本發(fā)明屬于木質纖維素利用及能源化工應用領域，具體涉及一種利用兩種深度共熔溶劑分步預處理以提高水稻秸稈中纖維素酶解效率的綠色方法。
背景技術：
以來源廣泛、廉價、可再生的木質纖維素生物質如農業(yè)廢棄物為原料生產生物燃料和相關平臺化合物是解決目前全球環(huán)境污染和能源危機的最具潛力路徑之一。木質纖維素生物質的主要成分為纖維素、半纖維素和木質素，因物種、來源、部位的差異，這三類生物高分子的結構和比例也有所不同。目前，木質纖維素生物質的有效轉化涵蓋了生物質組分全利用的生物煉制產業(yè)，包括由纖維素獲得可發(fā)酵單糖、纖維基材料，由半纖維素獲得糠醛、糖醇等化學品，由木質素得到芳香族化合物、塑料產品以及其它衍生物。由于其天然的復雜結構特性，木質纖維素生物質具有超強的化學和生物降解抗性，要想將其三大組分有效轉化，需要尋找綠色的方法將其分離，因而尋找作用于木質纖維素生物質的綠色溶劑將其組分解構成為可再生生物燃料和生物基高附加值化學品獲得過程中的有效途徑之一。
用于木質纖維素生物質分解為纖維素、半纖維素和木質素及其相關產品的傳統(tǒng)溶劑，如有機溶劑或者無機酸堿，往往存在源于化石資源、不可再生、污染環(huán)境、對設備和操作要求高等缺點。而后自2002年美國著名科學家Rogers領導的研究組開創(chuàng)了利用離子液體溶解纖維素的新領域，人們發(fā)現(xiàn)某些離子液體可作為一類“綠色”溶劑成功地用于木質纖維素生物質預處理。隨后，離子液體用于木質纖維素生物質的溶解和組分分離的研究得到了長足發(fā)展。總體來說，離子液體用于木質纖維素原料預處理的發(fā)展趨勢主要有兩方面：1)離子液體的種類向綠色可再生、合成簡便、廉價的方向擴展；2)離子液體對木質纖維素生物質組分的分離作用方式由“全溶解”到“萃取分離”的轉變。但目前大部分用于木質纖維素預處理的離子液體來源不可再生、毒性大、難降解，并且相對于酸堿預處理法而言，成本較高，這也是制約其工業(yè)化應用的最大障礙。即使是申請人團隊以往發(fā)明的可再生的[膽堿][氨基酸]離子液體的應用，雖其合成方法相對簡單、成本有所降低，且預處理可獲得較高的可發(fā)酵糖收率，但仍存在一些合成過程能耗仍相對較大、效率偏低、穩(wěn)定性不夠高、堿性強等缺點。因此，開發(fā)更為綠色、廉價的新型溶劑體系，提高木質纖維素組分的利用效率迫在眉睫。
深度共熔溶劑(DES)，是一類由季銨鹽、天然堿等氫鍵受體和有機酸、酰胺、甘油或碳水化合物等氫鍵供體組成的共熔混合物。類似離子液體，DES也具有不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性高、對各種有機物和無機物溶解能力強、熔點低等優(yōu)點，并且同樣具有可設計性。與離子液體相比，DES的原料均為廉價、易大量獲取的生物基材料，因而可完全生物降解；其合成步驟簡單，僅需將兩種組分在一定的溫度(如80℃)下簡單地攪拌混合即可獲得成品，合成收率為100％，無需純化；且無需使用溶劑、零排放，環(huán)境友好。總之，環(huán)境友好、廉價、生物相容性好的特性使DES更勝離子液體一籌。自Abbott等報道了此類新型溶劑體系以來，DES在生物催化、金屬電極沉淀、天然產物萃取、生物催化等方面的應用受到了越來越多的關注和研究。最值得注意的是，DES在多糖的溶解方面也表現(xiàn)出良好的應用前景，近來人們陸續(xù)用各種不同組分組成的DES如對纖維素、淀粉、木質素、幾丁質等進行溶解研究。進而在木質纖維素生物質預處理方面，一些新的成果也開始出現(xiàn)。如加拿大的Procentese等人，探討了用氯化膽堿：甘油(1:2)、氯化膽堿：尿素(1:2)和氯化膽堿：咪唑(3:7)分別對玉米棒進行預處理，隨后探討其糖化效率。通過研究不同的溫度(80，115，150℃)下，玉米棒回收率、結構組分變化、酶解效率和糖收率以及抑制劑的形成等因素，發(fā)現(xiàn)氯化膽堿/咪唑在80℃下處理玉米棒15h后，酶水解總糖收率達76％，其中葡萄糖和木糖收率分別為86％和63％。隨后，馬來西亞學者Gunny等人研究了三種DES(氯化膽堿/甘油、氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/蘋果酸；摩爾比1:2)預處理稻殼后(115℃，3h)不經分離直接添加緩沖液稀釋后，加入纖維素酶進行酶水解過程研究(DES濃度10％)，最終DNS法測定體系還原糖含量顯示各種方法優(yōu)劣順序為：氯化膽堿/乙二醇>氯化膽堿/甘油>氯化膽堿/蘋果酸>稀堿處理>未處理，且纖維素酶在含10％氯化膽堿/甘油或氯化膽堿/乙二醇體系中其活性可維持90％以上。最近，各種酸性DES用于木質纖維素生物質預處理開始出來，如江南大學Xu等人發(fā)現(xiàn)以氯化膽堿和各種有機酸如甲酸、乙酸、檸檬酸等組成的DES(兩者摩爾比為1:2或1:1)進行玉米秸稈的預處理和后續(xù)的酶解及微生物丁醇發(fā)酵研究。結果發(fā)現(xiàn)，以氯化膽堿/甲酸(摩爾比1：2)130℃下預處理玉米秸稈3h，葡萄糖產量和得率分別為17.0g/L和99％，丁醇得率為0.17g/g總糖，生產效率達0.12g/(L·h)。關于酸性DES，最近也有印度科學家嘗試新的組合，如乳酸/甜菜堿、乳酸/氯化膽堿，當以乳酸/氯化膽堿(摩爾比5:1)60℃下預處理水稻秸稈12h，60％的木質素可被提取，酶水解24h糖化率為36％。此外，作者發(fā)現(xiàn)若預處理過程添加5％的水，木質素提取率在以前的基礎上提高22％左右。
綜上可見，目前DES用于木質纖維素生物質的預處理方面報道開始展露，但并不多，從已有的報道可知它們在該方面的應用有替代離子液體的潛力，但存在以下幾個缺點：(1)預處理效果好的DES氫鍵供體組成單一，主要集中在甘油、乙二醇和乳酸；(2)對于預處理效果較差的DES組成沒有應對方法以提高其作用效果。因此，在DES組分的種類和比例上進行調整和更改以篩選目標DES并非唯一手段，可以采用多種DES組合和分步處理的方式來提高某些DES的可利用性。
技術實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術的缺點和不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種利用兩種深度共熔溶劑分步預處理以提高水稻秸稈中纖維素酶解效率的綠色方法，該方法可獲得較高葡萄糖收率。以兩種深度共熔溶劑組合、分步預處理木質纖維素的方法，克服了某些單一深度共熔溶劑預處理效果差、利用效率低的缺點。
本發(fā)明目的通過以下技術方案實現(xiàn)：
一種利用兩種深度共熔溶劑分步預處理以提高水稻秸稈中纖維素酶解效率的綠色方法，包括以下步驟：
(1)將水稻秸稈經干燥后，粉碎成平均粒徑為150～350μm的水稻秸稈粉；
(2)以深度共熔溶劑A為預處理溶劑，將質量比為1:5～1:25的水稻秸稈粉和深度共熔溶劑A混合，于80～130℃下攪拌2～6小時，隨后冷卻至室溫，加入1～3倍深度共熔溶劑A體積的溫水，過濾、洗滌濾渣，干燥后獲得預處理后的水稻秸稈；將經過深度共熔溶劑A預處理后的水稻秸稈與深度共熔溶劑B混合，同樣于80～130℃下攪拌2～6小時，隨后冷卻至室溫，加入1～3倍深度共熔溶劑B體積的溫水，過濾、洗滌濾渣，干燥后獲得最終的水稻秸稈樣品；所述深度共熔溶劑B的質量與深度共熔溶劑A的質量相同；
(3)稱取步驟(2)最終獲得的水稻秸稈樣品，按照固液比為1～5mg/mL加入檸檬酸鹽緩沖液，再按照6～20U/mg水稻秸稈樣品的比例加入商品化纖維素酶，在轉速為150～250r/min以及溫度為40～60℃的條件下進行反應，測定水解液中葡萄糖濃度，直至水解液中葡萄糖濃度不再變化，終止反應。
步驟(2)中所述的深度共熔溶劑A包括摩爾比為1：3的蘋果酸和脯氨酸，或者摩爾比為1：2的氯化膽堿和尿素，或者摩爾比為2：1的氯化膽堿和草酸；所述的深度共熔溶劑B包括摩爾比為1：3的蘋果酸和脯氨酸，或者摩爾比為1：2的氯化膽堿和尿素，或者摩爾比為2：1的氯化膽堿和草酸；所述深度共熔溶劑A和深度共熔溶劑B是不同物質。
步驟(3)中所述的檸檬酸鹽緩沖液的濃度為50mmol/L，其pH值為4.8。
步驟(3)中所述的商品化纖維素酶是來源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的纖維素酶。
本發(fā)明的原理是：
因為不同深度共熔溶劑對木質纖維素的主要組分的作用方式不同(氯化膽堿/尿素主要作用于木質素，蘋果酸/脯氨酸作用于木質素和部分纖維素，氯化膽堿草酸主要作用于半纖維素和部分纖維素)，兩種溶劑分先后聯(lián)合作用更有利于木質纖維素原本緊致的復雜網絡結構分解和溶脹，提高多糖組分的比表面積和可及度，因而酶水解效率較單一DES預處理明顯提高。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點及有益效果：
(1)本發(fā)明利用兩種深度共熔物作為溶劑來分兩步預處理水稻秸稈，明顯增強了水稻秸稈的酶解效率，提高了可發(fā)酵的葡萄糖收率。且比單一使用這些DES效果明顯提高，拓展了某些綠色溶劑的使用范圍、提高了其利用率。
(2)基于生物基可再生資源的深度共熔溶劑具有低毒、可再生、可生物降解、合成工藝簡便綠色、成本低廉等特點，故以該類深度共熔溶劑為木質纖維素的預處理溶劑，預處理工藝環(huán)境友好、符合綠色化學發(fā)展策略，克服傳統(tǒng)預處理工藝環(huán)境不友好、離子液體預處理工藝成本高等缺陷。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1
以氯化膽堿/草酸(摩爾比2：1，深度共熔溶劑A)和氯化膽堿/尿素(摩爾比1：2，深度共熔溶劑B)分兩步先后預處理提高水稻秸稈酶解效率
a)預處理：精確稱量300mg水稻秸稈粉(將水稻秸稈經干燥后，粉碎成平均粒徑為150～350μm的水稻秸稈粉)和6g氯化膽堿/草酸以摩爾比2：1組成的深度共熔溶劑A，共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流攪拌2小時；隨后冷卻至室溫，加入6g溫水稀釋、過濾，再用18g去離子水洗滌濾渣4次，濾渣經干燥后，再添加6g氯化膽堿/尿素以摩爾比1：2組成的深度共熔溶劑B共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流攪拌2小時；隨后冷卻至室溫，加入6g溫水稀釋、過濾，再用18g去離子水洗滌濾渣4次，濾渣經干燥后獲得水稻秸稈樣品，保存于冰箱備用。
b)酶解：精確稱量上述預處理后的水稻秸稈樣品20mg，置于50mL的三角瓶中，加入7mL檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH 4.8)和160U來源于里氏木霉的商品化纖維素酶，密封后置于200r/min、50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200μL，于100℃下處理3分鐘以淬滅酶反應；離心(10000g)后，利用高效液相色譜測定葡萄糖濃度，直至水解液中葡萄糖濃度不再變化，終止反應。根據預處理前水稻秸稈中葡萄糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖收率，如表1。
表1實施例1的葡萄糖收率
實施例2
以氯化膽堿/尿素(摩爾比1：2，深度共熔溶劑B)和氯化膽堿/草酸(摩爾比2：1，深度共熔溶劑A)分先后兩步預處理提高水稻秸稈酶解效率
a)預處理：精確稱量300mg水稻秸稈粉(將水稻秸稈經干燥后，粉碎成平均粒徑為150～350μm的水稻秸稈粉)和6g深度共熔溶劑B，共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流攪拌2小時；隨后冷卻至室溫，加入6g溫水稀釋、過濾，再用18g去離子水洗滌濾渣4次，濾渣經干燥后，再添加6g深度共熔溶劑A共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流攪拌2小時；隨后冷卻至室溫，加入6g溫水稀釋、過濾，再用18g去離子水洗滌濾渣4次，濾渣經干燥后獲得水稻秸稈樣品，保存于冰箱備用。
b)酶解：精確稱量上述預處理后的水稻秸稈樣品20mg，置于50mL的三角瓶中，加入7mL檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH 4.8)和160U來源于里氏木霉的商品化纖維素酶，密封后置于200r/min、50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200μL，于100℃下處理3分鐘以淬滅酶反應；離心(10000g)后，利用高效液相色譜測定葡萄糖濃度，直至水解液中葡萄糖濃度不再變化，終止反應。根據預處理前水稻秸稈中葡萄糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖收率，如表2。
表2實施例2的葡萄糖收率
對比例1
以氯化膽堿/草酸(摩爾比2：1)一步預處理提高水稻秸稈酶解效率
a)預處理：精確稱量300mg水稻秸稈粉(將水稻秸稈經干燥后，粉碎成平均粒徑為150～350μm的水稻秸稈粉)和6g氯化膽堿/草酸以摩爾比2：1組成的深度共熔溶劑，共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流攪拌4小時；隨后冷卻至室溫，加入6g溫水稀釋、過濾，再用18g去離子水洗滌濾渣4次，濾渣經干燥后保存于冰箱備用。
b)酶解：精確稱量上述預處理后的水稻秸稈20mg，置于50mL的三角瓶中，加入7mL檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH 4.8)和160U來源于里氏木霉的商品化纖維素酶，密封后置于200r/min、50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200μL，于100℃下處理3分鐘以淬滅酶反應；離心(10000g)后，利用高效液相色譜測定葡萄糖濃度，直至水解液中葡萄糖濃度不再變化，終止反應。根據預處理前水稻秸稈中葡萄糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖收率，如表3。
表3對比例1的葡萄糖收率
對比例2
以氯化膽堿/尿素(摩爾比1：2)一步預處理提高水稻秸稈酶解效率
a)預處理：精確稱量300mg水稻秸稈粉(將水稻秸稈經干燥后，粉碎成平均粒徑為150～350μm的水稻秸稈粉)和6g氯化膽堿/尿素以摩爾比1：2組成的深度共熔溶劑，共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流攪拌4小時；隨后冷卻至室溫，加入6g溫水稀釋、過濾，再用18g去離子水洗滌濾渣4次，濾渣經干燥后保存于冰箱備用。
b)酶解：精確稱量上述預處理后的水稻秸稈20mg，置于50mL的三角瓶中，加入7mL檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH 4.8)和160U來源于里氏木霉的商品化纖維素酶，密封后置于200r/min、50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200μL，于100℃下處理3分鐘以淬滅酶反應；離心(10000g)后，利用高效液相色譜測定葡萄糖濃度，直至水解液中葡萄糖濃度不再變化，終止反應。根據預處理前水稻秸稈中葡萄糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖收率，如表4。
表4對比例2的葡萄糖收率
實施例3
以蘋果酸/脯氨酸(摩爾比1：3，深度共熔溶劑A)和氯化膽堿/尿素(摩爾比1：2，深度共熔溶劑B)分兩步先后預處理提高水稻秸稈酶解效率
a)預處理：精確稱量300mg水稻秸稈粉(將水稻秸稈經干燥后，粉碎成平均粒徑為150～350μm的水稻秸稈粉)和6g摩爾比為1：3的蘋果酸/脯氨酸深度共熔溶劑A，共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流攪拌6小時；隨后冷卻至室溫，加入6g溫水稀釋、過濾，再用18g去離子水洗滌濾渣4次，濾渣經干燥后再添加6g摩爾比為1：2的氯化膽堿/尿素深度共熔溶劑B，同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流攪拌6小時；隨后冷卻至室溫，加入6g溫水稀釋、過濾，再用18g去離子水洗滌濾渣4次，濾渣經干燥后獲得水稻秸稈樣品，保存于冰箱備用。
b)酶解：精確稱量上述預處理后的水稻秸稈樣品20mg，置于50mL的三角瓶中，加入7mL檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L,pH 4.8)和160U來源于里氏木霉的商品化纖維素酶，密封后置于200r/min、50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200μL，于100℃下處理3分鐘以淬滅酶反應；離心(10000g)后，利用高效液相色譜測定葡萄糖濃度，直至水解液中葡萄糖濃度達到最大，終止反應。根據預處理前水稻秸稈中葡萄糖的理論產量，即可計算得到最終的葡萄糖收率，如表5。
表5實施例3的葡萄糖收率
實施例4
以氯化膽堿/尿素(摩爾比1：2，深度共熔溶劑B)和蘋果酸/脯氨酸(摩爾比1：3，深度共熔溶劑A)分兩步先后預處理提高水稻秸稈酶解效率
a)預處理：精確稱量300mg水稻秸稈粉(將水稻秸稈經干燥后，粉碎成平均粒徑為150～350μm的水稻秸稈粉)和6g深度共熔溶劑B，共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流攪拌6小時；隨后冷卻至室溫，加入6g溫水稀釋、過濾，再用18g去離子水洗滌濾渣4次，濾渣經干燥后再添加6g摩深度共熔溶劑A，同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流攪拌6小時；隨后冷卻至室溫，加入6g溫水稀釋、過濾，再用18g去離子水洗滌濾渣4次，濾渣經干燥后獲得水稻秸稈樣品，保存于冰箱備用。
b)酶解：精確稱量上述預處理后的水稻秸稈樣品20mg，置于50mL的三角瓶中，加入7mL檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L,pH 4.8)和160U來源于里氏木霉的商品化纖維素酶，密封后置于200r/min、50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200μL，于100℃下處理3分鐘以淬滅酶反應；離心(10000g)后，利用高效液相色譜測定葡萄糖濃度，直至水解液中葡萄糖濃度達到最大，終止反應。根據預處理前水稻秸稈中葡萄糖的理論產量，即可計算得到最終的葡萄糖收率，如表6。
表6實施例4的葡萄糖收率
對比例3
以蘋果酸/脯氨酸(摩爾比1：3)一步預處理提高水稻秸稈酶解效率
a)預處理：精確稱量300mg水稻秸稈粉(將水稻秸稈經干燥后，粉碎成平均粒徑為150～350μm的水稻秸稈粉)和6g摩爾比為1：3的蘋果酸/脯氨酸深度共熔溶劑，共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流攪拌12小時；隨后冷卻至室溫，加入6g溫水稀釋、過濾，再用18g去離子水洗滌濾渣4次，濾渣經干燥后保存于冰箱備用。
b)酶解：精確稱量上述預處理后的水稻秸稈20mg，置于50mL的三角瓶中，加入7mL檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L,pH 4.8)和160U來源于里氏木霉的商品化纖維素酶，密封后置于200r/min、50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200μL，于100℃下處理3分鐘以淬滅酶反應；離心(10000g)后，利用高效液相色譜測定葡萄糖濃度，直至水解液中葡萄糖濃度不再變化，終止反應。根據預處理前水稻秸稈中葡萄糖的理論產量，即可計算得到最終的葡萄糖收率，如表7。
表7對比例3的葡萄糖收率
對比例4
以氯化膽堿/尿素(摩爾比1:2)一步預處理提高水稻秸稈酶解效率
a)預處理：精確稱量300mg水稻秸稈粉(將水稻秸稈經干燥后，粉碎成平均粒徑為150～350μm的水稻秸稈粉)和6g摩爾比為1：2的氯化膽堿/尿素深度共熔溶劑，共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流攪拌12小時；隨后冷卻至室溫，加入6g溫水稀釋、過濾，再用18g去離子水洗滌濾渣4次，濾渣經干燥后保存于冰箱備用。
b)酶解：精確稱量上述預處理后的水稻秸稈20mg，置于50mL的三角瓶中，加入7mL檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L,pH 4.8)和160U來源于里氏木霉的商品化纖維素酶，密封后置于200r/min、50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200μL，于100℃下處理3分鐘以淬滅酶反應；離心(10000g)后，利用高效液相色譜測定葡萄糖濃度，直至水解液中葡萄糖濃度不再變化，終止反應。根據預處理前水稻秸稈中葡萄糖的理論產量，即可計算得到最終的葡萄糖收率，如表8。
表8對比例4的葡萄糖收率
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。