中，1為轉入akt1基因的重組酵母，2為陰性對照p416，3為陽性對照；從左到右依次為原液、10倍稀釋液、100倍稀釋液在培養基上的生長結果。

具體實施方式

本發明提供了一種煙草akt1基因，所述煙草鉀離子通道基因的序列如seqidno.1所示，本發明中所述的akt1基因全長1908bp。

本發明提供了上述技術方案所述煙草akt1基因的制備方法，包括以下步驟：設計pcr擴增引物；提取煙草細胞總rna；合成煙草細胞cdna；以所述煙草細胞cdna為模板進行akt1基因的pcr擴增，得到目的片段，測序后得到akt1基因序列。

本發明中，所述的pcr擴增引物的設計，是以ncbireferencesequence:xm_009802835.1為參考序列，使用軟件primer5設計得到的，所述xm_009802835.1的序列如seqidno.2所示。

在本發明中，所述的pcr擴增引物優選包括正向引物和反向引物，所述的正向引物核苷酸序列為：5’-atgccgttgccagagacaccga-3’，長度為22bp；所述反向引物的核苷酸序列為5’-tcaaaagatatacaagcgatc-3’，長度為21bp。

本發明在進行akt1基因的pcr擴增之前，提取煙草細胞總rna，并將提取得到的總rna反轉錄為cdna。在本發明中，所述的煙草細胞總rna的提取采用本領域常用的提取細胞總rna的技術方案即可，本發明的實施例中具體的可采用trizol法。在本發明中，所述的煙草細胞總rna提取的原料為煙草的新鮮葉片，所述煙草采用為本領域常規的煙草品種，本發明實施例中，所述煙草品種為k326。

本發明在提取得到煙草細胞總rna后，將所述煙草細胞總rna反轉錄合成cdna。本發明中，所述的cdna的合成，采用本領域常規的cdna的合成方法即可，無其他特殊要求；具體的本發明實施例中采用takara公司的cdna合成試劑盒完成cdna的合成。

本發明在得到cdna之后，進行akt1基因pcr擴增，得到目的片段。在本發明中，所述akt1基因pcr擴增的體系優選為20μl體系，包括premixextaq10μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，煙草細胞cdna1μl，ddh2o8μl。在本發明中，所述akt1基因的pcr擴增的反應程序優選為：95℃預變性5min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35個循環。

本發明在akt1基因pcr擴增得到目的片段后，將所述目的片段進行測序，得到akt1基因。本發明在所述的pcr擴增后優選的對目的片段進行純化，本發明對所述純化的方法沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的dna純化試劑盒進行即可。

本發明在所述純化完成后，優選將所述純化后的目的片段導入大腸桿菌dh5α感受態細胞中進行菌落pcr驗證，驗證為陽性克隆后進行測序。本發明在得到陽性克隆后，優選的采用菌落pcr的方法來驗證陽性克隆。在本發明中，所述菌落pcr的正向引物核苷酸序列為：5’-atgccgttgccagagacaccga-3’，反向引物核苷酸序列為：5’-tcaaaagatatacaagcgatc-3’；所述菌落pcr的體系為10μl，包括premixextaq5μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，ddh2o4μl。在本發明中，所述的將純化后的目的片段導入大腸桿菌dh5α感受態細胞所采用的方法為本領域常規的轉化大腸桿菌感受態細胞的方法，具體的在本發明實施例中采用以下方法：將所述目的片段與pmd19-t載體在16℃的條件下連接10～14h，得到連接產物；將所述連接產物轉化大腸桿菌dh5α感受態細胞，得到轉化后的大腸桿菌dh5α；將所述的轉化后的大腸桿菌dh5α接種于涂有氨芐青霉素的lb平板上進行篩選培養，得到陽性克隆。

本發明在菌落pcr驗證陽性克隆后，優選的，從已驗證的陽性克隆中隨機選取2～4個獨立的陽性克隆進行測序，得到所述的akt1基因的序列。基于akt1基因的鉀離子吸收和轉運性能，本發明還提供了一種煙草akt1基因在促進煙草植株鉀離子吸收和轉運方面的應用。本發明將所述的煙草akt1基因轉入到煙草植株中，使akt1基因超量表達以提高煙草植株的煙葉中鉀離子的含量。在本發明中，將所述的煙草akt1基因轉入到煙草植株的方法優選的為農桿菌介導法。

下面結合實施例對本發明提供的akt1基因及其功能驗證方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護范圍的限定。

實施例1

取0.5g煙草新鮮葉片，采用trizol法提取煙草細胞的總rna，然后采用takara公司的cdna合成試劑盒合成cdna，進一步采用primer5.0軟件設計并經過人工優化得到引物，所述引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列為：5’-atgccgttgccagagacaccga-3’，所述的反向引物的序列為5’-tcaaaagatatacaagcgatc-3’，以合成的cdna為模板，進行pcr擴增，pcr擴增體系為為20μl體系，包括premixextaq10μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，煙草細胞cdna1μl，ddh2o8μl；所述的pcr擴增的反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35個循環。

pcr擴增完成后，使用dna純化試劑盒進行目的片段的純化，將純化后的目的片段與pmd19-t載體16℃連接12h得到連接產物，將所述得到的連接產物轉化大腸桿菌dh5α感受態細胞得到轉化后的大腸桿菌dh5α，將所述的轉化后的大腸桿菌dh5α接種于涂有氨芐青霉素的lb平板上進行篩選培養得到陽性克隆。在得到陽性克隆后，采用菌落pcr的方法來驗證陽性克隆，所述菌落pcr的正向引物為：5’-atgccgttgccagagacaccga-3’，反向引物為：5’-tcaaaagatatacaagcgatc-3’；所述菌落pcr的體系為10μl，包括premixextaq5μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，ddh2o4μl。然后從已驗證的陽性克隆中隨機選取3個獨立的陽性克隆送到生物技術公司進行測序，本發明在測序后得到所述的akt1基因的序列，如seqidno.1所示。

實施例2

將連接有實施例1中所述的akt1基因的t-載體與表達載體p416分別進行雙酶切(酶切位點為：xbaⅰ和smaⅰ)，回收目的基因和表達載體p416，然后用連接酶連接，將連接后的重組酵母表達載體轉入大腸桿菌dh5α的感受態細胞，對轉化后的大腸桿菌單菌落進行pcr擴增、酶切來驗證是否構建成功，將構建成功的重組酵母表達載體轉入到r5421中具體步驟如下：用接菌環取保存的r5421酵母菌劃線于固體培養基ypda上，28℃培養12h；挑取r5421酵母單菌落于ep管中，加1mlypda培養液渦旋；將上述菌液全部轉入裝有ypda培養液的三角瓶中，于30℃，250rpm搖菌至od600＝1.2，16h；按1:10轉接，搖至od600＝1.0～1.2；于28℃，1000rpm離心5min集菌，用1/2體積的滅菌超純水重懸；于28℃，1000rpm離心5min集菌，吸干上清；依次加入下列成分(每5ml原始菌液)：

渦旋1min，使轉化體系完全混勻；放于30℃的水浴中溫育30min；再放入42℃的水浴中熱擊28min，冰上冷卻10min；7000rpm離心15s，棄上清；用1ml的無菌水輕輕重懸沉淀；取200μl轉化混合物鋪于營養缺陷型平板上；30℃培養3天。提取酵母質粒并鑒定結果

挑取酵母單克隆于加kcl的液體培養基中，培養至飽和；

收集菌液1.5ml，離心，棄上清，用200μl酵母提取液重懸沉淀；

加入0.45mm的無菌玻璃珠(promega)剛好低于液面，渦旋1min，加入200μl的酚/氯仿，再渦旋1min，離心取上清至另一新離心管中，再加入200μl的酚/氯仿，離心取上清；用60μl3m的naac和400μl無水乙醇，于-20℃沉淀dna，30min。離心，干燥，將質粒溶于15μl無菌水，進行pcr鑒定。

挑取鑒定過的酵母單菌落在營養缺陷平板上劃線，30℃培養3天；用牙簽在營養缺陷平板上蘸取少量菌體于2ml營養缺陷液中培養12h；8000rpm離心1min收集菌體；棄上清，用1ml雙蒸水懸浮菌體，8000rpm離心1min；棄上清，用1ml雙蒸水重懸浮，調od600為0.8；將未稀釋菌液及分別稀釋10倍、100倍后的菌液，分別取5ul在鉀離子濃度為0，2mm的培養基上，30℃培養3天觀察結果。

結果如圖1b所示，在鉀離子濃度為0mm培養基上，陰性對照p416幾乎不生長，本發明鉀轉運體和陽性對照akt1均可以生長，且生長明顯比p416好。隨著稀釋倍數的增加，鉀轉運體及陽性對照akt1仍然可以生長。

上述結果證明，本發明所述的akt1基因具有鉀吸收和轉運功能。

實施例3

使用農桿菌介導法將akt1基因轉入到煙草中使其超量表達得到轉基因煙草t1代，在得到轉基因煙草t1代后，使轉基因煙草t1自然繁殖得到轉基因煙草t2代，使用火焰光度計法對3個株系超量表達該基因的t2代轉基因煙草葉片進行鉀含量測定，結果表明3個轉基因株系鉀質量含量分別是1.61％.1.63％，1.65％，而同一條件下非轉基因煙草葉片中鉀離子的質量含量是0.84％，3個株系轉基因材料的鉀含量明顯高于非轉基因材料，說明該基因超量表達后能夠促進煙草對鉀的吸收。

由以上實施例可知，本發明所述的akt1基因具有促進鉀吸收和轉運功能。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。