本發(fā)明涉及一種促進(jìn)靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
靈芝(Ganoderma lucidum)是世界上最著名的大型擔(dān)子菌，具有很高的營養(yǎng)價值和保健作用。靈芝多糖是靈芝的主要活性物質(zhì)之一，分為靈芝子實體和靈芝菌絲體中的靈芝胞內(nèi)多糖以及靈芝液體培養(yǎng)基中的靈芝胞外多糖。目前，靈芝的培養(yǎng)方式為固體發(fā)酵和深層液體發(fā)酵，傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵方式可以獲得靈芝子實體，進(jìn)而可以提取多糖等活性物質(zhì)，生產(chǎn)成本較低，但是固體發(fā)酵產(chǎn)量小，耗費人力，周期較長，已經(jīng)不能滿足人們?nèi)找栽鲞M(jìn)的需求；液體深層發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)靈芝，大大增加了菌絲體、多糖等活性物質(zhì)的產(chǎn)量，成為現(xiàn)代靈芝發(fā)酵的主要方式，但是液體深層發(fā)酵過程中的攪拌、通氣、無菌控制等操作加大了靈芝多糖的生產(chǎn)成本，使靈芝以及多糖等活性物質(zhì)的價格居高不下。因此，尋找與發(fā)現(xiàn)一種生產(chǎn)成本低、多糖產(chǎn)量高，又可以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的方法是靈芝多糖研究的重要方向之一。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的方法，所述方法是將靈芝接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行淺層發(fā)酵；所述淺層發(fā)酵是控制發(fā)酵過程培養(yǎng)基的液面高度為0.1～5cm。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述淺層發(fā)酵是控制發(fā)酵過程培養(yǎng)基的液面高度為0.5～5cm。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述接種是每100ml發(fā)酵液接種菌絲體濕重為0.2-1.0g的種子液。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵過程控制發(fā)酵溫度為20-33℃。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基每L含有：葡萄糖15～25g，胰蛋白胨4～8g，無氨基酵母4～6g，七水硫酸鎂1～3g，磷酸二氫鉀2～4g，初始pH 5.5～6.5。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基每L含有：葡萄糖20g，胰蛋白胨5g，無氨基酵母5g，七水硫酸鎂2g，磷酸二氫鉀3g，初始pH 6。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵為好氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中需要與外界進(jìn)行氣體交換。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵為靜置培養(yǎng)發(fā)酵。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵過程每6～48h對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌、搖動。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵過程每6～48h對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行150～250rpm攪拌5～15min。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述靈芝替換為除靈芝外的其它食用、藥用真菌。
本發(fā)明還提供所述方法在以包括靈芝在內(nèi)的食用、藥用真菌生產(chǎn)胞外多糖中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供所述方法生產(chǎn)的靈芝胞外多糖，所述方法生產(chǎn)的胞外多糖中葡萄糖含量占總組分的比例≤80％，具有抑制腫瘤細(xì)胞活性、抗氧化等生物活性。
有益效果：本發(fā)明的方法與固態(tài)發(fā)酵相比發(fā)酵周期較短，與液態(tài)發(fā)酵相比不嚴(yán)格需要攪拌、通氣等設(shè)備，降低設(shè)備和生產(chǎn)成本，單位菌體的多糖產(chǎn)量顯著提高，由0.086g/g菌體提高至0.243g/g菌體，提高了1.83倍，更利于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施方式
生物量測定：發(fā)酵液過濾后，菌絲體于60℃烘干至恒重。
胞外多糖測定：取上述濾液1ml，加4倍體積95％工業(yè)酒精醇沉過夜，離心后去上清，沉淀加去離子水溶解，采用苯酚-硫酸法對靈芝胞外多糖進(jìn)行測定。
培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，無氨基酵母(YNB)5，七水硫酸鎂2g，磷酸二氫鉀3g，初始pH＝6.0，用于靈芝的種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)。
靈芝種子培養(yǎng)：取0.5cm2大小的菌塊，接種于80mL種子培養(yǎng)基中(250ml三角瓶)，150r·min-1、30℃培養(yǎng)7d獲得種子液。
實施例1
靜置培養(yǎng)與搖床培養(yǎng)比較：500ml三角瓶中加入150ml(液面高度約2cm)培養(yǎng)基，按每100ml發(fā)酵液接種濕重為0.5g的種子培養(yǎng)基，30℃靜置培養(yǎng)6d；以相同條件下?lián)u床培養(yǎng)為對照，搖床轉(zhuǎn)速150r·min-1。發(fā)酵結(jié)束測定菌體生物量和胞外多糖含量。當(dāng)靜置培養(yǎng)時，每克菌體所產(chǎn)胞外多糖為0.179g；對照組每克菌體所產(chǎn)胞外多糖為0.086g。
實施例2
不同液面高度的靈芝發(fā)酵培養(yǎng)：500ml三角瓶中加入適量培養(yǎng)基，使液面高度分別控制在0.1、0.5、1、2、5cm，按每100ml發(fā)酵液接種濕重為0.5g的種子液，30℃靜置培養(yǎng)6d。發(fā)酵結(jié)束測定菌體生物量和胞外多糖含量。當(dāng)液面高度為0.1cm時，每克菌體所產(chǎn)胞外多糖為0.104g；當(dāng)液面高度為0.5cm時，每克菌體所產(chǎn)胞外多糖為0.148g，；當(dāng)液面高度為1cm時，每克菌體所產(chǎn)胞外多糖為0.166g；當(dāng)液面高度為2cm時，每克菌體所產(chǎn)胞外多糖為0.179g；當(dāng)液面高度為5cm時，每克菌體所產(chǎn)胞外多糖為0.242g。
實施例3
培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同實施例1。實驗組液面高度為0.5cm，分別每間隔6、12、24、48h于搖床30℃，150r·min-1培養(yǎng)10min，對照組為全程靜置培養(yǎng)。發(fā)酵時間為6天。發(fā)酵結(jié)束測定菌體生物量和胞外多糖含量。當(dāng)間隔時間為6h時，每克菌體所產(chǎn)胞外多糖可達(dá)0.127g；當(dāng)間隔時間為12h時，每克菌體所產(chǎn)胞外多糖可達(dá)0.136g；當(dāng)間隔時間為24h時，每克菌體所產(chǎn)胞外多糖可達(dá)0.145g；當(dāng)間隔時間為48h時，每克菌體所產(chǎn)胞外多糖可達(dá)0.157g；當(dāng)全程靜置培養(yǎng)時，每克菌體所產(chǎn)胞外多糖可達(dá)0.148g。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。