本發(fā)明涉及干巴菌多糖技術領域，特別涉及一種干巴菌菌絲體多糖，還涉及所述干巴菌菌絲體多糖的制備方法及其應用。

背景技術：

干巴菌（Thelephora ganbajun Zang）是我國特有的革菌屬（Thelephora）珍稀野生食用菌，口感好營養(yǎng)價值高，僅僅分布在我國滇中800～2300 m高海拔地區(qū)的弱酸性紅壤地面上。干巴菌與松樹有外生菌根關系，人工栽培難以成功，因此導致干巴菌無序亂采現(xiàn)象嚴重，產(chǎn)量逐年下降，每年干巴菌上市時總是供不應求，價格逐年升高。由于其分布的局限性，國內外對干巴菌的研究極為有限，主要集中在干巴菌的分類、菌種分離、菌種鑒定和生態(tài)環(huán)境等方面。因此，干巴菌是一種具有極高經(jīng)濟價值及營養(yǎng)價值的亟待研究開發(fā)的菌種資源。

目前應用于化妝品的多糖類保濕劑主要有透明質酸、甲殼素及其衍生物、植物多糖提取物、肝素等。近年來將具有生物活性的食用真菌多糖作為保濕劑應用于化妝品，滿足了人們對高品質化妝品的需求，成為保濕化妝品的發(fā)展趨勢。干巴菌菌絲體多糖（Mycelia polysaccharide, MPS）良好的保濕和抗氧化特性是化妝品市場最重要的功能性訴求。

自由基是機體細胞代謝過程中產(chǎn)生的活性物質，如果自由基在體內過多積累就會引起生物膜的不飽和脂類發(fā)生氧化反應，形成脂質過氧化物，從而引起細胞結構和功能的改變，造成對機體的損害，引起各種疾病，這就是引起機體衰老的主要原因。干巴菌MPS可以清除體內的自由基，進而起到保護生物膜和延緩衰老的作用。

因此，干巴菌MPS可以作為天然、營養(yǎng)、安全的化妝品保濕劑和抗衰老功能食品，從而為干巴菌資源開發(fā)提供有效的途徑。

陸文娟等在《響應面法優(yōu)化提取干巴菌多糖的工藝研究》《南京師范大學學報(工程技術版)》，2015，15（3）：84-92，以干巴菌子實體為原料，采用超聲細胞破碎法提取其多糖，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法對提取工藝進行優(yōu)化，通過Box-Behnken設計，建立并分析了各因素與多糖得率關系的數(shù)學模型，結果顯示，最佳工藝條件為：液料比為38:1，提取時間為3 h，提取溫度為88℃，超聲功率為603 W，重復2次，測定干巴菌多糖的得率為5.96%。但并沒有涉及干巴菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)、干巴菌多糖的分離純化以及具有清除自由基、抗氧化功效的多糖組分。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術中干巴菌多糖在提取和應用中存在的利用不充分的問題，本申請?zhí)峁┝擞筛砂途辏?i>Thelephoraganbajun Zang）TG-1發(fā)酵得到的菌絲體多糖。本課題組從云南地區(qū)分離純化得到了一株干巴菌菌株（TG-1），并且研究發(fā)現(xiàn)干巴菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)時菌絲體生長旺盛，多糖產(chǎn)量高，并且通過抗氧化實驗和保濕實驗證明干巴菌菌絲體多糖（MPS）具有良好的保濕和抗氧化特性。

本申請還提供了所述干巴菌菌絲體多糖的制備方法。

本申請還提供了所述干巴菌菌絲體多糖的應用。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

一種干巴菌菌絲體多糖，是通過以下步驟得到的：

保藏編號為CGMCC No.12977干巴菌菌株TG-1在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，菌絲體經(jīng)過分離，提取干巴菌菌絲體多糖MPS，然后經(jīng)過陰離子交換柱層析分離，依次用去離子水、0.05、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液進行洗脫，分別得到干巴菌多糖組分MPS-1、MPS-2、MPS-3和MPS-4。

所述的干巴菌菌絲體多糖，優(yōu)選液體培養(yǎng)基中含有馬鈴薯150～250 g/L，葡萄糖15～25 g/L，蛋白胨1～3 g/L，硫酸鎂0.5～2.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5～2.5 g/L，pH為4.5～7，于15～30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)。

所述的干巴菌菌絲體多糖，菌絲體經(jīng)過分離，提取干巴菌菌絲體多糖的優(yōu)選操作如下：

（1）將菌絲體分離后烘干或凍干，并粉碎得到干巴菌菌絲體粉末；

（2）干巴菌菌絲體粉末與去離子水以1﹕10～1﹕30的比例混合，調節(jié)pH值為7～9，超聲波破碎，超聲功率為200～800 w，超聲時間為5～20 min，然后置于50～100 ℃水浴中，提取1～3 h，離心取上清液；

（3）離心后的菌絲體殘渣按步驟（2）再提取2～4次，合并上清液；

（4）將上清液濃縮至原體積的3/4～1/2，加入1～3倍體積乙醇，靜置至沉淀完全析出，3000～15000 r/min離心5～15 min，棄上清并于40～60 ℃條件下烘干，烘干后再次溶解，離心，上清液去蛋白至少3次，凍干后即為干巴菌菌絲體多糖。

所述的干巴菌菌絲體多糖，優(yōu)選干巴菌菌絲體多糖經(jīng)過陰離子交換柱層析分離操作如下：

將干巴菌菌絲體多糖溶于去離子水中，得到上樣溶液，將上樣溶液用規(guī)格為1.6 × 30 cm的DEAE-52纖維素陰離子交換柱進行層析分離，依次用去離子水和0.05、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液進行洗脫，洗脫液的流速為1 mL/min，分別得到的洗脫組分凍干后即為干巴菌多糖組分MPS-1，MPS-2，MPS-3和MPS-4。

所述的干巴菌菌絲體多糖在制備抗衰老保健品和化妝品中的應用。

優(yōu)選干巴菌菌絲體多糖為干巴菌多糖MPS及其組分MPS-1、MPS-2、MPS-3和MPS-4。

所述的保健品是具有清除自由基、抗氧化作用的保健品。

所述的化妝品是具有清除自由基、抗氧化和保濕作用的化妝品。

有益效果：

1）利用液體發(fā)酵途徑，制備干巴菌菌絲體多糖，為干巴菌的資源化利用提供了一條有效途徑；

2）干巴菌菌株TG-1在液體發(fā)酵培養(yǎng)時菌絲體生長旺盛，菌絲體多糖產(chǎn)量高，因此，干巴菌菌株TG-1對干巴菌的開發(fā)利用及干巴菌菌絲體多糖的規(guī)模化生產(chǎn)具有非常重要的意義；

3）抗氧化實驗表明，干巴菌菌絲體多糖及其組分具有優(yōu)良的抗氧化活性，清除羥基自由基能力的強弱順序為MPS-2 >MPS > MPS-3 > MPS-4 > MPS-1，清除DPPH自由基能力的強弱順序為MPS-2 >MPS > MPS-3 > MPS-4 > MPS-1，清除ABTS自由基能力的強弱順序為MPS-2 > MPS-3 > MPS-4 > MPS > MPS-1，因此，MPS的三個組分中MPS-2的抗氧化能力最強，其次為MPS-3，MPS-4和MPS-1，為干巴菌胞外多糖構效關系的研究、多糖的改造、多糖的活性分析以及多糖抗衰老功能食品的開發(fā)奠定了理論基礎；

4）干巴菌菌絲體多糖MPS具有優(yōu)良的保濕能力，在某些條件下，MPS的保濕能力要強于透明質酸（HA）和甘油（Gl），可以用于護膚保健。

菌種保藏信息

保藏時間：2016年 9月 23日，

保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，

保藏編號：CGMCC No. 12977，

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101分類命名：干巴菌 Thelephora ganbajun。

附圖說明

圖1 干巴菌菌絲體多糖MPS及其組分（MPS-1、MPS-2、MPS-3和MPS-4）清除羥基自由基的能力，

圖2 干巴菌菌絲體多糖MPS及其組分（MPS-1、MPS-2、MPS-3和MPS-4）清除DPPH自由基的能力，

圖3 干巴菌菌絲體多糖MPS及其組分（MPS-1、MPS-2、MPS-3和MPS-4）清除ABTS自由基的能力，

圖4干巴菌菌絲體多糖MPS保濕率隨時間的變化曲線（RH60%），

圖5干巴菌菌絲體多糖MPS保濕率隨時間的變化曲線（RH43%），

圖6干巴菌菌絲體多糖MPS保濕率隨時間的變化曲線（RH0%）。

具體實施方式

下面通過具體的實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但這些例舉性實施方式的用途和目的僅用來例舉本發(fā)明，并非對本發(fā)明的實際保護范圍構成任何形式的任何限定，更非將本發(fā)明的保護范圍局限于此。

實施例1菌株的獲得

分別于云南省不同地區(qū)采集4個新鮮干巴菌子實體，用75%酒精進行表面消毒，再用無菌水沖洗數(shù)次后，用滅菌鑷子撕取干巴菌內部組織小塊接種到含氯霉素的馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基平板上，移入24 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出菌絲后，反復純化，直至獲得干巴菌純培養(yǎng)物。于4個干巴菌子實體中分別篩選獲得4株干巴菌菌種，并分別命名為TG-1、TG-2、TG-3、TG-4。

實施例2干巴菌的液體發(fā)酵

進行發(fā)酵罐培養(yǎng)實驗，① 菌種的活化。將干巴菌菌株TG-1、TG-2、TG-3、TG-4分別接種于活化培養(yǎng)基平板（馬鈴薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，硫酸鎂 1 g/L，磷酸二氫鉀 1.5 g/L）上，24 ℃培養(yǎng)7 d。取0.5 cm²干巴菌活化菌種接入液體培養(yǎng)基中（馬鈴薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，蛋白胨2 g/L，硫酸鎂 1 g/L，磷酸二氫鉀 1.5 g/L，pH自然），500 mL三角瓶裝液量為300 mL，然后于搖床24 ℃振蕩培養(yǎng)10 d。② 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件。裝量：7.5升；接種量：10 %；發(fā)酵溫度：24 ℃；攪拌速度：350 r/min；泡沫控制：接種后加兩滴消泡劑。③ 發(fā)酵過程中pH值及DO值的測定。利用pH電極及溶氧電極自動在線測定并記錄數(shù)據(jù)。④ 菌絲體的分離。將干巴菌培養(yǎng)物離心（10000 r/min，10 min），獲得淡黃色的菌絲體，反復離心洗滌菌絲體3遍后，將菌絲體置于烘箱中，55 ℃烘干。

實驗結果表明，在干巴菌的發(fā)酵過程中，中期由于菌體的代謝產(chǎn)物增多，pH相對減少較快，而后期相對平穩(wěn)。從30 h開始，由于菌體的大量繁殖以及胞外多糖的大量產(chǎn)生，培養(yǎng)物逐漸變得粘稠，溶氧率降低較快，而后期，發(fā)酵體系粘稠度變化不大，溶氧相對穩(wěn)定。干巴菌TG-1、TG-2、TG-3、TG-4的菌絲體生物量及MPS產(chǎn)量見表1。

表1 干巴菌TG-1、TG-2、TG-3、TG-4的菌絲體生物量及MPS產(chǎn)量

由表1可見，干巴菌菌株TG-1的菌絲體生物量及MPS產(chǎn)量顯著高于菌株TG-2、TG-3、TG-4。因此，干巴菌TG-1是生產(chǎn)干巴菌MPS的理想菌株。

實施例3干巴菌菌絲體多糖的提取

1）干巴菌菌絲體的分離：

將干巴菌培養(yǎng)物離心（10000 r/min，10 min），收集菌絲體，并洗滌菌絲體3次。將菌絲體于55 ℃條件下烘干、粉碎，獲得干巴菌菌絲體粉末。

2）干巴菌菌絲體多糖的提取：

取干巴菌菌絲體粉末，將菌絲體粉末與去離子水以1﹕20比例混合，調節(jié)pH值為8，超聲波粉碎，超聲功率為600 w，超聲時間為10 min，然后置于90 ℃水浴中，提取2 h，離心取上清液。離心后的菌絲體殘渣按上述步驟再提取2次，合并上清液。

3）干巴菌菌絲體多糖的純化：

將多糖提取液濃縮至原體積1/2。加入2倍體積乙醇，靜置至沉淀完全析出，15000 r/min離心10 min，棄上清液并于55 ℃條件下烘干，粉碎，將其溶于去離子水中，除蛋白至少6次，凍干后即為MPS。將MPS溶于去離子水中，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，得到上樣溶液。將上樣溶液用規(guī)格為1.6 × 30 cm的DEAE-52纖維素陰離子交換柱進行層析分離，依次用去離子水和0.05、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液進行洗脫，分別得到干巴菌多糖組分MPS-1，MPS-2，MPS-3，MPS-4，洗脫液的流速為1 mL/min。用全自動部分收集器收集洗脫液（2 mL/管），用苯酚-硫酸法逐管檢測，將各洗脫組分透析除鹽，凍干后即為干巴菌多糖組分MPS-1，MPS-2，MPS-3，MPS-4。

實施例4體外抗氧化實驗

（1）羥基自由基清除能力的測定

采用Fenton法進行羥基自由基清除能力的測定。配置一系列不同濃度的干巴菌菌絲體多糖水溶液。將1 mL硫酸亞鐵溶液（9 mmol/L），1 mL水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L），1 mL多糖樣品溶液和1 mL過氧化氫溶液（8.8 mmol/L）于試管中混合均勻，37 ℃水浴30 min。離心（5000 r/min，10 min）后取上清液于510 nm處測定吸光度，并用維生素C（Vitamin C）作為陽性對照。按照以下公式計算羥基自由基清除率（Scavenging rate, SR），SR (%) = (A₀–A)/A₀×100。其中，A₀為空白對照的吸光度，A為多糖樣品的吸光度。羥基自由基的清除能力以EC₅₀值表示，EC₅₀值代表羥基自由基清除50%時所需要的樣品濃度。EC₅₀值越小則代表羥基自由基的清除能力越強。

（2）DPPH自由基清除能力的測定

將干巴菌菌絲體多糖進行梯度稀釋，配置一系列不同濃度的多糖水溶液。取2 mL多糖樣品溶液于試管中，加入2 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/L），混合均勻后避光反應30 min，然后在517 nm處測定其吸光度，用維生素C作為為陽性對照。根據(jù)吸光度計算DPPH自由基的清除能力，清除能力（SR）的計算公式為：SR (%) = [1–(A–A₀)/A₁]×100。其中，A為2 mL多糖樣品溶液與2 mL DPPH乙醇溶液混合液的吸光度，A₀為2 mL乙醇與2 mL多糖樣品溶液混合液的吸光度，A₁為2 mL去離子水與2 mL DPPH乙醇溶液混合液的吸光度。DPPH自由基的清除能力以EC₅₀值表示，EC₅₀值代表清除50% DPPH自由基的樣品濃度。DPPH自由基的清除能力用BHT作為為陽性對照。

（3）ABTS自由基的清除能力

將多糖分別用去離子水進行梯度稀釋，配置一系列不同濃度的多糖水溶液。將7 mmol/L ABTS溶液和4.9 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，避光靜置20 h，用磷酸鹽緩沖液稀釋，使其在734 nm處的吸光度為0.7，即為ABTS工作液。取0.8 mL ABTS工作液和0.2 mL樣品溶液于試管中，搖勻，避光30 min，于734 nm處測定吸光度。SR (%) = [1–(A_樣品–A_對照)/A_空白]×100。空白管用去離子水替代樣品，對照管用磷酸鹽緩沖液替代ABTS工作液。

由圖1可見，MPS及其組分MPS-1，MPS-2，MPS-3，MPS-4都具備羥基自由基的清除能力，并且隨著濃度的增加表現(xiàn)出明顯的量效關系。MPS及其組分MPS-1，MPS-2，MPS-3，MPS-4清除羥基自由基的EC50值分別為698.09 mg/L，1552.05 mg/L，391.85 mg/L，755.43 mg/L和1019.06 mg/L。因此，清除羥基自由基能力的強弱順序為MPS-2 >MPS > MPS-3 > MPS-4 > MPS-1。

由圖2可見，MPS及其組分MPS-1，MPS-2，MPS-3，MPS-4都具備DPPH自由基的清除能力，并且，隨著濃度的增加都表現(xiàn)出了明顯的量效關系。MPS及其組分MPS-1，MPS-2，MPS-3，MPS-4清除DPPH自由基的EC50值分別為596.42 mg/L，1769.55 mg/L，475.31 mg/L，768.12 mg/L和869.75 mg/L。因此，清除DPPH自由基能力的強弱順序為MPS-2 >MPS > MPS-3 > MPS-4 > MPS-1。

由圖3可見，MPS及其組分MPS-1，MPS-2，MPS-3，MPS-4都具備ABTS自由基的清除能力，并且，隨著濃度的增加都表現(xiàn)出了明顯的量效關系。MPS及其組分MPS-1，MPS-2，MPS-3，MPS-4清除ABTS自由基的EC50值分別為229.07 mg/L，315.67 mg/L，166.27 mg/L，177.46 mg/L和190.04 mg/L。因此，清除ABTS自由基能力的強弱順序為MPS-2 > MPS-3 > MPS-4 > MPS > MPS-1。抗氧化實驗結果表明，MPS的三個組分中MPS-2的抗氧化能力最強，其次為MPS-3，MPS-4和MPS-1。

實施例5保濕實驗

準確稱取干巴菌菌絲體多糖（MPS）、高分子量透明質酸（HA-H）、低分子量透明質酸（HA-L）和甘油（Gl）樣品0.2000 g于稱量瓶（25×25）中，并配制成質量分數(shù)為10%的溶液，分別置于裝有飽和醋酸鉀（RH 60%）、飽和碳酸鈉（RH 43%）和變色硅膠（RH 0%）的干燥器中，用甘油、低分子量及高分子量的透明質酸鈉作為對照。將兩個干燥器置于25 ℃的恒溫箱中，分別在4，8，16，24，32，40，48，60，72，84，96，108，120 h后稱重，計算保濕率。保濕率計算公式：保濕率%=（m_n﹣m₀）/m_n×100%，式中：m_n為放置之前樣品質量，m₀為放置之后樣品質量。

由圖4可以看出，在相對濕度60%的條件下，在120 h時，4種物質的保濕順序為MPS>HA-L>HA-H>Gl，并且MPS、HA-H、HA-L和Gl的保濕率分別為64.44%，53.87%，56.96%和50.18%。因此，在該相對濕度條件下，干巴菌菌絲體多糖（MPS）的保濕能力要強于透明質酸（HA）和甘油（Gl）。

由圖5可以看出，在相對濕度43%的條件下，在120 h時，4種物質的保濕順序為MPS>HA-H> HA-L>Gl，并且MPS、HA-H、HA-L和Gl的保濕率分別為89.17%，88.12%，86.63%和84.19%。因此，在該相對濕度條件下，干巴菌菌絲體多糖（MPS）的保濕能力要優(yōu)于透明質酸（HA）和甘油（Gl）。

由圖6可以看出，在相對濕度0%的條件下，在120 h時，4種物質的保濕順序為HA-H>MPS>HA-L>Gl，并且MPS、HA-H、HA-L和Gl的保濕率分別為36.16%，38.34%，34.72%和18.71%。因此，在相對濕度0%的條件下，干巴菌菌絲體多糖（MPS）的保濕能力要強于低分子量透明質酸（HA-L）和甘油（Gl），而略低于高分子量透明質酸（HA-H）。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。