本發明涉及生物醫學技術領域，具體地，涉及一種腺病毒疫苗Ad-LIGHT-HBsAg及其用于誘導HBsAg特異性免疫反應，治療慢性乙肝的用途。同時，本發明還涉及該疫苗聯合抗-HBsAg抗體以及抗-PDL1阻斷抗體治療慢性HBV感染的用途。

背景技術：

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)屬嗜肝病毒科，是一種不完整雙鏈DNA病毒。主要通過血液和體液感染人和少數靈長類動物。乙型病毒性肝炎是由HBV感染引起的以肝臟炎癥和壞死病變為主的傳染病，嚴重威脅著人類的健康，慢性HBV感染更是導致原發性肝癌(HCC)和肝硬化的重要因素。全球有約2.4億人是慢性乙肝感染者，而在我國就有約9300萬。由于HBV不能感染小鼠等模式動物，缺乏合適的小動物模型是研究慢性乙肝感染引起的免疫耐受和致病機制的主要障礙。而現有的慢性乙型肝炎的治療方案主要是通過干擾素和核苷類似物來抑制病毒復制從而改善臨床癥狀及預后，這種方案并不能有效的清除病毒，同時極易引起耐藥性。因此研發針對慢性乙型肝炎的治療性疫苗及免疫策略具有極為重要的意義。

慢性乙型肝炎誘導的免疫耐受機制至今仍沒有被完全研究清楚。多種類型的細胞和分子參與了HBV誘導的免疫耐受。而最重要的一點原因在于HBV感染的靶器官是肝臟。肝臟既被認為是一個免疫器官，同時也被認為趨向于誘導免疫耐受，這使得打破嗜肝病毒引起的免疫耐受變得尤為困難。首先，肝臟中的多種抗原遞呈細胞能夠通過不同的機制來誘導免疫耐受。肝臟中的抗原遞呈細胞主要有：髓系來源的DC(Myeloid DC)、漿樣樹突狀細胞(Plasmacytoid DC)、Kupffer細胞、肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)、肝實質細胞(Hepatocyte)和星形細胞(Stellate cell)。這些細胞可以通過分泌抑制性細胞因子如：IL10和TGFβ，或者表達共抑制分子如PD-L1和TIM-3來抑制T細胞免疫反應；也可以通過表達FasL和TRAIL來誘導抗原特異性T細胞凋亡；而MHC分子在肝臟細胞上的表達普遍較低，會導致TCR信號刺激不足而引起T細胞的耗竭和失能；同時，IL12產生的不足也會導致CD4細胞向Treg方向分化而不是Th1。而在慢性HBV感染過程中，其中的一些抑制已經被報道參與了HBV誘導的免疫耐受。

腺病毒(Adenovirus，Ad)是無囊膜的二十面體顆粒，是一種線狀雙鏈DNA病毒，其基因組長約36kb。人類腺病毒共有51個血清型，依其基因組和致癌性的不同可分為A-E的6個亞群。其基因組由5個早期(E1A、E1B、E2、E3和E4)、4個中期和1個晚期轉錄單位組成。近20年來，腺病毒作為一種優良的基因載體，已被廣泛用于基因治療和疫苗研究等各個領域。腺病毒能夠被如此廣泛的應用于基因工程等領域，是因為其具有以下一些優點：1、宿主范圍廣，對人致病性低，副作用小。2、腺病毒顆粒相對穩定，病毒基因組很少發生重排，外源基因片段在插入病毒基因組后，不會隨著病毒的復制而丟失。3、安全性好，腺病毒進入宿主細胞核后，會保持線狀，在染色體外獨立穩定存在，不會插入到宿主染色體中，不會引起宿主基因組的插入突變。4、可以同時表達多個基因。5、腺病毒攜帶的外源基因表達效率較高。6、腺病毒的宿主范圍廣泛，可感染分裂和非分裂細胞，轉導細胞種類多，如肺細胞、肝細胞、骨細胞、血管、肌肉、腦、中樞神經系統等。7、腺病毒可通過感染HEK293細胞大量擴增，通過CsCl密度梯度離心純化，制備方便。8、嗜肝性：通過靜脈感染5型腺病毒，90％以上的病毒特異性的進入了肝臟。這種嗜肝性并不是由薩科齊病毒受體(Coxsackie Adenovirus Receptor，CAR)介導的，而是先通過與凝血因子十結合，進而通過凝血因子十與肝實質細胞上的硫酸肝素蛋白聚糖的結合實現的。在靜脈感染過程中，腺病毒主要被肝臟中的kupffer細胞通過清道夫受體捕獲，而脾臟中的巨噬細胞和中性粒細胞吞噬的腺病毒數量很少。9、包裝容量大：經改建的復制缺陷型腺病毒載體的克隆容量可達10kb，腺病毒基因完全缺失載體的克隆容量可高達37kb。

LIGHT是T細胞上可誘導表達的與單純皰疹病毒的糖蛋白D競爭結合HVEM的淋巴毒素類似物(homologous to lymphotoxins,exhibits inducible expression,and competes with HSV glycoprotein D for HVEM,a receptor expressed by T lymphocytes，LIGHT)的簡稱，是1988年發現的TNF超家族的第14個成員。LIGHT可以通過LTβR招募和激活多種固有和獲得性免疫細胞(如DC、T細胞、NK細胞等)，上調趨化因子和粘附分子，并能激活NFκB，發揮誘導腫瘤細胞凋亡和刺激T細胞增殖的作用；還可作為一個共刺激分子，可通過CD28非依賴的信號傳導途徑刺激T細胞的生長和IFNγ的分泌。LIGHT的免疫活化功能主要是通過另一個受體HVEM直接活化T細胞和刺激NK細胞實現。

早在90年代初，Daniel等人就提出了過繼轉移治療HBV的概念。后來Lau等人通過系統的隨訪發現，將自限性乙肝感染者的骨髓移植給慢性乙肝患者，可以使患者發生表面抗原血清學轉換并伴隨著血清ALT的一過性升高。通過機制研究表明，治療效果可能源于供者提供的記憶性T細胞的作用，尤其是HBcAg特異性的CD4+T細胞。該輔助性T細胞可以通過分泌細胞因子或幫助B細胞產生抗體來實現病毒的清除。同時，值得注意的是接種過預防性疫苗但沒有感染過HBV的供體骨髓并不能清除慢性乙肝患者的HBV。這提示我們，HBV的清除有可能需要多種針對病毒抗原的CD4和CD8T細胞協同作用。

技術實現要素：

本發明目的在于提供一種腺病毒疫苗Ad-LIGHT-HBsAg及其用于治療慢性乙肝的用途。

在一方面，本發明提供了一種針對慢性HBV感染的治療性疫苗，該疫苗的免疫能夠有效的清除低劑量慢性HBV的感染。

在一方面，本發明提供了一種續貫免疫方法，通過以CpG為佐劑的乙肝表面抗原疫苗與本發明所述疫苗的續貫免疫，能夠有效的增強HBsAg特異性的免疫反應。

在一方面，本發明提供了一種針對慢性乙型肝炎的聯合治療方法，本發明所述疫苗與抗-HBsAg中和性抗體的聯合使用能夠有效的清除慢性HBV的感染。

在一方面，本發明提供了一種針對慢性乙型肝炎的聯合治療方法，本發明所述疫苗與抗-PDL1抗體的聯合使用能夠有效的清除慢性HBV的感染。

在一方面，基于本發明所述疫苗的脾臟細胞過繼轉移療法，在與射線照射聯合使用后能夠有效的清除慢性HBV的感染。

在一個實施方案中，本發明構建一種乙型肝炎治療性疫苗：利用5型腺病毒重組表達HBV表面抗原(S-HBsAg)和免疫共刺激分子LIGHT。

在一個實施方案中，本發明利用腺病毒疫苗Ad-LIGHT-HBsAg皮下免疫野生型C57BL6/J小鼠，能夠在小鼠的脾臟和肝臟誘導HBsAg特異性的CD4+和CD8+T細胞免疫反應。

在一個實施方案中，本發明利用Ad-LIGHT-HBsAg皮下免疫低劑量AAV/HBV1.3感染建立的慢性乙肝模型小鼠，能夠打破免疫耐受，誘導HBsAg特異性的T細胞及B細胞免疫反應，清除HBV的感染。

在一個實施方案中，本發明利用腹腔注射HBsAg的中和性抗體4周(2mg/周/鼠)再免疫Ad-LIGHT-HBsAg的方法，能夠在高劑量AAV/HBV感染建立的慢性HBV感染小鼠中打破免疫耐受，誘導T細胞及B細胞免疫反應，清除HBV的感染。

在一個實施方案中，本發明將重組乙肝表面抗原(2-10ug)與B型CpG(含有非甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸為核心序列的核苷酸序列)，CpG-1826(50ug)在PBS緩沖液中進行混合后皮下免疫野生型小鼠，在免疫后的第14-28天后腹腔免疫Ad-LIGHT-HBsAg。在二次免疫后的第8天，能夠在外周血中檢測到大量HBsAg特異性的CD8+T細胞。在二次免疫后的第14天，能夠在脾臟和肝臟中檢測到大量的HBsAg特異性CD4及CD8免疫反應，與此同時也能夠在血清中檢測到大量的抗-HBsAg抗體。

在一個實施方案中，HBsAg/CpG與Ad-LIGHT-HBsAg的續貫免疫能夠誘導大量抗原特異性T及B細胞免疫反應的功能依賴于LIGHT-LTβR信號通路及在肝臟原位的免疫活化。

在一個實施方案中，Ad-LIHGT-HBsAg活化14天后的脾臟細胞過繼轉移到AAV/HBV感染的Rag小鼠中能夠清除HBV的感染。

在一個實施方案中，Ad-LIHGT-HBsAg活化14天后的脾臟細胞過繼轉移到5Gy照射的AAV/HBV攜帶者小鼠中能夠清除HBV的感染。

在一個實施方案中，Ad-LIHGT-HBsAg活化14天后的脾臟細胞過繼轉移到HBV1.3轉基因小鼠中能夠清除HBV抗原的表達。

在一個實施方案中，Ad-LIHGT-HBsAg與3次抗-PDL1的抗體(100ug/鼠/次)聯合使用能夠在高劑量AAV/HBV感染的小鼠中誘導抗原特異性T細胞免疫反應并清除HBV的持續性感染。

具體地，本發明涉及以下方面：

1.核酸構建體，所述核酸構建體通過將乙肝表面抗原s-HBsAg和免疫共刺激分子LIGHT的編碼核酸序列構建到5型腺病毒載體中獲得。

2.根據1所述的核酸構建體，其中所述乙肝表面抗原s-HBsAg的編碼核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根據1所述的核酸構建體，其中所述免疫共刺激分子LIGHT的編碼核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根據1所述的核酸構建體，其中所述核酸構建體的核酸序列如SEQID NO:3所示。

5.用于慢性乙型肝炎病毒感染的治療性DNA疫苗，所述DNA疫苗包含根據1-4中任一項所述的核酸構建體。

6.根據1-4中任一項所述的核酸構建體用于制備用于慢性乙型肝炎病毒感染的治療性DNA疫苗的用途。

7.用于治療慢性乙型肝炎病毒感染的試劑盒，所述試劑盒包含根據1-4中任一項所述的核酸構建體或根據5所述的DNA疫苗、重組乙肝表面抗原s-HBsAg蛋白和佐劑。

8.根據7所述的試劑盒，其中所述佐劑是CpG。

9.用于治療慢性乙型肝炎病毒感染的試劑盒，所述試劑盒包含根據1-4中任一項所述的核酸構建體或根據5所述的DNA疫苗以及抗-HBsAg抗體。

10.用于治療慢性乙型肝炎病毒感染的試劑盒，所述試劑盒包含根據1-4中任一項所述的核酸構建體或根據5所述的DNA疫苗以及抗-PDL1抗體。

附圖說明

圖1：根據本發明的Ad-LIHGT-HBsAg在野生型小鼠中誘導的T細胞免疫反應。包括在外周血中誘導的抗原特異性CD8+T細胞數量以及在脾臟和肝臟中誘導的分泌IFNγ的抗原特異性細胞數量。

圖2：本發明所述的Ad-LIHGT-HBsAg在HBV慢性感染小鼠中誘導的免疫反應及治療效果。包括血清中HBsAg和HBeAg的變化情況，肝臟中HBVgDNA的檢測，以及肝臟中HBsAg特異性CTL的數量。

圖3：根據本發明所述的Ad-LIHGT-HBsAg與HBsAg中和性抗體聯合治療在高劑量HBV攜帶者小鼠中誘導的免疫反應及治療效果。包括治療過程中血清中HBsAg和HBeAg的變化情況，外周血中HBsAg特異性T細胞的數量以及治療后肝臟中HBcAg的表達情況。

圖4：HBsAg/CpG與本發明所述的Ad-LIHGT-HBsAg續貫免疫誘導的免疫反應特點。包括HBsAg/CpG與Ad-LIGHT-HBsAg續貫免疫在脾臟和肝臟以及外周血中誘導的HBsAg特異性T細胞比例和抗體應答強度。

圖5：HBsAg/CpG與本發明所述的Ad-LIHGT-HBsAg續貫免疫誘導的免疫反應依賴于LIGHT-LTβR信號通路。包括HBsAg/CpG與Ad-LIGHT-HBsAg續貫免疫在野生型小鼠、LTβR敲除小鼠、HVEM敲除小鼠的外周血、肝臟、脾臟中誘導的HBsAg特異性T細胞數量以及抗體應答強度；以及用LTβR-Ig阻斷后HBsAg/CpG與Ad-LIGHT-HBsAg續貫免疫在野生型小鼠中誘導的免疫反應。

圖6：利用本發明所述的Ad-LIHGT-HBsAg活化的脾臟細胞過繼轉移到Rag-/-HBV慢性感染小鼠后的治療效果。包括血清中HBsAg和HBeAg的變化以及外周血、脾臟和肝臟中HBsAg特異性T細胞的數量。

圖7：利用本發明所述的Ad-LIHGT-HBsAg活化的脾臟細胞過繼轉移到5Gy射線照射的免疫健全HBV慢性感染小鼠后的治療效果。包括血清中HBsAg和HBeAg的變化以及外周血、脾臟和肝臟中HBsAg特異性T細胞的數量和肝臟中HBVgDNA的變化。

圖8：利用本發明所述的Ad-LIHGT-HBsAg活化的脾臟細胞過繼轉移到5Gy射線照射的HBV1.3轉基因小鼠后的治療效果。

圖9：根據本發明所述的Ad-LIGHT-HBsAg與抗-PDL1聯合治療在中劑量HBV慢性感染小鼠中誘導的免疫反應及治療效果。包括血清中HBsAg和HBeAg的變化情況，以及脾臟和肝臟中HBsAg特異性T細胞的數量。

具體實施方式

下面的實施例僅用于進一步闡釋本發明的內容，而不意欲在任何方面限制本發明。本領域技術人員將領會，可對下述具體實施方式進行修飾而仍不偏離所附的權利要求所要求保護的本發明的范圍、精神和主旨。

在下面的所有實施例中，如無特別聲明，均采用本領域技術人員慣常所用的方法、儀器、試劑和實驗方案等。

實施例

實施例1：Ad-mLIGHT-HBsAg的制備

首先，利用分子克隆方法將s-HBsAg(ayw亞型)(核酸序列見SEQ ID NO:1)和LIGHT分子(核酸序列見SEQ ID NO:2)的核酸序列構建于pShuttle載體(該載體的詳細信息可參見He,T.C.,et al.A simplified system for generating recombinant adenoviruses.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95,2509-2514(1998))，通過質粒共轉染的方式產生病毒(DNA病毒的全長序列見SEQ ID NO:3)。具體操作步驟嚴格按照Stratagene公司的AdEasy^TM XL Adenoviral Vector System進行，現簡要描述如下：

一目的基因的克隆

1.選擇適當的酶切位點(EcoRV和NotI)，進行酶切連接，將mLIGHT-HBsAg片段插入pshuttle-CMV質粒多克隆位點。

2.重組質粒鑒定：酶切鑒定或測序。

3.重組質粒擴增，純化并準備適量含目的基因的穿梭質粒。

4.用PmeI單酶切線性化重組穿梭質粒，電泳鑒定質粒完全被切開。

5.膠回收線性化質粒，以備共轉化使用。

二共轉化

1大腸桿菌BJ5183電轉感受態制備

①從新鮮瓊脂板上挑取單個BJ5183細菌，接種于LB培養基中，37℃振搖過夜。

②接種25ml過夜培養物于500ml LB培養基，37℃振搖，至OD600達到0.4。

③迅速將培養物置于冰浴中30min，至充分冷卻。

④將菌液轉移至預冷的離心管中，4℃下以2500r/min離心15min，棄培養液，回收細胞。

⑤以10ml預冷的10％甘油洗滌沉淀，低溫離心，共兩次。

⑥加約1ml(適量)預冷的10％甘油重懸沉淀，稀釋懸液100倍，測量OD600，至稀釋濃度為2-3×10¹⁰個細胞/ml(1.0OD600約2.5×10¹⁰個細胞/ml)。分裝，-80℃或液氮保存待用。

2病毒骨架質粒轉化大腸桿菌，擴增，純化。

3將1-5μl(約1μg)線性化的穿梭質粒及1μl(約100ng/μl)病毒骨架質粒pAdEasy-1(購自Stratagene公司)加入至含約40μl BJ5183電轉感受態的EP管中混勻,冰上冷卻。

4將混合物加入電轉杯，電擊(1250-1500V/mm,5ms)。

5電擊結束取出樣品，加入1ml SOC或LB培養液，37℃低速振蕩40min。

6取適當體積的電擊轉化細胞液涂于數個卡那霉素抗性平板(25-50mg/ml)，37℃培養16-20hr。

7次日挑取平板上長出的菌落(選擇最小的菌落)，接種于3ml含25-50mg/ml的LB培養基，37℃培養10-15hr。

8堿裂法提取質粒，0.8％瓊脂糖凝膠電泳篩選，大質粒為可能陽性克隆，進一步酶切鑒定。以PacI單酶切，0.8％瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段(約30kb)，及一條小片段(約3.0或4.5kb)(同時可進行其它酶切鑒定)，則基本確定為陽性克隆。

9取1-5μl陽性質粒轉化至DH5α大腸桿菌細胞(BJ5183為recA+,質粒DNA易發生突變，DH5α或JM109，XL1-blue菌株為重組缺陷性菌株，可穩定擴增已鑒定的重組質粒)，擴增細菌并純化質粒。

三重組病毒質粒轉導293細胞

1 293細胞培養：轉導24小時前，以方瓶為例，接種2×10⁶ 293細胞于25cm²方瓶，使生長密度約50-70％。(也可以使用6孔或96孔板)

2以PacI單酶切重組病毒質粒(轉導25cm²方瓶約需4μgDNA)，完全線性化后，乙醇沉淀，再以20μl ddH2O溶解。

3脂質體包裹質粒(以Lipofectamine為例):每4μg PacI約需20μlLipofectamine包裹.質粒及脂質體分別稀釋于500μl無血清培養基再混合，置于室溫下15-30min。

4以無血清培養基輕輕洗滌培養瓶，另加2.5ml無血清培養基，37℃放置10min。

5將Lipofectamine-DNA混合物加入培養瓶，37℃孵箱放置4hr。

6 4hr后，棄Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培養基(含10％FCS)。如有大量細胞漂浮，可不棄Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培養基，37℃孵育過夜，再換液。

7培養過程中觀察細胞生長情況。約2周后可觀察到細胞病變(CPE)出現。

四重組病毒鑒定

1轉導10-14d后，收集細胞沉淀，加入2ml滅菌的PBS混懸，凍融細胞，離心后收集上清保存于-80℃。

2取30-50％步驟1中上清，感染50-70％飽和度的25cm²方瓶中293細胞。2-3d后出現明顯細胞病變。

3感染后3-5d，當1/3-1/2細胞漂浮時收集病毒。按步驟1收集細胞并準備病毒上清。通過Western blot和/或PCR鑒定重組腺病毒產生。

4PCR鑒定重組病毒。取5μl病毒上清加入10μl蛋白酶K，55℃孵育1hr，再煮沸5min，離心后取1-2μl作PCR。

用構建成功的重組病毒感染293cymr細胞實現病毒的擴增。通過MOI＝10的感染劑量，經過48小時的擴增，收取細胞進行裂解并收取上清，經過氯化銫的密度梯度離心，收取成熟的病毒帶進行脫鹽，脫鹽緩沖液為A195(成分為：10mM Tris-HCL PH7.4、75mM NaCL、5％(w/v)蔗糖、0.02％(w/v)Polysorbate 80(Sigma)、1mM MgCL、100mM EDTA、0.5％EtOH、10mM His(L-histidine)(Sigma)、2％甘油，經0.22微米濾膜過濾后常溫保存)。

Ad-mLIGHT-HBsAg的擴增方法：

(1)使用DMEM完全培養基將293cymr接種于直徑為10厘米的細胞培養皿中，在37℃，5％二氧化碳培養箱中培養。

(2)當細胞密度為70-80％時，加入MOI＝10的病毒(以上方法制備的Ad-mLIGHT-HBsAg)感染細胞，培養36-48小時并隨時觀察是否出現細胞質病變效應(CPE)。

(3)當大部分細胞出現CPE效應時，用刮刀將細胞刮下，連同培養基一起轉入50ml離心管，2500rpm離心10分鐘后用1x10⁷/ml培養基重懸細胞凍于-80℃。

Ad-mLIGHT-HBsAg的純化方法：

純化腺病毒使用氯化銫密度梯度離心法，步驟如下：

(1)使用液氮和37℃反復凍融細胞懸液3次并充分震蕩1分鐘，4000rpm離心20分鐘，收集上清。

(2)在4℃預冷SW28/Beckman轉頭。

(3)用10ml注射器吸取6ml 1.2g/ml的CsCl,緩慢加入到超離管中，同樣吸取8ml 1.4g/ml的CsCl，用注射器針頭插到超離管的底部，不擾動上層液面，輕輕推入溶液。

(4)將20ml細胞裂解上清沿側壁緩緩加到液面上(從小于10⁹被感染細胞中獲得)。

(5)用1xTE補平至距離管口5mm，再加入液體石蠟至距管口2mm并配平。

(6)SW28轉頭23000rpm 4℃離心90分鐘，加速度為慢，減速為0。

(7)小心取出超離管，用10ml注射器從液面上吸走大部分不含病毒層的溶液?？梢钥吹揭好嬷邢虏浚幸粭l白色條帶，即含腺病毒的溶液層。用2ml配備18G針頭的注射器刺破超離管腺病毒液面處，細心的吸出該液體層置于15ml離心管中。

(8)用A195緩沖液平衡GE脫鹽柱(NP-25)5次，每次5ml。

(9)將病毒粗純液加入脫鹽柱。

(10)加入A195緩沖液洗脫，并分裝貯存于-80℃。

Ad-mLIGHT-HBsAg滴度的測定方法：

針對腺病毒的Hexon進行細胞免疫組化分析可以計算病毒滴度，方法如下：

(1)在12孔板中，每孔接種5×10⁵個293cymr細胞，加入100ul已稀釋好的病毒(從10^-6到10^-8)放入培養箱中培養48小時。

(2)吸去培養基，室溫干燥5分鐘。

(3)沿管壁輕柔地加入預冷的甲醇，0.5ml/孔。將板至于-20℃，孵育10分鐘。

(4)輕輕吸去甲醇，輕柔地用PBS洗滌，每次每孔0.5ml，洗3次。

(5)用PBS稀釋一抗，稀釋倍數為1:1000。

(6)輕輕吸去孔中洗滌液，每孔加入稀釋好的一抗200ul，37℃孵育1小時。

(7)輕輕地吸去一抗，用PBS洗三次，每次5分鐘。

(8)每孔加入即用型二抗(抗小鼠IgG-HRP)(購自中杉金橋)，37℃孵育1小時。

(9)輕輕吸去二抗，用PBS洗三次，每次5分鐘。

(10)每孔加入已稀釋好的DAB顯色液，室溫放置5分鐘。

(11)吸去DAB溶液，每孔加入PBS溶液。在顯微鏡下觀察。

(12)計算每孔感染單位(ifu/ml)＝(平均陽性細胞數/視野)×(視野數/孔)/(病毒體積×稀釋倍數)

實施例2：Ad-mLIGHT-HBsAg在野生型小鼠中的免疫反應

C57BL6/J小鼠(雄性，6-8周，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)接受了1*10e9pfu的Ad-LIGHT-HBsAg以及對照疫苗的皮下免疫(用PBS將滴度調整為1*10e10pfu/ml,注射體積為100ul)。在免疫后的第8天，通過流式細胞儀檢測了外周血中H2-KbENV190陽性的CD8+T 細胞比例(圖1A-B)，在免疫后的第14天，肝臟中的淋巴細胞被分離出來并用ENV190和OT1刺激48小時，通過Elispot的方法檢測了分泌IFNγ的抗原特異性CD8+T細胞數量(圖1D-E)。通過與其他疫苗免疫的比較可以看出，Ad-LIGHT-HBsAg在淋巴結、脾臟和肝臟均有效的誘導了HBsAg特異性免疫反應(圖1C)。

實施例3：Ad-mLIGHT-HBsAg在HBV慢性感染小鼠中的免疫反應及治療效果

AAV/HBV1.3感染C57BL6/J小鼠建立慢性HBV感染模型的方法：

將AAV/HBV1.3病毒(購買自北京五加和分子醫學研究所有限公司)按一定比例稀釋于0.9％NaCl的生理鹽水中，每次尾靜脈注射的總體積為200ul。成年鼠(6-8周齡,雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)使用尾靜脈注射的方法進行感染。在感染四周后按照實施例2所述的方法對HBV慢性感染小鼠進行了Ad-mLIGHT-HBsAg的免疫以及對照疫苗的免疫(Engerix-B，葛蘭素史克公司，2ug/鼠，皮下免疫，體積為100ul)。通過Elisa的方法檢測了血清中HBeAg的變化(圖2A-B)。在免疫后的第32天，通過Elispot的方法檢測了小鼠肝臟中抗原特異性T細胞分泌IFNγ的水平(圖2C)，并檢測了肝臟中HBV DNA的拷貝數(圖2D)。

實施例4：HBsAg中和性抗體與Ad-mLIGHT-HBsAg在HBV慢性感染小鼠中的聯合治療效果

首先，按照實施例3所述方法建立HBV慢性感染的小鼠模型。在感染四周后，開始為模型小鼠注射HBsAg的中和性抗體(H25B10，小鼠雜交瘤細胞產生，小鼠IgG1,2mg/鼠，注射體積為500-1000ul，每周2次，共4周)，之后按照實施例2所述的方法免疫Ad-mLIGHT-HBsAg。在免疫后的第8天用2的方法檢測了外周血中HBsAg特異性的T細胞數量(圖3B)，并通過Elisa的方法檢測了血清中HBsAg和HBeAg的變化(圖3A)，在治療后的第49天，通過免疫組化的方法檢測了肝臟中HBcAg的表達情況。

實施例5：HBsAg/CpG與Ad-mLIGHT-HBsAg的續貫免疫能夠增強HBsAg特異性免疫反應

HBsAg/CpG的制備及免疫：

用PBS將CpG粉末(CpG1826，由生工生物公司合成，序列為TCCATGACGTTCCTGACGTT)溶解至500ug/ml的濃度，取100ul與5ug重組HBsAg進行充分混合后進行皮下免疫(免疫方法及所用動物與實施例2所述一致)。在免疫后第21天，按照實施例2所述方法進行Ad-mLIGHT-HBsAg的免疫。在二次免疫后的第7天，用流式的方法檢測了外周血中HBsAg特異性T細胞的比例(圖4A)。在二次免疫后的第21天，用流式的方法檢測了脾臟和肝臟中HBsAg特異性T細胞的比例(圖4B)，用Elisa的方法檢測了血清中anti-HBsAg的滴度(圖4C)。

實施例6：HBsAg/CpG與Ad-mLIHGT-HBsAg續貫免疫誘導的免疫反應依賴于LIGHT-LTβR信號通路

首先，對野生型C57BL6/J小鼠(6-8周齡,雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，LTβR敲除小鼠以及HVEM敲除小鼠(以上2種敲除小鼠由本實驗室保種)按照實施例5所述的方法進行續貫免疫。在二次免疫后的第7天檢測了外周血中HBsAg特異性T細胞的比例(圖5A,B)，在二次免疫后的第21天檢測了脾臟和肝臟中HBsAg特異性T細胞的比例(圖5A,B)以及分泌IFNγ的T細胞數量(圖5D,E)。同時檢測了二次免疫后第14和21天血清中抗-HBsAg的水平(圖5C)。其次，在對野生型C57BL6/J小鼠(6-8周齡,雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)按照實施例5所述的方法進行續貫免疫的同時用anti-LTβR抗體(免疫的第0,7,14天腹腔免疫三次，每次100ug/鼠)來阻斷LIGHT-LTβR信號通路，在二次免疫后的第7天檢測了外周血中HBsAg特異性的T細胞比例(圖5F,G)以及血清中抗-HBsAg的水平(圖5H)。

實施例7：HBsAg/CpG與Ad-mLIGHT-HBsAg的續貫免疫活化的脾臟細胞在Rag-/-HBV慢性感染小鼠中的治療作用

首先，對野生型C57BL6/J小鼠(雄性，6-8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)按照實施例5所述的方法進行續貫免疫。在Ad-mLIGHT-HBsAg免疫后的第14天處死小鼠，分離脾臟細胞過繼轉移給AAV/HBV1.3感染的Rag-/-小鼠(5*10e7脾臟細胞通過尾靜脈注射的方式進行過繼轉移，體積為200-300ul)。過繼轉移后通過Elisa的方法檢測了血清中HBsAg和HBeAg的變化情況(圖6A)。在過繼轉移后的第7天檢測了外周血中HBsAg特異性的CD8+T細胞比例(圖6B)。在過繼轉移后第28天檢測了脾臟和肝臟中分泌IFNγ的CD8+T細胞數量(圖6C)。

實施例8：HBsAg/CpG與Ad-mLIGHT-HBsAg的續貫免疫活化的脾臟細胞在經射線照射的HBV慢性感染小鼠中的治療作用

首先，對野生型C57BL6/J小鼠(雄性，6-8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)按照實施例5所述的方法進行續貫免疫。在Ad-mLIGHT-HBsAg免疫后的第14天處死小鼠，分離脾臟細胞。與此同時，對AAV/HBV1.3感染的小鼠(按照實施例3所述操作進行)進行射線照射(小鼠在北京大學化學院沽源室進行5Gy劑量的全身射線照射)。并將分離到的脾臟細胞按實施例6所述方法進行過繼轉移。在過繼轉移后的不同時間點通過Elisa的方法檢測了血清中HBsAg、HBeAg、anti-HBsAg的變化情況(圖7A)。在過繼轉移后的第7天通過流式的方法檢測了外周血中HBsAg特異性的T細胞比例(圖7B)。在過繼轉移后的第28天，通過Elispot的方法檢測了脾臟和肝臟中分泌IFNγ的細胞數量(圖7C)并通過real-timePCR的方法檢測了肝臟中HBVDNA的拷貝數(圖7D)以及HBcAg的表達情況(圖7E)。

實施例9：HBsAg/CpG與Ad-mLIGHT-HBsAg的續貫免疫活化的脾臟細胞在經射線照射的HBV1.3轉基因小鼠中的治療作用

首先，對野生型C57BL6/J小鼠(雄性，6-8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)按照實施例5所述的方法進行續貫免疫。在Ad-mLIGHT-HBsAg免疫后的第14天處死小鼠，分離脾臟細胞。與此同時，對HBV1.3轉基因小鼠(由解放軍458醫院劉光澤教授惠贈)進行射線照射(小鼠在北京大學化學院沽源室進行5Gy劑量的全身射線照射)。并將分離到的脾臟細胞按實施例6所述方法進行過繼轉移。在過繼轉移后的不同時間點通過Elisa的方法檢測了血清中HBsAg、anti-HBsAg的變化情況(圖8)。

實施例10：HBsAg/CpG與Ad-mLIGHT-HBsAg的續貫免疫聯合PDL1的阻斷在HBV慢性感染小鼠中的治療作用

首先，按照實施例3所述方法建立HBV慢性感染的小鼠模型。在感染四周后，開始對HBV慢性感染小鼠注射PDL1阻斷抗體(抗-PDL1，clone:10F.9G2,100ug/鼠/次，每5天一次，直到Ad-LIGHT-HBsAg免疫后的第7天為止)，與此同時按照實施例5所述的方法對同批小鼠進行續貫免疫。通過Elisa的方法檢測血清中HBsAg和HBeAg的變化情況(圖9A-B)，在二次免疫后的第28天，通過Elispot的方法檢測脾臟和肝臟中分泌IFNγ的HBsAg特異性CD8+T細胞的數量(圖9C-D)。

序列表

<110> 中國科學院生物物理研究所

<120> 腺病毒疫苗Ad-LIGHT-HBsAg及其用于治療慢性乙肝的用途

<130> IB168024

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 682

<212> DNA

<213> 乙肝病毒

<400> 1

atcaaatgta tacccaaaga caaaagaaaa ttggtaacag cggtaaaaag ggactcaaga 60

tgctgtacag acttggcccc caataccaca tcatccatat aactgaaagc caaacagtgg 120

gggaaagccc tacgaaccac tgaacaaatg gcactagtaa actgagccag gagaaacggg 180

ctgaggccca ctcccatagg aattttccga aagcccagga tgatgggatg ggaatacagg 240

tgcaatttcc gtccgaaggt ttggtacagc aacaggaggg atacatagag gttccttgag 300

cagtagtcat gcaggtccgg catggtcccg tgctggttgt tgaggatcct ggaattagag 360

gacaaacggg caacatacct tgatagtcca gaagaaccaa caagaagatg aggcatagca 420

gcaggatgaa gaggaagatg ataaaacgcc gcagacacat ccagcgataa ccaggacaag 480

ttggaggaca agaggttggt gagtgattgg aggttgggga ctgcgaattt tggccaagac 540

acacggtagt tccccctaga aaattgagag aagtccacca cgagtctaga ctctgcggta 600

ttgtgaggat tcttgtcaac aagaaaaacc ccgcctgtaa cacgagaagg ggtcctagga 660

atcctgatgt gatatctatc at 682

<210> 2

<211> 725

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 2

gcggccgctc atcacaccat gaaggcgccg aagtagctcc tggtgccgtc cctgggcctc 60

accagcctgt tgccgggcac cctcaccacc acctcctcgc cggcctccag gtgcaccacg 120

ccgcccagga agctgctgtc ccaccacact cggctgctgt tggccctgcc acaggggctc 180

cgcctggaga ccagcagctc cagctccttg gggtatctgc tggtcctctt gtacaggccg 240

tgggtgatgg gcaggccgtt ggccaggccc tgagggcagc ccactccgga cagctgcacc 300

ttgctgtaca cgtagtagta gccgggctcc atggtcacca gggcgccgtc gtggtaggtc 360

aggcccctca ggaaagccag gcccagcctg gtctcccaca gcaggggtcc gccgatgccg 420

atcaggctgg cgttggcgcc tgtcaggtgg gcggcagggt tggcctggtg gctcctctgg 480

tcctgccagc tgcccttgcc gccatcgggc aggtgggcca cgatgtcgcc cagcctctgg 540

tgcagcctca gcagaaacca gccctgggtg gccaggccag cgcccagcag cagcaccagg 600

gccagggaca cctgcacggt gccacatctc ctccgcctgt ggttctgctc cagcctcctg 660

aaggggatgt cggtctggcc gtccaccacg aacacgctgg gctgcaccac gctctccatg 720

gtggc 725

<210> 3

<211> 10164

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60

agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120

tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180

ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240

tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300

ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatactgtc gagtctaggc 360

tcaagcagtg atccttatcg attttaccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 420

cctcccacat ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt 480

gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 540

agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 600

tgtctgctcg aagcggccct agaggtacca cgcgtgaatt ctcgaggcta gagcttgtcg 660

aaatattgat atcatcaaat gtatacccaa agacaaaaga aaattggtaa cagcggtaaa 720

aagggactca agatgctgta cagacttggc ccccaatacc acatcatcca tataactgaa 780

agccaaacag tgggggaaag ccctacgaac cactgaacaa atggcactag taaactgagc 840

caggagaaac gggctgaggc ccactcccat aggaattttc cgaaagccca ggatgatggg 900

atgggaatac aggtgcaatt tccgtccgaa ggtttggtac agcaacagga gggatacata 960

gaggttcctt gagcagtagt catgcaggtc cggcatggtc ccgtgctggt tgttgaggat 1020

cctggaatta gaggacaaac gggcaacata ccttgatagt ccagaagaac caacaagaag 1080

atgaggcata gcagcaggat gaagaggaag atgataaaac gccgcagaca catccagcga 1140

taaccaggac aagttggagg acaagaggtt ggtgagtgat tggaggttgg ggactgcgaa 1200

ttttggccaa gacacacggt agttccccct agaaaattga gagaagtcca ccacgagtct 1260

agactctgcg gtattgtgag gattcttgtc aacaagaaaa accccgcctg taacacgaga 1320

aggggtccta ggaatcctga tgtgatatct atcatcgtgt ttttcaaagg aaaaccacgt 1380

ccccgtggtt cggggggcct agacgttttt ttaacctcga ctaaacacat gtaaagcatg 1440

tgcaccgagg ccccagatca gatcccatac aatggggtac cttctgggca tccttcagcc 1500

ccttgttgaa tacgcttgag gagagccatt tgactctttc cacaactatc caactcacaa 1560

cgtggcactg gggttgtgcc gcctttgcag gtgtatctta tacacgtggc ttttggccgc 1620

agaggcacct gtcgccaggt ggggggttcc gctgcctgca aagggtcgct acagacgttg 1680

tttgtcttca agaagcttcc agaggaactg cttccttcac gacattcaac agaccttgca 1740

ttcctttggc gagaggggaa agacccctag gaatgctcgt caagaagaca gggccaggtt 1800

tccgggccct cacattgcca aaagacggca atatggtgga aaataacata tagacaaacg 1860

cacaccggcc ttattccaag cggcttcggc cagtaacgtt aggggggggg gagggagagg 1920

ggcggaattg gcagatcttt atcacttatt caggcgtagc accaggcgtt taagggcacc 1980

aataactgcc ttgcggccgc tcatcacacc atgaaggcgc cgaagtagct cctggtgccg 2040

tccctgggcc tcaccagcct gttgccgggc accctcacca ccacctcctc gccggcctcc 2100

aggtgcacca cgccgcccag gaagctgctg tcccaccaca ctcggctgct gttggccctg 2160

ccacaggggc tccgcctgga gaccagcagc tccagctcct tggggtatct gctggtcctc 2220

ttgtacaggc cgtgggtgat gggcaggccg ttggccaggc cctgagggca gcccactccg 2280

gacagctgca ccttgctgta cacgtagtag tagccgggct ccatggtcac cagggcgccg 2340

tcgtggtagg tcaggcccct caggaaagcc aggcccagcc tggtctccca cagcaggggt 2400

ccgccgatgc cgatcaggct ggcgttggcg cctgtcaggt gggcggcagg gttggcctgg 2460

tggctcctct ggtcctgcca gctgcccttg ccgccatcgg gcaggtgggc cacgatgtcg 2520

cccagcctct ggtgcagcct cagcagaaac cagccctggg tggccaggcc agcgcccagc 2580

agcagcacca gggccaggga cacctgcacg gtgccacatc tcctccgcct gtggttctgc 2640

tccagcctcc tgaaggggat gtcggtctgg ccgtccacca cgaacacgct gggctgcacc 2700

acgctctcca tggtggcgcg gccgcagatc ttcgactcga agatcaaact tggacctggg 2760

agtggacacc tgtggagaga aaggcaaagt ggatgtcatt gtcactcaag tgtatggcca 2820

gatcgggcca ggtgaatatc aaatcctcct cgtttttgga aactgacaat cttagcgcag 2880

aagtaatgcc cgcttttgag agggagtact caccccaaca gctggatctc aagcctgcca 2940

cacctcacct cgaccatccg ccgtctcaag accgcctact ttaattacat catcagcagc 3000

acctccgcca gaaacaaccc cgaccgccac ccgctgccgc ccgccacggt gctcagccta 3060

ccttgcgact gtgactggtt agacgccttt ctcgagaggt tttccgatcc ggtcgatgcg 3120

gactcgctca ggtccctcgg tggcggagta ccgttcggag gccgacgggt ttccgatcca 3180

agagtactgg aaagaccgcg aagagtttgt cctcaaccgc gagcccaaca gctggccctc 3240

gcagacagcg atgcggaaga gagtgaccgc ggaggctgga tcggtcccgg tgtcttctat 3300

ggaggtcaaa acagcgtgga tggcgtctcc aggcgatatg aggcgcgccc ggttcactaa 3360

acaccggtaa caaacagaca atctggtctg tttgattata ccggttgctt atataggcct 3420

cccaccgtac acgcctacct cgacccggca agcttgccca tttgcgtcaa cggggcgggg 3480

gtattacgac attttggaaa gtcccgttga ttttggtgcc aaaacaaact cccattgacg 3540

tcaatggggt ggagacttgg aaatccccgt gagtcaaacc gctatccacg cccattggtg 3600

tactgccaaa accgcatcac catggtaata gcgatgacta atacgtagat gtactgccaa 3660

gtaggaaagt cccgtaaggt catgtactgg gcataatgcc aggcgggcca tttaccgtca 3720

ttgacgtcaa tagggggcgg acttggcata tgatacactt gatgtactgc caagtgggca 3780

gtttaccgta tatactccat ccattgacgt caatggaaag tccctattgg cgttactatg 3840

ggaacatacg tcattattga cgtcaatggg cgggggtcgt tgggcggtca gccaggcggg 3900

ccatttaccg taagttatgt aacgaagctt ctcgaggtcg agatcgatct gggcgtggtt 3960

aagggtggga aagaatatat aaggtggggg tcttatgtag ttttgtatct gttttgcagc 4020

agccgccgcc gccatgagca ccaactcgtt tgatggaagc attgtgagct catatttgac 4080

aacgcgcatg cccccatggg ccggggtgcg tcagaatgtg atgggctcca gcattgatgg 4140

tcgccccgtc ctgcccgcaa actctactac cttgacctac gagaccgtgt ctggaacgcc 4200

gttggagact gcagcctccg ccgccgcttc agccgctgca gccaccgccc gcgggattgt 4260

gactgacttt gctttcctga gcccgcttgc aagcagtgca gcttcccgtt catccgcccg 4320

cgatgacaag ttgacggctc ttttggcaca attggattct ttgacccggg aacttaatgt 4380

cgtttctcag cagctgttgg atctgcgcca gcaggtttct gccctgaagg cttcctcccc 4440

tcccaatgcg gtttaaaaca taaataaaaa accagactct gtttggattt ggatcaagca 4500

agtgtcttgc tgtctttatt taggggtttt gcgcgcgcgg taggcccggg accagcggtc 4560

tcggtcgttg agggtcctgt gtattttttc caggacgtgg taaaggtgac tctggatgtt 4620

cagatacatg ggcataagcc cgtctctggg gtggaggtag caccactgca gagcttcatg 4680

ctgcggggtg gtgttgtaga tgatccagtc gtagcaggag cgctgggcgt ggtgcctaaa 4740

aatgtctttc agtagcaagc tgattgccag gggcaggccc ttggtgtaag tgtttacaaa 4800

gcggttaagc tgggatgggt gcatacgtgg ggatatgaga tgcatcttgg actgtatttt 4860

taggttggct atgttcccag ccatatccct ccggggattc atgttgtgca gaaccaccag 4920

cacagtgtat ccggtgcact tgggaaattt gtcatgtagc ttagaaggaa atgcgtggaa 4980

gaacttggag acgcccttgt gacctccaag attttccatg cattcgtcca taatgatggc 5040

aatgggccca cgggcggcgg cctgggcgaa gatatttctg ggatcactaa cgtcatagtt 5100

gtgttccagg atgagatcgt cataggccat ttttacaaag cgcgggcgga gggtgccaga 5160

ctgcggtata atggttccat ccggcccagg ggcgtagtta ccctcacaga tttgcatttc 5220

ccacgctttg agttcagatg gggggatcat gtctacctgc ggggcgatga agaaaacggt 5280

ttccggggta ggggagatca gctgggaaga aagcaggttc ctgagcagct gcgacttacc 5340

gcagccggtg ggcccgtaaa tcacacctat taccgggtgc aactggtagt taagagagct 5400

gcagctgccg tcatccctga gcaggggggc cacttcgtta agcatgtccc tgactcgcat 5460

gttttccctg accaaatccg ccagaaggcg ctcgccgccc agcgatagca gttcttgcaa 5520

ggaagcaaag tttttcaacg gtttgagacc gtccgccgta ggcatgcttt tgagcgtttg 5580

accaagcagt tccaggcggt cccacagctc ggtcacctgc tctacggcat ctcgatccag 5640

catatctcct cgtttcgcgg gttggggcgg ctttcgctgt acggcagtag tcggtgctcg 5700

tccagacggg ccagggtcat gtctttccac gggcgcaggg tcctcgtcag cgtagtctgg 5760

gtcacggtga aggggtgcgc tccgggctgc gcgctggcca gggtgcgctt gaggctggtc 5820

ctgctggtgc tgaagcgctg ccggtcttcg ccctgcgcgt cggccaggta gcatttgacc 5880

atggtgtcat agtccagccc ctccgcggcg tggcccttgg cgcgcagctt gcccttggag 5940

gaggcgccgc acgaggggca gtgcagactt ttgagggcgt agagcttggg cgcgagaaat 6000

accgattccg gggagtaggc atccgcgccg caggccccgc agacggtctc gcattccacg 6060

agccaggtga gctctggccg ttcggggtca aaaaccaggt ttcccccatg ctttttgatg 6120

cgtttcttac ctctggtttc catgagccgg tgtccacgct cggtgacgaa aaggctgtcc 6180

gtgtccccgt atacagactt gagagggagt ttaaacgaat tcaatagctt gttgcatggg 6240

cggcgatata aaatgcaagg tgctgctcaa aaaatcaggc aaagcctcgc gcaaaaaaga 6300

aagcacatcg tagtcatgct catgcagata aaggcaggta agctccggaa ccaccacaga 6360

aaaagacacc atttttctct caaacatgtc tgcgggtttc tgcataaaca caaaataaaa 6420

taacaaaaaa acatttaaac attagaagcc tgtcttacaa caggaaaaac aacccttata 6480

agcataagac ggactacggc catgccggcg tgaccgtaaa aaaactggtc accgtgatta 6540

aaaagcacca ccgacagctc ctcggtcatg tccggagtca taatgtaaga ctcggtaaac 6600

acatcaggtt gattcatcgg tcagtgctaa aaagcgaccg aaatagcccg ggggaataca 6660

tacccgcagg cgtagagaca acattacagc ccccatagga ggtataacaa aattaatagg 6720

agagaaaaac acataaacac ctgaaaaacc ctcctgccta ggcaaaatag caccctcccg 6780

ctccagaaca acatacagcg cttcacagcg gcagcctaac agtcagcctt accagtaaaa 6840

aagaaaacct attaaaaaaa caccactcga cacggcacca gctcaatcag tcacagtgta 6900

aaaaagggcc aagtgcagag cgagtatata taggactaaa aaatgacgta acggttaaag 6960

tccacaaaaa acacccagaa aaccgcacgc gaacctacgc ccagaaacga aagccaaaaa 7020

acccacaact tcctcaaatc gtcacttccg ttttcccacg ttacgtaact tcccatttta 7080

agaaaactac aattcccaac acatacaagt tactccgccc taaaacctac gtcacccgcc 7140

ccgttcccac gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat attggcttca 7200

atccaaaata aggtatatta ttgatgatgt taattaacat gcatggatcc atatgcggtg 7260

tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc 7320

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 7380

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 7440

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 7500

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 7560

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 7620

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 7680

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 7740

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 7800

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 7860

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 7920

cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 7980

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 8040

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 8100

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 8160

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 8220

tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 8280

agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 8340

gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 8400

accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 8460

tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 8520

tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcagcca tgagattatc 8580

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttcac gtagaaagcc agtccgcaga aacggtgctg 8640

accccggatg aatgtcagct actgggctat ctggacaagg gaaaacgcaa gcgcaaagag 8700

aaagcaggta gcttgcagtg ggcttacatg gcgatagcta gactgggcgg ttttatggac 8760

agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt aaggttggga agccctgcaa 8820

agtaaactgg atggctttct cgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat caagctctga 8880

tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 8940

tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 9000

ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 9060

cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 9120

cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 9180

gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 9240

gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 9300

cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 9360

tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 9420

cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 9480

ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 9540

gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 9600

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