本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)酶解技術領域，尤其涉及一種藻藍蛋白多肽的制備方法。

背景技術：

藻藍蛋白(Phycocyanin，又稱PC)是一種存在于紅藻和藍藻細胞內(nèi)的光合輔助色素，能高效捕獲光能。近年來的研究發(fā)現(xiàn)藻藍蛋白具有抗氧化、抗癌、抗炎和神經(jīng)保護等多種生物活性，對它的研究已經(jīng)成為研究天然海洋藥物的熱點。我國對藻藍蛋白的研究始于20世紀70年代，經(jīng)過了30多年來的研究開發(fā)，雖然有了較大的進展，但大都處于實驗室水平。同時，以藻藍蛋白為主的功能性食品不多，在藥品的研究開發(fā)方面還是空白。酶水解可以提高蛋白質(zhì)的功能特性，得到的肽具有一些蛋白質(zhì)無法比擬的物理化學特性。如果采用酶解的方法將藻藍蛋白降解為可溶性寡肽，則可大大提高其在食品中的理化性能，并可能獲得其前體沒有的生理活性。目前已有專利涉及到藻藍蛋白的酶解。專利螺旋藻藻藍蛋白的酶解產(chǎn)物及其應用(申請?zhí)?00910178865.6)提供螺旋藻藻藍蛋白的酶解產(chǎn)物、包括螺旋藻藻藍蛋白的酶解產(chǎn)物的功能食品、以及包含螺旋藻藻藍蛋白的酶解產(chǎn)物和藥學上可接受的載體的藥物組合物。專利一種利用藻藍蛋白制備Caspase-3激活的方法(申請?zhí)?01110377690.6)公開了運用供一種從螺旋藻干粉中提取藻藍蛋白，利用胰蛋白酶水解藻藍蛋白，分離得到比藻藍蛋白本身對Caspase-3酶活力的激活作用更有效，對正常細胞無毒活性的肽的方法。然而現(xiàn)有的藻藍蛋白酶解方法，通常是采用單一的酶解技術對藻藍蛋白進行酶解，存在蛋白水解效率低下的缺點。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于此，有必要提供一種蛋白水解效率較高的藻藍蛋白多肽的制備方法。

一種藻藍蛋白多肽的制備方法，包括如下步驟：

將水加入藻藍蛋白中，攪拌使其充分溶解，得到藻藍蛋白溶液；

向所述藻藍蛋白溶液中加入木瓜蛋白酶或中性蛋白酶，攪拌均勻后，超聲處理30～50min，得到酶解產(chǎn)物；

將所述酶解產(chǎn)物升溫至85℃～95℃并保溫5～15min，滅酶后冷卻至30℃～40℃，離心，取上清，即為酶解液；

將所述酶解液進行超濾處理，得到超濾液；

將所述超濾液進行真空濃縮，噴霧干燥處理得到所述藻藍蛋白多肽。

在其中一個實施例中，將水加入藻藍蛋白中，攪拌使其充分溶解，得到藻藍蛋白溶液的操作中，藻藍蛋白和水的料液比為1:10～1:50。

在其中一個實施例中，將水加入藻藍蛋白中，攪拌使其充分溶解，得到藻藍蛋白溶液的操作中，采用恒溫磁力攪拌，溫度為50℃～55℃。

在其中一個實施例中，木瓜蛋白酶和藻藍蛋白的質(zhì)量比為1:100～1:20。

在其中一個實施例中，中性蛋白酶和藻藍蛋白的質(zhì)量比為1:30～1:20。

在其中一個實施例中，在加入木瓜蛋白酶之前，還包括將所述藻藍蛋白溶液的pH調(diào)節(jié)至5.0～7.0的步驟。

在其中一個實施例中，在加入中性蛋白酶之前，還包括將所述藻藍蛋白溶液的pH調(diào)節(jié)至6.0～7.0的步驟。

在其中一個實施例中，加入木瓜蛋白酶進行超聲處理的過程中，反應溫度為50℃～60℃。

在其中一個實施例中，加入中性蛋白酶進行超聲處理的過程中，反應溫度為45℃～55℃。

在其中一個實施例中，超聲處理的操作中，超聲功率為300～800W。

上述藻藍蛋白多肽的制備方法，采用超聲輔助酶解，超聲波具有空化作用，產(chǎn)生的氣泡經(jīng)擠壓破裂，可以瞬間產(chǎn)生極強的機械剪切力，使蛋白質(zhì)降解或者改變蛋白質(zhì)構象，促使其親水基團更多地暴露出來，提高藻藍蛋白在水中的溶解度，有利于酶和藻藍蛋白底物結合，能夠在較短時間內(nèi)顯著提高藻藍蛋白的酶解效率。

附圖說明

圖1為一實施方式的藻藍蛋白多肽的制備方法的流程圖；

圖2為實施例1制備得到的藻藍蛋白多肽濃度對DPPH自由基的清除影響圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明，應當理解，此處所描述的具體實例僅以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

請參考圖1，一實施方式的藻藍蛋白多肽的制備方法，包括如下步驟：

S10、將水加入藻藍蛋白中，攪拌使其充分溶解，得到藻藍蛋白溶液。

其中，藻藍蛋白的純度A₆₂₀/A₂₈₀>2。藻藍蛋白和水的料液比可以為1:10～1:50。

S10的操作中，采用恒溫磁力攪拌使藻藍蛋白溶解，溫度可以為50℃～55℃。攪拌時間可以為20～40min。

S20、向藻藍蛋白溶液中加入木瓜蛋白酶或中性蛋白酶，攪拌均勻后，超聲處理30～50min，得到酶解產(chǎn)物。

其中，超聲處理可以在水浴超聲裝置中進行。

其中，木瓜蛋白酶的酶活力可以為5×10⁵～10×10⁵U/g。木瓜蛋白酶和藻藍蛋白的質(zhì)量比可以為1:100～1:20。加入木瓜蛋白酶進行超聲處理的過程中，反應溫度可以為50℃～60℃。超聲功率可以為300～800W。在加入木瓜蛋白酶之前，還可以包括將藻藍蛋白溶液的pH調(diào)節(jié)至5.0～7.0的步驟。進一步的，可以采用1M鹽酸進行藻藍蛋白溶液的pH調(diào)節(jié)。

其中，中性蛋白酶的酶活力為1×10⁵～3×10⁵U/g。中性蛋白酶和藻藍蛋白的質(zhì)量比可以為1:30～1:20。加入中性蛋白酶進行超聲處理的過程中，反應溫度可以為45℃～55℃。超聲功率可以為300～800W。在加入中性蛋白酶之前，還可以包括將藻藍蛋白溶液的pH調(diào)節(jié)至6.0～7.0的步驟。進一步的，可以采用1M鹽酸進行藻藍蛋白溶液的pH調(diào)節(jié)。

S30、將酶解產(chǎn)物升溫至85℃～95℃并保溫5～15min，滅酶后冷卻，離心，取上清，即為酶解液。

其中，升溫速率可以為20～30℃/min。

S30中，滅酶后，冷卻至30℃～40℃后再離心。

離心操作中，可以采用10000r/min的轉速離心10min。

S40、將酶解液進行超濾處理，得到超濾液。

其中，可以采用截留分子質(zhì)量為1kD～10kD超濾膜進行超濾處理。

S50、將超濾液進行真空濃縮，噴霧干燥處理得到藻藍蛋白多肽。

上述藻藍蛋白多肽的制備方法，采用超聲輔助酶解，超聲波具有空化作用，產(chǎn)生的氣泡經(jīng)擠壓破裂，可以瞬間產(chǎn)生極強的機械剪切力，使蛋白質(zhì)降解或者改變蛋白質(zhì)構象，促使其親水基團更多地暴露出來，提高藻藍蛋白在水中的溶解度，有利于酶和藻藍蛋白底物結合，能夠在較短時間內(nèi)顯著提高藻藍蛋白的酶解效率，所得到的多肽具有較強的抗氧化性。

下面為具體實施例部分。

實施例1

(1)稱取5g藻藍蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入200mL蒸餾水，于恒溫磁力攪拌器上攪拌30min，使其充分溶解，得到藻藍蛋白溶液；

(2)將步驟(1)所得的藻藍蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，然后加入1.5g木瓜蛋白酶(酶活力8×10⁵U/g)，攪拌均勻后，在水浴超聲裝置中超聲處理，超聲功率為600W，反應溫度55℃，反應時間為50min，得到酶解產(chǎn)物；

(3)將酶解反應產(chǎn)物迅速升溫至90℃保溫10min，滅酶后冷卻至30℃，10000r/min離心10min，取上清，即為酶解液，測得藻藍蛋白的水解度為13.68％；

(4)采用截留分子質(zhì)量為5kD超濾膜將步驟(3)所得酶解液進行超濾處理，得到超濾液；

(5)將步驟(4)所得超濾液進行真空濃縮，噴霧干燥得到藻藍蛋白多肽。不同濃度的藻藍蛋白多肽對DPPH自由基清除能力如圖1所示，圖中的一條曲線為藻藍蛋白多肽濃度和DPPH自由基的清除率的關系曲線，另一條曲線為VC的濃度和DPPH自由基的清除率的關系曲線。可見，藻藍蛋白多肽對DPPH自由基的清除率和濃度有一定的關系，當藻藍蛋白多肽的濃度達到5mg/mL時，DPPH自由基清除率達87.31％。

實施例2

(1)稱取5g藻藍蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入50mL蒸餾水，于恒溫磁力攪拌器上攪拌至充分溶解，得到藻藍蛋白溶液；

(2)將步驟(1)所得的藻藍蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至5.0，然后按藻藍蛋白重量的5％加入木瓜蛋白酶(酶活力10×10⁵U/g)，攪拌均勻后，在水浴超聲裝置中超聲處理，超聲功率為300W，反應溫度50℃，反應時間為30min，得到酶解產(chǎn)物；

(3)將酶解反應產(chǎn)物迅速升溫至85℃保溫15min，滅酶后冷卻至30℃，10000r/min離心10min，取上清，即為酶解液，測得藻藍蛋白的水解度為12.97％；

(4)采用截留分子質(zhì)量為10kD超濾膜將步驟(3)所得酶解液進行超濾處理，得到超濾液；

(5)將步驟(4)所得超濾液進行真空濃縮，噴霧干燥得到藻藍蛋白多肽。所得藻藍蛋白多肽對DPPH自由基的清除率和濃度有一定的關系，當藻藍蛋白多肽的濃度達到5mg/mL時，DPPH自由基清除率達80.98％。

實施例3

(1)稱取10g藻藍蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入500mL蒸餾水，于恒溫磁力攪拌器上攪拌至充分溶解，得到藻藍蛋白溶液；

(2)將步驟(1)所得的藻藍蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，然后按藻藍蛋白重量的1％加入木瓜蛋白酶(酶活力10×10⁵U/g)，攪拌均勻后，在水浴超聲裝置中超聲處理，超聲功率為800W，反應溫度60℃，反應時間為50min，得到酶解產(chǎn)物；

(3)將酶解反應產(chǎn)物迅速升溫至95℃保溫5min，滅酶后冷卻至30℃，10000r/min離心10min，取上清，即為酶解液，測得藻藍蛋白的水解度為13.59％；

(4)采用截留分子質(zhì)量為1kD超濾膜將步驟(3)所得酶解液進行超濾處理，得到超濾液；

(5)將步驟(4)所得超濾液進行真空濃縮，噴霧干燥得到藻藍蛋白多肽。所得藻藍蛋白多肽對DPPH自由基的清除率和濃度有一定的關系，當藻藍蛋白多肽的濃度達到5mg/mL時，DPPH自由基清除率達85.16％。

實施例4

(1)稱取5g藻藍蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入200mL蒸餾水，于恒溫磁力攪拌器上攪拌30min，使其充分溶解，得到藻藍蛋白溶液；

(2)將步驟(1)所得的藻藍蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，然后按藻藍蛋白重量的3％加入中性蛋白酶(酶活力3×10⁵U/g)，攪拌均勻后，在水浴超聲裝置中超聲處理，超聲功率為600W，反應溫度55℃，反應時間為50min，得到酶解產(chǎn)物；

(3)將酶解反應產(chǎn)物迅速升溫至95℃保溫5min，滅酶后冷卻至30℃，10000r/min離心10min，取上清，即為酶解液，測得藻藍蛋白的水解度為11.82％；

(4)采用截留分子質(zhì)量為1kD超濾膜將步驟(3)所得酶解液進行超濾處理，得到超濾液；

(5)將步驟(4)所得超濾液進行真空濃縮，噴霧干燥得到藻藍蛋白多肽。所得藻藍蛋白多肽對DPPH自由基的清除率和濃度有一定的關系，當藻藍蛋白多肽的濃度達到6mg/mL時，DPPH自由基清除率達75.82％。

實施例5

(1)稱取5g藻藍蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入50mL蒸餾水，于恒溫磁力攪拌器上攪拌至充分溶解，得到藻藍蛋白溶液；

(2)將步驟(1)所得的藻藍蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，然后按藻藍蛋白重量的5％加入中性蛋白酶(酶活力1×10⁵U/g)，攪拌均勻后，在水浴超聲裝置中超聲處理，超聲功率為800W，反應溫度45℃，反應時間為30min，得到酶解產(chǎn)物；

(3)將酶解反應產(chǎn)物迅速升溫至85℃保溫15min，滅酶后冷卻至40℃，10000r/min離心10min，取上清，即為酶解液，測得藻藍蛋白的水解度為11.06％；

(4)采用截留分子質(zhì)量為10kD超濾膜將步驟(3)所得酶解液進行超濾處理，得到超濾液；

(5)將步驟(4)所得超濾液進行真空濃縮，噴霧干燥得到藻藍蛋白多肽。所得藻藍蛋白多肽對DPPH自由基的清除率和濃度有一定的關系，當藻藍蛋白多肽的濃度達到6mg/mL時，DPPH自由基清除率達70.03％。

以上所述僅是發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為發(fā)明的保護范圍。