本發明涉及一種桑黃顆粒菌種的制備方法，屬于食用菌栽培
技術領域：
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背景技術：
：桑黃Sanghuangporussanghuang是我國最為著名的藥用真菌之一，專性寄生于桑屬Morus樹木上，分類學上隸屬擔子菌門Basidiomycota，傘菌綱Agaricomycetes，銹革孔菌目Hymenochaetales，銹革孔菌科Hymenochaetaceae，桑黃屬Sanghuangporus。據《藥性論》記載：桑黃味微苦，性寒，在我國傳統中藥中用于治療痢疾、盜汗、血崩、血淋、臍腹澀痛、脫肛瀉血、帶下、閉經；《神農本草經》將桑黃描述為“久服輕身不老延年”，還有解毒、提高消化系統機能的作用。一直以來，桑黃野生資源稀缺，且有日益枯竭的危險。面對巨大的市場需求，桑黃人工栽培具有巨大的市場前景和經濟效益。菌種作為桑黃人工栽培生產中的重要一環，至關重要。傳統的原種、栽培種培養基材料多以木屑、棉籽殼等材料為主，采用塑料袋、大口罐頭瓶或小口鹽水瓶等進行封裝。該類菌種生產方式，通常存在接種效率低，生長周期長，長滿菌絲后結成塊狀，使用時不易將其搗碎，轉接栽培種速度慢，搗碎后的菌種塊也常因菌絲部分受損而影響定植速度和吃料效果，以及培養過程中因密封不嚴或通氣過小等造成雜菌污染及菌絲缺氧、生長受抑制等情況發生。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種培養周期短、菌種活力強的桑黃菌種制備方法。技術方案一種桑黃顆粒菌種的制備方法，包括以下步驟：一、準備原料：帶殼/帶皮谷物、石膏粉、蔗糖和真菌激發子；其中，帶殼谷物96-98％、石膏粉1-2％、蔗糖1-2％，三者的總量為100％，所述％為質量百分數；真菌激發子的質量為帶殼谷物、石膏粉和蔗糖總質量的0.001-0.002％；二、帶殼谷物在水中浸泡至吸水充足，然后煮制至無白心時撈出、瀝干表面水分，得熟化谷物；三、將石膏粉、蔗糖、真菌激發子與熟化谷物混合，得培養基質；四、將培養基質置于培養容器，然后滅菌；所述培養基質占培養容器體積的三分之二；五、將桑黃液體菌種接種于培養容器中的培養基質，于25-30℃恒溫、避光、靜置培養至菌絲充滿培養容器，即得桑黃顆粒菌種；所述真菌激發子，其制備方法包括以下步驟：（1）10g菌株菌絲體用200-400mL質量濃度為70%乙醇浸泡24h后，5000r/min離心20-30min，收集殘渣；（2）向步驟（1）收集的殘渣中加入100-200mL蒸餾水，100℃提取1-2h，5000r/min離心20-30min，分別收集上清液、殘渣；（3）步驟（2）收集的殘渣按步驟（2）的方法重復1次；（4）合并步驟（2）和（3）收集的上清液，加入800-1600mL的質量濃度為95%乙醇醇沉24h，5000r/min離心30min后收集沉淀；所得沉淀即為真菌激發子；所述菌株為T型異擔子菌或薄多年臥孔菌。用薄多年臥孔菌菌株制備的真菌激發子簡稱P激發子；用T型異擔子菌菌株制備的真菌激發子簡稱H激發子。實驗證明，本發明的這兩種真菌激發子對桑黃顆粒菌種CMC酶、半纖維素酶和漆酶這三種胞外酶的酶活均有激發作用，即提高酶活。所述漆酶為含銅的多酚氧化酶。本發明的制備方法，接種2-4天后，菌種萌發并開始吃料；接種10-15天，菌絲充滿容器，培養結束。所得顆粒菌種可用于轉接栽培種或栽培袋，接種后萌發率可達100%。對于暫時不使用的顆粒菌種或用于菌種保藏的顆粒菌種，可用透明膠帶密封瓶蓋透氣孔后，置4℃冰箱中，避光保藏1-2年，使用時取出即可，接種后萌發率仍可達100%。相對沒有添加真菌激發子的制備方法，在其他條件相同的情況下（培養時間相同的情況下），采用本發明的制備方法所獲得的菌種胞外酶的活性明顯提高，所得菌種的活性提高。上述制備方法，真菌激發子的用量變化，會對制備方法及所制備的菌種產生影響。優選的，真菌激發子的質量為帶殼谷物、石膏粉和蔗糖總質量的0.0015％。上述制備方法，所述谷物可以谷子、高粱、大麥、小麥、玉米等。選擇不同的谷物，所制備的菌種萌發及菌絲生長速度以及菌種生長狀態等均存在差異，優選為谷子。上述制備方法，桑黃液體菌種以50mL/kg的接種量接種后第5-8天，晃動培養容器，使已長及未長菌絲的谷物顆粒混合均勻，以增加發菌點，促進培養速度。上述制備方法，所用容器為配有通氣濾膜瓶蓋的組培瓶。組培瓶身透明，便于隨時觀察菌種生長情況及有無雜菌污染，瓶蓋所帶濾膜可有效保證菌種培養過程中對無菌空氣的需求，瓶蓋為螺旋式上緊，密封性好，相比傳統方式操作更加簡便、防污染及通氣保障更加有效；組培瓶形狀規整，可多層摞放，有效增加空間利用率，便于運輸及儲藏。有益效果與傳統的桑黃原種生產方式相比，本發明提供了一種簡單易操作的桑黃顆粒菌種配方及制備方法，使接種效率、菌種活力及成功率均有效提高，并適宜進行大規模生產。具體來說：本發明采用帶殼或帶皮谷物作為顆粒菌種的主要材料，營養豐富全面，可滿足桑黃菌絲生長的需求，菌種活力強；本發明中顆粒菌種采用桑黃液體菌種進行接種，接種后萌發點多，能縮短培養時間；本發明在帶殼或帶皮谷物中添加有真菌激發子，能激發桑黃顆粒菌種胞外酶的酶活，從而使得菌種活力強，可將傳統菌種培養時間從1-3個月縮短到10-15天；本發明所獲得顆粒菌種為分散顆粒狀菌種，可有效避免傳統菌種使用過程中，因搗碎接種塊而造成的菌絲損傷，有效保證菌種活力，另顆粒狀分散菌種發菌點多，用于栽培用種量少、成活快、封面早，產量可提高10-20％以上；本發明顆粒菌種培養所用容器為配有通氣濾膜瓶蓋的組培瓶，瓶身透明，便于隨時觀察菌種生長情況及有無雜菌污染，瓶蓋所帶濾膜可有效保證菌種培養過程中對無菌空氣的需求，瓶蓋為螺旋式上緊，密封性好，相比傳統方式操作更加簡便、防污染及通氣保障更加有效；本發明顆粒菌種培養所用組培瓶形狀規整，可多層摞放，有效增加空間利用率，便于運輸及儲藏；本發明顆粒菌種所用組培瓶可多次循環使用，整體生產成本低，便于推廣應用。具體實施方式實施例1桑黃液體菌種的制備：將桑黃母種無菌操作接種于液體菌種培養基中進行震蕩培養，培養條件為：溫度26℃、搖床轉速150r/min、避光振蕩培養5天，即得桑黃液體菌種；液體培養基組成：玉米粉40g/L、葡萄糖25g/L、酵母抽提物10g/L、麩皮20g/L、KH2PO41.25g/L、MgSO4·7H2O0.625g/L、去離子水余量。實施例2真菌激發子的制備：（1）10g菌株菌絲體用200-400mL質量濃度為的70%乙醇浸泡24h后，5000r/min離心20-30min，收集殘渣；（2）向步驟（1）收集的殘渣中加入100-200mL蒸餾水，100℃提取1-2h，5000r/min離心20-30min，分別收集上清液、殘渣；（3）步驟（2）收集的殘渣按步驟（2）方法重復1次；（4）合并步驟（2）和（3）收集的上清液，加入800-1600mL的質量濃度為95%乙醇醇沉24h，5000r/min離心30min后收集沉淀；所得沉淀即為真菌激發子；所述菌株為T型異擔子菌或薄多年臥孔菌。用薄多年臥孔菌菌株制備的真菌激發子簡稱P激發子；用T型異擔子菌菌株制備的真菌激發子簡稱H激發子。實施例3桑黃顆粒菌種的制備：（1）材料的選擇：選擇帶殼谷子作為顆粒菌種的主要材料；（2）材料預處理：稱取98kg帶殼谷子，在自來水中浸泡12小時，確保吸水充足；（3）沸水煮制：將浸泡后吸水充足的谷子轉入鍋內，加水沒過料面3cm，逐漸加溫至水沸，谷子煮制熟而不爛，無白心時，即可撈出瀝水；（4）拌料：將瀝干表面水分的谷子加入1kg石膏粉、1kg蔗糖和1.5g實施例2制備的H激發子后，攪拌均勻；（5）裝瓶：選用240mL組培瓶，將拌好的料裝至總體積的三分之二后，擰上帶有通氣濾膜的瓶蓋；（6）滅菌：將裝料完成后的組培瓶轉至高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃，高壓蒸汽滅菌2小時；（7）接種：待料溫降至30℃以下時，無菌操作，以5mL/瓶的接種量，接入實施例1制備的桑黃液體菌種；（8）培養：接種后的組培瓶轉入27℃恒溫培養箱中，避光靜置培養；（9）搖瓶：接種1天后，菌種萌發并開始吃料，接種后5天時，晃動組培瓶，使已長及未長菌絲的谷物顆?；旌暇鶆颍黾影l菌點，促進培養速度；（10）培養結束：接種后10天，菌絲滿瓶，培養結束，即得桑黃顆粒菌種；所得顆粒菌種可用于轉接栽培種或栽培袋，接種后成活率可達100%。實施例4桑黃顆粒菌種的制備：（1）材料的選擇：選擇帶殼谷子作為顆粒菌種的主要材料；（2）材料預處理：稱取98kg帶殼谷子，在自來水中浸泡12小時，確保吸水充足；（3）沸水煮制：將浸泡后吸水充足的谷子轉入鍋內，加水沒過料面3cm，逐漸加溫至水沸，谷子煮制熟而不爛，無白心時，即可撈出瀝水；（4）拌料：將瀝干表面水分的谷子加入1kg石膏粉、1kg蔗糖和1.0g實施例2制備的H激發子后，攪拌均勻；（5）裝瓶：選用240mL組培瓶，將拌好的料裝至總體積的三分之二后，擰上帶有通氣濾膜的瓶蓋；（6）滅菌：將裝料完成后的組培瓶轉至高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃，高壓蒸汽滅菌2小時；（7）接種：待料溫降至30℃以下時，無菌操作，以5mL/瓶的接種量，接入實施例1制備的桑黃液體菌種；（8）培養：接種后的組培瓶轉入27℃恒溫培養箱中，避光靜置培養；（9）搖瓶：接種2天后，菌種萌發并開始吃料，接種后5天時，晃動組培瓶，使已長及未長菌絲的谷物顆粒混合均勻，增加發菌點，促進培養速度；（10）培養結束：接種后11天，菌絲滿瓶，培養結束，即得桑黃顆粒菌種；所得顆粒菌種可用于轉接栽培種或栽培袋，接種后成活率可達100%。實施例5桑黃顆粒菌種的制備：（1）材料的選擇：選擇帶殼谷子作為顆粒菌種的主要材料；（2）材料預處理：稱取98kg帶殼谷子，在自來水中浸泡12小時，確保吸水充足；（3）沸水煮制：將浸泡后吸水充足的谷子轉入鍋內，加水沒過料面3cm，逐漸加溫至水沸，谷子煮制熟而不爛，無白心時，即可撈出瀝水；（4）拌料：將瀝干表面水分的谷子加入1kg石膏粉、1kg蔗糖和2.0g實施例2制備的H激發子后，攪拌均勻；（5）裝瓶：選用240mL組培瓶，將拌好的料裝至總體積的三分之二后，擰上帶有通氣濾膜的瓶蓋；（6）滅菌：將裝料完成后的組培瓶轉至高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃，高壓蒸汽滅菌2小時；（7）接種：待料溫降至30℃以下時，無菌操作，以5mL/瓶的接種量，接入實施例1制備的桑黃液體菌種；（8）培養：接種后的組培瓶轉入27℃恒溫培養箱中，避光靜置培養；（9）搖瓶：接種2天后，菌種萌發并開始吃料，接種后5天時，晃動組培瓶，使已長及未長菌絲的谷物顆?；旌暇鶆?，增加發菌點，促進培養速度；（10）培養結束：接種后10天，菌絲滿瓶，培養結束，即得桑黃顆粒菌種；所得顆粒菌種可用于轉接栽培種或栽培袋，接種后成活率可達100%。實施例6（1）材料的選擇：選擇帶殼高粱作為顆粒菌種的主要材料；（2）材料預處理：稱取97kg帶殼高粱，在自來水中浸泡18小時，確保吸水充足；（3）沸水煮制：將浸泡后吸水充足的高粱轉入鍋內，加水沒過料面3cm，逐漸加溫至水沸，高粱煮制熟而不爛，無白心時，即可撈出瀝水；（4）拌料：將瀝干表面水分的高粱加入1.5kg石膏粉、1.5kg蔗糖和1.5g實施例2制備的H激發子后，攪拌均勻；（5）裝瓶：選用240mL組培瓶，將拌好的料裝至總體積的三分之二后，擰上帶有通氣濾膜的瓶蓋；（6）滅菌：將裝料完成后的組培瓶轉至高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃，高壓蒸汽滅菌2.5小時；（7）接種：待料溫降至30℃以下時，無菌操作，以4mL/瓶的接種量，接入實施例1制備的桑黃液體菌種；（8）培養：接種后的組培瓶轉入27℃恒溫培養箱中，避光靜置培養；（9）搖瓶：接種3天后，菌種萌發并開始吃料，接種后7天時，晃動組培瓶，使已長及未長菌絲的谷物顆粒混合均勻，增加發菌點，促進培養速度；（10）培養結束：接種后14天，菌絲滿瓶，培養結束，即得桑黃顆粒菌種；所得顆粒菌種可用于轉接栽培種或栽培袋，接種后成活率可達100%。實施例7（1）材料的選擇：選擇帶殼谷子作為顆粒菌種的主要材料；（2）材料預處理：稱取96kg帶殼谷子，在自來水中浸泡18小時，確保吸水充足；（3）沸水煮制：將浸泡后吸水充足的谷子轉入鍋內，加水沒過料面3cm，逐漸加溫至水沸，谷子煮制熟而不爛，無白心時，即可撈出瀝水；（4）拌料：將瀝干表面水分的谷子加入2kg石膏粉、2kg蔗糖和1.5g實施例2制備的H激發子后，攪拌均勻；（5）裝瓶：選用240mL組培瓶，將拌好的料裝至總體積的三分之二后，擰上帶有通氣濾膜的瓶蓋；（6）滅菌：將裝料完成后的組培瓶轉至高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃，高壓蒸汽滅菌2.5小時；（7）接種：待料溫降至30℃以下時，無菌操作，以4mL/瓶的接種量，接入實施例1制備的桑黃液體菌種；（8）培養：接種后的組培瓶轉入27℃恒溫培養箱中，避光靜置培養；（9）搖瓶：接種2天后，菌種萌發并開始吃料，接種后6天時，晃動組培瓶，使已長及未長菌絲的谷物顆?；旌暇鶆?，增加發菌點，促進培養速度；（10）培養結束：接種后12天，菌絲滿瓶，培養結束，即得桑黃顆粒菌種；所得顆粒菌種可用于轉接栽培種或栽培袋，接種后成活率可達100%。對比例1桑黃顆粒菌種的制備：（1）材料的選擇：選擇帶殼谷子作為顆粒菌種的主要材料；（2）材料預處理：稱取98kg帶殼谷子，在自來水中浸泡12小時，確保吸水充足；（3）沸水煮制：將浸泡后吸水充足的谷子轉入鍋內，加水沒過料面3cm，逐漸加溫至水沸，谷子煮制熟而不爛，無白心時，即可撈出瀝水；（4）拌料：將瀝干表面水分的谷子加入1kg石膏粉和1kg蔗糖后，攪拌均勻；（5）裝瓶：選用240mL組培瓶，將拌好的料裝至總體積的三分之二后，擰上帶有通氣濾膜的瓶蓋；（6）滅菌：將裝料完成后的組培瓶轉至高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃，高壓蒸汽滅菌2小時；（7）接種：待料溫降至30℃以下時，無菌操作，以5mL/瓶的接種量，接入實施例1制備的桑黃液體菌種；（8）培養：接種后的組培瓶轉入27℃恒溫培養箱中，避光靜置培養；（9）搖瓶：接種2天后，菌種萌發并開始吃料，接種后6天時，晃動組培瓶，使已長及未長菌絲的谷物顆?；旌暇鶆?，增加發菌點，促進培養速度；（10）培養結束：接種后13天，菌絲滿瓶，培養結束，即得桑黃顆粒菌種；所得顆粒菌種可用于轉接栽培種或栽培袋，接種后成活率可達100%。對比例2（1）取木屑85g、麩皮10.5g、玉米粉2g、石膏粉1g、磷酸二氫鉀0.5g和蔗糖1g混合均勻，得拌料；拌料與水按照1：1.2的質量比混合均勻，得培養基；（2）裝瓶：選用240mL組培瓶，將培養基裝至總體積的三分之二后，擰上帶有通氣濾膜的瓶蓋；（3）滅菌：將裝料完成后的組培瓶轉至高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃，高壓蒸汽滅菌2小時；（4）接種：待料溫降至30℃以下時，無菌操作，以5mL/瓶的接種量，接入實施例1制備的桑黃液體菌種（5）培養：接種后的組培瓶轉入27℃恒溫培養箱中，避光靜置培養；；（6）搖瓶：接種5天后，菌種萌發并開始吃料，接種后9天時，晃動組培瓶，使已長及未長菌絲的谷物顆?；旌暇鶆?，增加發菌點，促進培養速度；；（7）培養結束：接種后18天，菌絲滿瓶，培養結束，即得桑黃菌種；所得菌種可用于轉接栽培種或栽培袋，接種后成活率可達99%。對比例3（1）取木屑45g、棉籽殼40g、麩皮10g、玉米粉2g、石膏粉1g、磷酸二氫鉀1g和蔗糖1g混合均勻，得拌料；拌料與水按照1：1.2的質量比混合均勻，得培養基；（2）裝瓶：選用240mL組培瓶，將培養基裝至總體積的三分之二后，擰上帶有通氣濾膜的瓶蓋；（3）滅菌：將裝料完成后的組培瓶轉至高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃，高壓蒸汽滅菌2小時；（4）接種：待料溫降至30℃以下時，無菌操作，以5mL/瓶的接種量，接入實施例1制備的桑黃液體菌種（5）培養：接種后的組培瓶轉入27℃恒溫培養箱中，避光靜置培養；；（6）搖瓶：接種6天后，菌種萌發并開始吃料，接種后11天時，晃動組培瓶，使已長及未長菌絲的谷物顆粒混合均勻，增加發菌點，促進培養速度；；（7）培養結束：接種后21天，菌絲滿瓶，培養結束，即得桑黃菌種；所得二級菌種可用于轉接栽培種或栽培袋，接種后成活率可達98%。效果實驗：分別觀察實施例3-7、對比例1接種10天后組培瓶中菌絲的分布狀態；分別取實施例3-7、對比例1-3接種10天后的培養產物，檢測其胞外酶酶活（采用常規方法檢測酶活即可，單位為U/g，即每g培養產物的酶活）；結果如表1所示；表1CMC酶酶活半纖維素酶酶活漆酶酶活實施例319.97U/g11.76U/g5.31U/g實施例418.79U/g10.35U/g5.09U/g實施例519.54U/g11.29U/g5.27U/g實施例619.05U/g11.31U/g5.18U/g實施例718.93U/g10.52U/g5.07U/g對比例111.4U/g8.49U/g2.07U/g對比例23.77U/g4.34U/g0.99U/g對比例32.95U/g1.99U/g2.55U/g另外，本發明采用實施例1制備的P激發子代替實施例3-7中的H激發子；所獲得的培養產物的酶活與實施例3-7的相當。當前第1頁1 2 3