本發明涉及抗菌肽，特別是能抑制和殺滅細菌的多肽，具體是一種能抑制和殺滅多種耐藥性細菌的新多肽。
背景技術：
：抗生素濫用導致病原微生物產生高水平抗藥性和多藥物抗性(multidrugresistance，MDR)已經成為世界性的難題。近幾年來，具有MDR的“超級病菌”在世界各地相繼爆發，嚴重威脅著人類的生命和健康安全。大量研究表明，致病菌通過基因的水平轉移等機制可獲得MDR，并抵抗多種臨床一線使用的抗生素。為了應對來自“超級耐藥細菌”日益嚴峻的挑戰，人們除了對現有抗生素進行修飾改良和發掘新型抗生素外，更寄希望于挖掘抗生素的替代物以緩解“超級耐藥細菌”所造成的世界衛生安全危機。技術實現要素：本發明的目的是提供一種能抑制和殺滅多種耐藥性細菌的新多肽，以解決上述
背景技術：
中存在的問題。本發明所述的能抑制和殺滅多種耐藥性細菌的新多肽，具體的是一種能抑制或殺滅以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、李斯特菌為代表的革蘭氏陽性菌，或以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌的新多肽。本發明的能抑制和殺滅多種耐藥性細菌的新多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.1-2所示。上述SEQIDNO.1-2所對應的被命名的編碼為XC-16，其序列如下：XC-16A：Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Val-Lys-Lys-Arg-Val-Arg-Ala-Phe-Trp-Ser-Leu（SEQIDNO.1）；XC-16B：Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Val-Lys-Lys-Val-Val-Arg-Ala-Phe-Arg-Ser-Leu（SEQIDNO.2）；上述抗菌肽的制備方法，采用現有的固相化學合成法中的BOC法制備。具體包括：一、樹脂合成1)PeptideacidMerrifieldResinandPAMResin2)PeptidecarboxamideMBHAResin二、肽鏈合成1)氨基酸的偶聯；2)N-端Boc基團的切除；在HF切割以前須將N-端Boc保護基團用TFA除去。手工切割N-端Boc基團方法是用TFA/DCM比為1：1的溶液在室溫條件下洗滌反應15min。三、切割1）切割前的樹脂準備：所有樹脂在切割前必須完全的洗凈和干燥。特殊情況處理：A）His的Dnp保護基團的切割：用最小體積的DMF溶脹樹脂；用20mol的苯硫酚處理1-2h；將樹脂轉移到黏結玻璃漏斗中，在用HF液體或TFMSA處理前以DMF，甲醇和冷乙醚頻繁沖洗。B）含Trp的多肽樹脂的脫甲?；阂泽w積比為1：10哌啶/DMF液放入圓底燒瓶中，并在冰浴中冷卻；加入多肽樹脂（1g/10mL），在0℃下攪拌反應2h；用DMF（5倍體積）洗兩次，DCM兩次，MeOH兩次；用HF切割前高真空干燥上述所得樹脂至少4h。2）HF切割標準HF切割法（0.2mmol）A）將多肽樹脂，聚四氟乙烯管和凈化劑混合物加入反應容器中。含Cys的多肽用HF/苯甲醚/DMS/p-苯甲硫酚（10：1：1：0.2），而不含Cys的用HF/DMS/苯甲醚（10：1：1）。B）將蓋子旋緊，切割前在冰的純甲醇中冷卻至少5min。C）在參照生產商的說明下蒸餾10mL的HF到瓶中。因為含Arg(Tos)的多肽切割會持續2h以上。D）反應最后，通過氮氣流蒸發HF和DMS。E）用TFA從樹脂上吸取出切除下的多肽。F）負壓下過濾移走樹脂，用TFA洗樹脂兩次。過濾篩選，加入8-10倍的冷乙醚。有時需要蒸發大多數TFA以得到粗品的沉淀物。3）切割后期處理：A）沉淀，在真空下在Hirsch漏斗中用硬濾紙過濾沉淀的肽。用冷醚沖洗沉淀物，在合適的緩沖溶液中溶解，然后凍干。B）離心，加入少量體積的叔丁甲醚在殘留物中，研磨，直到得到懸浮物，將懸浮物轉移到一個干凈的離心管中，密閉離心，自動離心機在這過程中是必須的。然后將醚從管中小心的倒出，并用醚重復洗滌，在合適的緩沖溶液里溶解殘留物，然后凍干。C）水溶性肽，沉淀后，加水到殘留物中，然后把混合物轉移到分液漏斗中，可以加入少量乙醇助溶。D）充分搖晃堵塞的漏斗，分散混合物，靜止分離，分離下層液（水）。E）加少量水到漏斗中，重復上述的搖晃—靜止—分離三次，移去上層液，然后放置于干凈的燒瓶中，將混合液轉移到分液漏斗中。F）加少量的新配二乙基醚，重復上述的搖晃—靜止—分離二到三次，每次都把醚層移去，把水層放到分液漏斗中，收集水層到干凈的燒瓶，凍干。本發明的另一個目的是提供上述新多肽的用途。所述用途是：在制備治療以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、李斯特菌為革蘭氏陰性菌或以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌感染藥物中的應用；進一步是在制備治療或預防獸用或人用的藥物中的應用，用以殺滅和抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、李斯特菌、大腸桿菌。所述的藥物可以包含上述本發明所定義的抗菌肽中的一種或多種的組合物；所述的藥物還可以包含有一種或一種以上醫藥上可接受的載體或添加劑，如為了實現促進酶解的活性酶，或者是增強分散能力的活性劑等；所述用途還涉及在制備畜禽用的飼料和/或飼料添加劑方面的應用。本發明的抗菌肽在上述應用中的使用劑量和使用條件，可以根據本領域的已知方法來確定。本發明經實驗表明，用于抑制和殺滅以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、李斯特菌為代表的革蘭氏陽性菌或以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌有顯著的效果。附圖說明圖1是抗菌肽XC-16A：殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（A）、李斯特菌（B）、大腸桿菌（C）的效果圖；圖2是抗菌肽XC-16B：殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（A）、李斯特菌（B）、大腸桿菌（C）的效果圖具體實施方式：實施例1最小抑菌濃度（MIC）評估，采用微量肉湯稀釋法。A、抗菌藥物和培養基制備抗菌藥物和培養基制備，同常量肉湯稀釋法。藥敏試驗用抗菌藥物濃度范圍：根據NCCLS抗菌藥物敏感性試驗操作標準，藥物濃度范圍應包含耐藥、中介和敏感分界點值。培養基：NCCLS推薦使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養基中生長良好。接種物的制備,用接種環挑取形態相似待檢菌落3~5個，接種于4~5mL的水解酪蛋白（MH）肉湯中，35℃孵育2~6h。增菌后的對數生長期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥氏比濁標準，約含1~2×108CFU/mL。B、MIC板制備MIC板制備：無菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加藥液，每孔10WμL，第12孔不加藥作為生長對照，冰凍干燥后密封，-20℃以下保存備用。C、接種物制備將用生長法或直接菌懸液法制備的濃度相當于0.5麥氏比濁標準的菌懸液，經MH肉湯1：1000稀釋后，向每孔中加100μL，密封后置35℃普通空氣孵箱中，孵育16~20h判斷結果。此時，第1孔至第11孔藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。D、結果判斷結果判斷：以在小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。當陽性對照孔（即不含抗生素）內細菌明顯生長試驗才有意義。當在微量肉湯稀釋法出現單一的跳孔時，應記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度。結果見下表多肽編號耐甲氧西林金黃色葡萄球菌單核細胞增生李斯特菌大腸桿菌XC-16A16μg/ml16μg/ml64μg/mlXC-16B16μg/ml8μg/ml32μg/ml本實驗中使用：大腸桿菌(Escherich)ATCC25922、李斯特菌(Monocuteproliferation)ATCC19115。實施例2最低殺菌濃度測試（MBC）最小殺菌濃度（minimumbactericidalconcentration，MBC）：殺死99.9%（降低3個數量級）的供試微生物所需的最低藥物濃度。二倍稀釋測最小殺菌濃度：就是將藥物濃度依次減半（倍比稀釋），比如在96孔板的某行/列做MBC，每個孔均加入10μL藥液，第一個孔藥液濃度是100μg/mL，第二個孔是50μg/mL，第三個25μg/mL……。操作起來就是比如第一個孔加20μL藥液，從第一個孔吸取10μL藥液到第二孔，加培養液10μL，混勻后，從中吸取10μL加進第三孔里，再加培養液10μL混勻……。最低至哪個濃度，已經沒有活細菌了，該濃度即為MBC。結果見圖1~2。其中，HR---小時，μg/ml---濃度，CFUreduction%---菌落減少百分比。本實驗中使用：大腸桿菌(Escherich)ATCC25922、李斯特菌(Monocuteproliferation)ATCC19115。XC-16A：Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Val-Lys-Lys-Arg-Val-Arg-Ala-Phe-Trp-Ser-Leu（SEQIDNO.1）XC-16B：Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Val-Lys-Lys-Val-Val-Arg-Ala-Phe-Arg-Ser-Leu（SEQIDNO.2）當前第1頁1 2 3