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一種提高青蒿中青蒿素含量的方法與流程

文檔序號:12167361閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,將紫穗槐二烯合成酶ADS基因、紫穗槐-4,11-二烯氧化酶CYP71AV1基因、細胞色素P450還原酶CPR基因和乙醛脫氫酶ALDH1基因共轉化青蒿。

2.如權利要求1所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,所述ADS基因的序列如SEQ ID No.1所示,所述CYP71AV1基因的序列如SEQ ID No.2所示,所述CPR基因的序列如SEQ ID No.3所示,所述ALDH1基因的序列如SEQ ID No.4所示。

3.如權利要求1所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,所述方法包括步驟:

1)采用基因克隆方法獲得ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因;

2)將所述ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因連接于表達調控序列,形成含ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因的植物表達載體;

3)將所述含ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因的植物表達載體轉化根癌農桿菌,獲得用于轉化青蒿的含ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因的植物表達載體的根癌農桿菌菌株;

4)將含ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因的植物表達載體的根癌農桿菌菌株轉化青蒿,獲得轉基因青蒿植株。

4.如權利要求3所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,步驟2)中,所述含ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因的植物表達載體的構建包括如下步驟:分別將ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因連接到中間載體上,經雙酶切后將ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因分別連入表達載體上,獲得CaMV 35S-ADS-nos、CaMV 35S-CYP71AV1-nos、CaMV 35S-CPR-nos和CaMV 35S-ALDH1-nos表達盒;通過無縫克隆技術將CaMV35S-ADS-nos、CaMV 35S-CYP71AV1-nos、CaMV 35S-CPR-nos和CaMV35S-ALDH1-nos表達盒連入另一表達載體中,獲得所述植物表達載體。

5.如權利要求4所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,所述中間載體為pMD18T,所述表達載體為pCAMBIA1304,所述另一表達載體為pCAMBIA2300。

6.如權利要求3所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,步驟3)中,采用凍融法將所述植物雙元表達載體轉化根癌農桿菌。

7.如權利要求3所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,步驟4)中,所述根癌農桿菌菌株轉化青蒿,包括外植體培養;所述根癌農桿菌菌株與所述外植體的共培養;抗性再生植株的篩選;其中,所述共培養時,將所述外植體轉到共培養培養基中,滴加所述根癌農桿菌,使外植體與菌液充分接觸;所述共培養培養基為1/2MS+AS 100μmol/L。

8.如權利要求3所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,所述方法還包括步驟5),對獲得的轉基因青蒿中的青蒿素含量進行高效液相色譜-蒸發光散射檢測器測定,獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。

9.如權利要求8所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,高效液相色譜-蒸發光散射檢測器測定包括:色譜柱C-18反相硅膠柱,流動相為甲醇:水,其中,甲醇:水的體積比為60:40,柱溫30℃,流速1.0mL/min,進樣量20μL,蒸發光散射檢測器漂移管溫度40℃,載氣壓力5bar。

10.一種青蒿素含量提高的青蒿,其特征在于,所述青蒿中共轉化有ADS基因、CYP71AV1基因、CPR基因和ALDH1基因。

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