本申請是申請日為2012年6月21日、申請號為“201280040857.5”、發明名稱為“流感病毒突變體及其用途”的發明專利申請的分案申請。相關申請的交叉引用本申請要求2011年6月24日提交的美國臨時申請號61/501,034的權益，其內容通過引用整體并入本文。序列表本申請包含已通過efs-web提交的ascii格式的序列表且該序列表的全部內容以引用方式并入本文。于2013年2月21日創建的所述ascii副本名稱為090248-0125_sl.txt且大小為28,140字節。
背景技術：
：流感是美國成年人死亡的主要原因。每年，約36,000人死于流感，超過200,000人住院。流感是一種高度接觸傳染的疾病，其通過咳嗽、噴嚏和通過與攜帶病毒的物體(諸如門把手和電話)的直接物理接觸而傳播。流感的征狀包括發熱、極度疲勞、頭痛、寒冷和身體疼痛；約50％的受感染者沒有征狀，但是仍然是接觸傳染的。免疫接種在65歲以下的健康人中具有70-90％的預防流感的有效性，只要循環病毒株的抗原性與疫苗的抗原性匹配。疫苗接種是預防流感的主要方法，并且活的減毒的和滅活的(殺死的)病毒疫苗都是目前可得到的。通常鼻內施用的活病毒疫苗會活化免疫系統的所有階段，且可以刺激針對多種病毒抗原的免疫應答。因而，活病毒的應用克服了在滅活病毒疫苗的制備過程中可能發生的病毒抗原破壞的問題。另外，與由滅活疫苗誘導的免疫相比，由活病毒疫苗產生的免疫通常更持久、更有效和更有交叉反應性，并且活病毒疫苗的生產成本比滅活的病毒疫苗更低。但是，減毒病毒的突變經常是不太確定的，且恢復是一個問題。技術實現要素：在一個方面，本公開內容提供了一種核酸序列，其包含seqidno:1。在一個方面，本公開內容提供了一種核酸序列，其包含seqidno:2。在一個方面，本公開內容提供了一種核酸序列，其包含seqidno:3。在一個方面，本公開內容提供了一種組合物，其包含與(i)啟動子和(ii)轉錄終止序列可操作地連接的seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3。在一個方面，本公開內容提供了一種重組流感病毒，其包含m基因中的突變。在某些實施方案中，所述重組流感病毒包含seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3。在某些實施方案中，所述m基因中的突變導致病毒表達m2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有seqidno:4的氨基酸序列的截短的m2蛋白。在某些實施方案中，在體外宿主細胞系統中至少10代，所述m基因中的突變不會恢復成野生型或編碼功能性m2蛋白的非野生型序列。在某些實施方案中，所述病毒是甲型流感病毒。在某些實施方案中，所述病毒在被所述病毒感染的哺乳動物中是非致病性的。在某些實施方案中，所述體外細胞系統包含中國倉鼠卵巢細胞。在某些實施方案中，所述體外細胞系統包含vero細胞。在一個方面，本公開內容提供了一種細胞，其包含權利要求5-10中的任一項所述的重組流感病毒。在某些實施方案中，所述細胞是在體外。在某些實施方案中，所述細胞是在體內。在一個方面，本公開內容提供了一種組合物，其包含：含有m基因中的突變的重組流感病毒。在某些實施方案中，所述組合物包含seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3。在某些實施方案中，所述m基因中的突變導致病毒表達m2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有seqidno:4的氨基酸序列的截短的m2蛋白。在某些實施方案中，所述病毒是甲型流感病毒。在某些實施方案中，所述組合物對施用所述組合物的哺乳動物是非致病性的。在某些實施方案中，在給哺乳動物施用所述組合物以后約3周內，所述組合物在哺乳動物中引起可檢測的免疫應答。在一個方面，本公開內容提供了一種疫苗，其包含：含有m基因中的突變的重組流感病毒。在某些實施方案中，所述疫苗包含seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3。在某些實施方案中，所述m基因中的突變導致病毒表達m2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有seqidno:4的氨基酸序列的截短的m2蛋白。在某些實施方案中，所述病毒是甲型流感病毒。在某些實施方案中，所述疫苗對施用所述疫苗的哺乳動物是非致病性的。在某些實施方案中，在給哺乳動物施用所述疫苗以后約3周內，所述疫苗在哺乳動物中引起可檢測的免疫應答。在某些實施方案中，除了所述重組病毒以外，所述疫苗包含至少2種不同的流感病毒株。在某些實施方案中，所述疫苗包含至少一種乙型流感病毒或乙型流感病毒抗原。在某些實施方案中，所述疫苗包含至少一種丙型流感病毒或丙型流感病毒抗原。在某些實施方案中，所述疫苗包含一種或多種病毒或病毒抗原，所述病毒或病毒抗原包含人甲型流感和得自非人物種的大范圍流行流感病毒。在某些實施方案中，所述疫苗包含選自h1n1、h2n2和h3n2的人甲型流感病毒。在一個方面，本公開內容提供了一種用于繁殖重組流感病毒的方法，所述方法包括：使宿主細胞與重組流感病毒seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3接觸；在適合病毒復制的條件下，溫育宿主細胞足夠的時間，和分離后代病毒顆粒。在一個方面，本公開內容提供了一種用于制備疫苗的方法，所述方法包括：將宿主細胞放入生物反應器中；使所述宿主細胞與重組病毒seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3接觸；在適合病毒繁殖的條件下，溫育所述宿主細胞足夠的時間；分離后代病毒顆粒；和配制所述后代病毒顆粒用于作為疫苗來施用。在一個方面，本公開內容提供了一種用于免疫受試者的方法，所述方法包括：施用包含重組流感病毒的組合物，所述重組流感病毒包含m基因中的突變，其中所述m基因中的突變導致病毒表達m2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有seqidno:4的氨基酸序列的截短的m2蛋白。在一個方面，本公開內容提供了一種用于降低受試者中的甲型流感病毒感染的可能性或嚴重程度的方法，所述方法包括：施用包含重組流感病毒的組合物，所述重組流感病毒包含m基因中的突變，其中所述m基因中的突變導致病毒表達m2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有seqidno:4的氨基酸序列的截短的m2蛋白。在某些實施方案中，所述重組流感病毒包含seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3。在某些實施方案中，所述方法包括：提供至少1個加強劑量的組合物，其中在第一次施用以后3周提供所述至少1個加強劑量。在某些實施方案中，所述方法包括：鼻內地、肌肉內地或皮內地施用所述組合物。在某些實施方案中，所述方法包括：皮內地進行施用。在某些實施方案中，所述方法包括：使用微型針遞送裝置進行施用。在一個方面，本公開內容提供了一種用于皮內施用免疫原性組合物的方法，所述方法包括：(a)提供微型針遞送裝置，其包括(i)穿刺機構；(ii)免疫原性組合物層，其包括多個能夠刺穿皮膚和允許免疫原性組合物皮內施用的微型針；和(b)壓迫所述穿刺機構；其中所述免疫原性組合物包含含有m基因中的突變的重組流感病毒，且其中所述m基因中的突變導致病毒表達m2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有seqidno:4的氨基酸序列的截短的m2蛋白。在某些實施方案中，所述重組流感病毒包含seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3。在某些實施方案中，所述微型針陣列最初位于裝置殼體的內部，并在桿致動后，允許微型針延伸穿過裝置底部并插入皮膚中，由此允許疫苗流體輸注進皮膚中。在一個方面，本公開內容提供了一種重組流感病毒，其包含m基因中的突變，其中所述病毒不在未修飾的選自以下的宿主細胞中復制：a中國倉鼠卵巢(cho)細胞、vero細胞、或madin-darby犬腎細胞。在某些實施方案中，所述m基因中的突變導致病毒表達m2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有seqidno:4的氨基酸序列的截短的m2蛋白。在一個方面，本公開內容提供了一種重組細胞，其包含編碼流感病毒m2離子通道基因的核酸，其中所述核酸在所述細胞中表達。在一個方面，本公開內容提供了一種重組細胞，其包含2,6-唾液酸受體基因。在一個方面，本公開內容提供了一種重組細胞，其包含表達(i)病毒的m2離子通道基因和(ii)2,6-唾液酸受體基因的細胞基因組或表達載體。在某些實施方案中，所述細胞是真核細胞。在某些實施方案中，所述真核細胞是中國倉鼠卵巢細胞或vero細胞。在某些實施方案中，所述重組細胞進一步包含人流感病毒，其中所述病毒不表達功能性m2蛋白。在一個方面，本公開內容提供了一種用于生產重組流感病毒顆粒的方法，所述方法包括：(a)用人流感病毒感染權利要求47-52中的一項所述的細胞，其中所述細胞要么(i)組成型地表達功能性的m2離子通道蛋白，要么(ii)在病毒感染以后被誘導表達功能性的m2離子通道蛋白，且其中所述病毒僅在有細胞表達的功能性m2離子通道蛋白存在下成功地復制；和(b)分離后代病毒顆粒。在某些實施方案中，所述方法進一步包括：將分離的病毒顆粒配制成疫苗。在某些實施方案中，所述病毒包含人流感病毒，且其中所述病毒不表達功能性m2蛋白。附圖說明圖1的圖描繪了m2離子通道在流感病毒生命周期中的作用，其中(1)流感病毒附著于細胞表面上的唾液酸受體；(2)病毒被內化進細胞中；(3)m2離子通道在病毒表面上表達；(4)m2離子通道打開以允許質子進入，從而導致進入細胞核的病毒rna的釋放，發生復制，并導致病毒蛋白合成；和(5)病毒組分被包裝進病毒粒子中和釋放。圖2是野生型和突變體m2基因的示意圖。如下刪除a/puertorico/8/1934(pr8)m區段的m2基因：在m1蛋白的開放讀碼框下游插入2個終止密碼子，隨后刪除跨膜結構域中的51個核苷酸以抑制全長m2蛋白的表達。圖3顯示了未加工的m1和m2的核苷酸序列(seqidno:28)。圖4的圖顯示了正常mdck細胞和穩定表達m2蛋白的mdck細胞(m2ck)中的m2ko(δtm)(上圖)和野生型pr8(下圖)病毒的生長動力學。以10-5的感染復數，用病毒感染細胞。確定細胞上清液中的病毒滴度。野生型pr8在兩個細胞類型中生長至高滴度，而m2ko(δtm)僅在m2ck細胞中生長得較好，在mdck細胞中根本不生長。圖5的蛋白質印跡表明，m2ko(δtm)病毒在正常細胞中生產病毒抗原，但是不生產m2。用pr8感染的小鼠血清(組a)或抗-m2單克隆抗體(組b)探測細胞裂解物。泳道1，分子量標志物；泳道2，被pr8感染的mdck細胞；泳道3，被m2ko(δtm)感染的mdck細胞；泳道4，未感染的mdck細胞。圖6的圖顯示了接種m2ko變體以后小鼠體重的變化。圖7a的圖顯示了接種m2ko變體的小鼠中的抗體應答。圖7b的圖顯示了感染后6周加強的小鼠的血清中的抗-pr8igg抗體滴度。圖8的圖顯示了接種m2ko變體以后，流感攻擊以后小鼠體重的變化。圖9的圖顯示了接種m2ko變體以后，流感攻擊以后的小鼠存活。圖10的圖顯示了鼻內地(in)、真皮內地(id)或肌肉內地(im)接種pr8以后小鼠體重的變化。圖11a的圖顯示了在接種pr8以后2周從具有1.8x101pfu(lo)或1.8x104pfu(hi)的病毒濃度的小鼠收集的血清中的抗體滴度。圖11b的圖顯示了在接種pr8以后7周從具有1.8x101pfu(lo)或1.8x104pfu(hi)的疫苗濃度的小鼠收集的血清中的抗體滴度。圖12的圖顯示了在接種pr8以后，流感攻擊以后的小鼠存活。圖13的圖顯示了在接種pr8以后，流感攻擊以后的小鼠體重的變化。圖14的圖顯示了接種后7周從小鼠收集的血清中的抗體滴度，所述小鼠真皮內地接種1.8x104pfupr8。圖15的圖顯示了真皮內地接種1.8x104pfupr8的小鼠的體重的變化。圖16的圖顯示了被雜亞型病毒感染的小鼠在攻擊后的存活百分比。圖17的圖顯示了得自不同疫苗接種組的小鼠的elisa滴度。圖18的圖顯示了同亞型病毒感染以后小鼠的存活百分比。圖19的圖顯示了雜亞型病毒攻擊以后小鼠的存活百分比。圖20的圖顯示了接種的雪貂(ferret)的體重的變化。給雪貂接種107tcid50的m2ko(δtm)病毒(組a)或107tcid50的a/布里斯班/10/2007(h3n2)甲型流感病毒(組b)。接種后監測體重3天。圖21的圖顯示了接種的雪貂的體溫的變化。給雪貂接種107tcid50的m2ko(δtm)病毒(組a)或107tcid50的a/布里斯班/10/2007(h3n2)甲型流感病毒(組b)。接種后監測體溫3天。圖22的圖顯示了疫苗接種以后雪貂的體重的變化。給雪貂接種107tcid50的m2ko(δtm)病毒[g1和g3]、107tcid50的fm#6病毒[g2和g4]或opti-memtm[g5]。在激發疫苗接種以后(組a)和接受加強疫苗以后(組b)，監測體重的變化14天。圖23的圖顯示了攻擊以后雪貂的體重的變化。用107tcid50的a/布里斯班/10/2007(h3n2)甲型流感病毒攻擊雪貂。接種后監測體重14天。圖24的圖顯示了疫苗接種以后雪貂的體溫的變化。給雪貂接種107tcid50的m2ko(δtm)病毒[g1和g3]、107tcid50的fm#6病毒[g2和g4]或opti-memtm[g5]。在激發疫苗接種以后(組a)和接受加強疫苗以后(組b)，監測體溫的變化14天。圖25的圖顯示了攻擊以后雪貂的體溫的變化。用107tcid50的a/布里斯班/10/2007(h3n2)甲型流感病毒攻擊雪貂。接種后監測體溫14天。圖26的圖顯示了病毒接種以后雪貂的重量的變化。在第0天給供體雪貂接種107tcid50的m2ko(δtm)病毒(組a)或107tcid50的a/布里斯班/10/2007(h3n2)病毒(組b)。接種后24小時(第1天)，將供體放入具有直接接觸(dc)的籠子中，所述籠子鄰近容納氣溶膠接觸(ac)的籠子。在供體接種以后，監測體重的變化14天。圖27的圖顯示了病毒接種以后雪貂的體溫的變化。在第0天給供體雪貂接種107tcid50的m2ko(δtm)病毒(組a)或107tcid50的a/布里斯班/10/2007(h3n2)病毒(組b)。接種后24小時(第1天)，將供體放入具有直接接觸(dc)的籠子中，所述籠子鄰近容納氣溶膠接觸(ac)的籠子。在供體接種以后，監測體溫的變化14天。圖28的圖表明，m2ko(δtm)疫苗會引起體液和粘膜應答。組a顯示了施用pr8、m2ko(δtm)、滅活的pr8(in、im)或pbs以后的血清igg和iga滴度。組b顯示了施用pr8、m2ko(δtm)、滅活的pr8(in、im)或pbs以后肺洗液igg和iga滴度。圖29的圖表明，m2ko(δtm)疫苗會保護小鼠免于致命的同亞型和雜亞型病毒攻擊。組a顯示了同源pr8(h1n1)攻擊以后的小鼠體重變化。組b顯示了異源aichi(h3n2)攻擊以后的小鼠存活。圖30的圖表明，m2ko(δtm)疫苗會控制呼吸道中的攻擊病毒復制。組a顯示了pr8(h1n1)攻擊以后的病毒滴度。組b顯示了aichi(h3n2)攻擊以后的病毒滴度。圖31的圖顯示了血清中針對m2ko(δtm)疫苗的抗體應答的動力學。圖32的圖顯示了血清和呼吸道中針對m2ko(δtm)疫苗的粘膜抗體應答。圖33的圖顯示了小鼠中響應于m2ko(δtm)疫苗的抗-haigg的動力學。圖34a-34c的圖表明，m2ko(δtm)疫苗會誘導與和ivr-147類似的免疫應答。圖34a顯示了施用h3、m2ko(δtm)h3、ivr-147和pbs的動物中的血清病毒滴度。圖34b顯示了施用h3、m2ko(δtm)h3、ivr-147和pbs的動物中的肺洗液病毒滴度。圖34c顯示了施用h3、m2ko(δtm)h3、ivr-147和pbs的動物中的鼻甲病毒滴度。圖35a-35b的圖表明，m2ko(δtm)疫苗會保護免于aichi攻擊。圖35a顯示了施用h3、m2ko(δtm)h3、ivr-147和pbs的動物在aichi攻擊以后的體重減輕。圖35b顯示了施用h3、m2ko(δtm)h3、ivr-147和pbs的動物在aichi攻擊以后的存活百分比。圖36的圖表明，h5n1m2ko(δtm)疫苗會引起針對ha的igg抗體滴度。圖37的圖顯示了施用m2ko(δtm)ca07、wtca07和ca07疫苗以后的體重。圖38的圖表明，m2ko(δtm)病毒不會在小鼠的呼吸道中復制。圖39的圖表明，m2ko(δtm)疫苗表現出快速的抗體動力學。圖40的圖表明，m2ko(δtm)疫苗會保護免于h3n2病毒、a/aichi/2/1968的異源攻擊。圖41的圖表明，m2ko(δtm)疫苗會激發在攻擊后恢復的細胞應答。圖42的圖表明，m2ko(δtm)病毒會產生與m2的野生型病毒類似的mrna水平。圖43的瓊脂糖凝膠顯示了pcmv-pr8-m2表達質粒的限制酶切消化。泳道1和5；1kbdna梯型劑(promega，madison，wi，usa)，泳道2-4；ecor1消化的pcmlv-pr8-m2:0.375μg(泳道2)、0.75μg(泳道3)和1.5μg(泳道4)。圖44a-44d的圖顯示了pcmv-pr8-m2與流感m2基因的開放讀碼框的序列比對。圖44a-44d按出現順序分別示出了seqidno.29-seqidno.33。圖45的圖顯示了雪貂呼吸道中的m2ko(δtm)和病毒復制。圖46的圖顯示了用a/布里斯班/10/2007(h3n2)病毒鼻內攻擊以后鼻洗液中的m2ko(δtm)和病毒滴度。圖47的圖顯示了僅用m2ko(δtm)和激發組疫苗接種以后雪貂中的igg滴度。圖48的圖顯示了用m2ko(δtm)和激發-加強組疫苗接種以后雪貂中的igg滴度。圖49的圖顯示了從用m2ko(δtm)或疫苗接種至攻擊后，雪貂血清中的elisaigg滴度的總結。圖50的圖顯示了傳播研究中得自雪貂的鼻洗液中的病毒滴度。m2ko(δtm)病毒沒有傳播(沒有檢測到病毒)，而對照布里斯班(brisb)/10病毒確實傳播。圖51的圖顯示了用a/加利福尼亞、a/珀斯(perth)和b/布里斯班(brisbane)病毒鼻內地(in)、肌肉內地(im)和真皮內地(idfgn)接種疫苗的受試者中的igg滴度。圖52的圖顯示了肌肉內地(im)或真皮內地(idfgn)施用激發劑量或激發和加強劑量的a/珀斯(h3n2)疫苗的受試者中的igg滴度。圖53的圖顯示了在接種后0、30和60天在通過肌肉內(im)和真皮內(id)遞送接種flulaval:a/加利福尼亞/7/2009nymcx-181、a/維多利亞/210/2009nymcx-187(a/珀斯/16/2009-樣病毒)和b/布里斯班/60/2008的豚鼠中的病毒滴度。圖54的圖顯示了免疫接種越南/1203/2004病毒以后5個月攻擊的、h5n1m2ko(δtm)接種疫苗的受試者的存活百分比。圖55的圖顯示了免疫接種越南/1203/2004病毒以后4周攻擊的、h5n1m2ko(δtm)接種疫苗的受試者的存活百分比。具體實施方式i.定義在本文中使用以下術語，提供所述術語的定義用于引導。除非明確地闡明僅表示單數，否則本文中使用的單數形式“一個”、“一種”和“所述”表示單數和復數。術語“約”和一般范圍的應用(不論是否用術語約限定)是指，包括的數字不限于在本文中闡述確切數字，且意圖表示在不脫離本發明的范圍的情況下基本上在舉例的范圍內的范圍。本文中使用的“約”會被本領域的普通技術人員理解，且在一定程度上隨它所應用的上下文而變化。如果本領域的普通技術人員在它所應用的上下文下不清楚該術語的應用，“約”是指特定術語的至多加或減10％。本文中使用的“受試者”和“患者”互換使用，且表示動物，例如，任意脊椎動物物種的成員。本文公開的主題的方法和組合物對于溫血脊椎動物(包括哺乳動物和禽類)而言是特別有用的。示例性的受試者可以包括：哺乳動物諸如人類，以及由于將要絕種而重要的、經濟上重要的(在農場中飼養的動物，用于人類消費)和/或對于人類在社會上重要的(作為寵物或在動物園中飼養的動物)哺乳動物和禽類。在某些實施方案中，所述受試者是人。在某些實施方案中，所述受試者不是人。本文中使用的術語“有效量”或“治療有效量”或“藥學有效量”表示，足以實現期望的治療和/或預防效果的量，例如，導致疾病、病癥和/或其征狀的預防的量。在治療或預防應用的背景下，施用給受試者的組合物的量將取決于疾病的類型和嚴重程度以及個體的特征，諸如一般健康、年齡、性別、體重和對組合物藥物的耐受性。還將取決于疾病或病癥的程度、嚴重程度和類型。技術人員將能夠根據這些和其它因素確定適當的劑量。在某些實施方案中，施用多次劑量。額外地或可替換地，在某些實施方案中，施用多個治療組合物或化合物(例如，免疫原性組合物，諸如疫苗)。本文中使用的術語“分離的”和/或“純化的”表示核酸(例如，載體或質粒)、多肽、病毒或細胞的體外制備、分離和/或純化，使得它不伴有不希望的體內物質，或者從通常與其一起存在的不希望的體內物質中基本上純化。例如，在某些實施方案中，通過體外培養和繁殖得到分離的病毒制品，且其基本上不含有其它感染性病原體。本文中使用的“基本上不含有”是指，使用該化合物或試劑的標準檢測方法，低于特定化合物(諸如不希望的核酸、蛋白、細胞、病毒、感染性病原體等)的檢測水平。本文中使用的術語“重組病毒”表示這樣的病毒：其已經經過體外操作(例如，使用重組核酸技術)，以將變化引入病毒基因組和/或以將變化引入病毒蛋白。例如，在某些實施方案中，重組病毒可以包括野生型、內源、核酸序列和突變體和/或外源核酸序列。額外地或可替換地，在某些實施方案中，重組病毒可以包括修飾的蛋白組分，諸如突變體或變體基質、血凝素、神經氨酸酶、核蛋白、非結構蛋白和/或聚合酶蛋白。本文中使用的術語“重組細胞”或“修飾的細胞”表示這樣的細胞：其已經經過體外操作(例如，使用重組核酸技術)，以將核酸引入細胞中和/或以修飾細胞的核酸。重組細胞的例子包括：攜帶外源性質粒、表達載體等的原核或真核細胞，和/或包括對它們的細胞核酸的修飾(例如，在細胞基因組中的置換、突變、插入、缺失等)的細胞。一種示例性的重組細胞是，已經經過體外操作以表達外源性蛋白(諸如病毒m2蛋白)的細胞。本文中使用的術語“突變體”、“突變”、和“變體”互換使用，且表示與野生型序列不同的核酸或多肽序列。在某些實施方案中，突變體或變體序列是天然存在的。在其它實施方案中，重組地和/或化學地引入突變體或變體序列。在某些實施方案中，核酸突變包括：對rna和/或dna序列的修飾(例如，添加、缺失、置換)。在某些實施方案中，稀釋包括化學修飾(例如，甲基化)，且也可以包括天然的和/或非天然的核苷酸的置換或添加。核酸突變可以是沉默突變(例如，一個或多個核酸變化，其編碼與野生型序列相同的氨基酸)，或者可以導致編碼的氨基酸的變化，產生終止密碼子，或者可以引入剪接缺陷或剪接改變。對編碼序列的核酸突變也可以導致保守的或非保守的氨基酸變化。本文中使用的術語“vrna”表示這樣的rna：其包含病毒基因組，包括分段的或未分段的病毒基因組，以及正鏈和負鏈病毒基因組。vrna可以是完全內源的和“野生型”，和/或可以包括重組體和/或突變體序列。本文中使用的術語“宿主細胞”表示，諸如病毒等病原體可以在其中復制的細胞。在某些實施方案中，宿主細胞是體外培養的細胞(例如，cho細胞、vero細胞、mdck細胞等)。額外地或可替換地，在某些實施方案中，宿主細胞是體內的(例如，被感染的脊椎動物諸如禽或哺乳動物的細胞)。在某些實施方案中，可以修飾宿主細胞，例如，以增強病毒生產，諸如通過增強宿主細胞的病毒感染，和/或通過增強病毒的生長速率。作為例子，但是不作為限制，示例性的宿主細胞修飾包括：在宿主細胞的細胞表面上重組表達2-6-連接的唾液酸受體，和/或在已經被造成病原體或病毒缺失或無效的宿主細胞中重組表達蛋白。本文中使用的術語“感染”表示，攜帶疾病或病原體，諸如病毒。感染可以是故意的，諸如通過施用病毒或病原體(例如，通過疫苗接種)，或非故意的，諸如通過病原體從一個生物體向另一個生物體的自然轉移，或從被污染的表面向生物體的自然轉移。如本文中使用的，與病毒結合使用的術語“減毒的”表示這樣的病毒：其與未減毒的相應物相比具有降低的毒力或致病性，但是仍然是可存活的或活的。通常，與未減毒病毒相比，減毒會使得感染性病原體(諸如病毒)對受感染的受試者的有害性或毒力更低。這不同于殺死的或完全滅活的病毒。如本文中使用的，與病毒結合使用的術語“型”和“株”互換使用，且用于泛指具有不同特征的病毒。例如，甲型流感病毒是與乙型流感病毒不同類型的病毒。同樣地，甲型流感h1n1是與甲型流感h2n1、h2n2和h3n2不同類型的病毒。額外地或可替換地，在某些實施方案中，可以將不同類型的病毒(諸如甲型流感h2n1、h2n2和h3n2)稱作“亞型”。本文中使用的“m2ko”或“m2ko(δtm)”表示seqidno:1、含有seqidno:1的病毒、或包含含有seqidno:1的病毒的疫苗，取決于它所應用的上下文。例如，在描述本文中證實的m2基因的突變時，“m2ko”或“m2ko(δtm)”表示seqidno:1。在描述疫苗的病毒組分時，“m2ko”或“m2ko(δtm)”表示這樣的重組流感病毒：其具有pr8的內部6個基因(核蛋白(np)、聚合酶基因(pa、pb1、pb2)、非結構(ns)、基質(m))，但是其不表達功能性m2蛋白。在描述疫苗時，“m2ko”或“m2ko(δtm)”表示包含m2ko(δtm)重組病毒的疫苗。本文中使用的“m2ko(δtm)病毒”包括這樣的重組流感病毒：其具有pr8的內部6個基因(核蛋白(np)、聚合酶基因(pa、pb1、pb2)、非結構(ns)、基質(m))，但是其不表達功能性m2蛋白，無論是單獨的還是與其它病毒組分和/或編碼其它病毒組分的基因相組合。在某些實施方案中，所述m2ko(δtm)病毒包含其它流感病毒的基因。在某些實施方案中，所述病毒包含甲型流感/布里斯班/10/2007-樣a/烏拉圭/716/2007(h3n2)的ha和na基因。在某些實施方案中，所述m2ko(δtm)病毒包含a/越南/1203/2004(h5n1)病毒的ha和na基因。在某些實施方案中，所述m2ko(δtm)病毒包含a/加利福尼亞/07/2009(ca07)(h1n1pdm)病毒的ha和na基因。ii.甲型流感病毒a.概述流感是美國成年人死亡的主要原因。流感的致病菌是正粘病毒科的病毒，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，其中甲型流感是在人類中最常見的和最有毒的。甲型流感病毒是有包膜的負鏈rna病毒。甲型流感病毒的基因組被包含在8個單獨的(未成對的)rna鏈上，其補體編碼11種蛋白(ha、na、np、m1、m2、ns1、nep、pa、pb1、pb1-f2、pb2)。總基因組大小為約14，000個堿基。該基因組的分段性質允許在細胞同居過程中在不同病毒株之間交換整個基因。8個rna區段如下。1)ha編碼血凝素(需要約500個血凝素分子才能構成1個病毒粒子)；2)na編碼神經氨酸酶(需要約100個神經氨酸酶分子才能構成1個病毒粒子)；3)np編碼核蛋白；4)m使用得自相同rna區段的不同讀碼框編碼2種蛋白(m1和m2)(需要約3000個m1分子才能構成1個病毒粒子)；5)ns使用得自相同rna區段的不同讀碼框編碼2種蛋白(ns1和nep)；6)pa編碼rna聚合酶；7)pb1使用得自相同rna區段的不同讀碼框編碼rna聚合酶和pb1-f2蛋白(誘導細胞凋亡)；8)pb2編碼rna聚合酶。存在幾種甲型流感亞型，它們根據h數目(對于血凝素型)和n數目(對于神經氨酸酶型)命名。目前，存在16種不同的已知h抗原(h1至h16)和9種不同的已知n抗原(n1至n9)。每個病毒亞型已經突變成具有不同致病特性的多種株；一些對一個物種是致病性的，但是其它不是致病性的，一些對多個物種是致病性的。已經在人類中證實的示例性的甲型流感病毒亞型包括、但不限于：h1n1，其造成“西班牙流感”和2009年的豬流感爆發；h2n2，其造成二十世紀50年代后期的“亞洲流感”；h3n2，其造成二十世紀60年代后期的香港流感；h5n1，通過它在2000年中期的傳播，造成全球流感大范圍流行威脅；h7n7；h1n2，其目前在人類和豬中流行；和h9n2，h7n2，h7n3，h5n2，h10n7。鑒定了一些甲型流感變體，并如下命名：根據它們的最類似的已知分離物，且因而假定共享譜系(例如，福建流感病毒-樣)；根據它們的典型宿主(例如人流感病毒)；根據它們的亞型(例如h3n2)；和根據它們的致病性(例如lp，低致病性的)。因而，與分離物a/福建/411/2002(h3n2)類似的病毒引起的流感可以被稱作福建流感、人流感和h3n2流感。另外，有時根據所述株在其中流行或適應的物種(宿主)來命名流感變體。使用該慣例命名的主要變體是：禽流感、人流感、豬流感、馬流感和犬流感。還已經根據它們在家禽(特別是雞)中的致病性來命名變體，例如，低致病性的禽流感(lpai)和高致病性的禽流感(hpai)。b.生命周期和結構流感病毒的生命周期通常包括：與細胞表面受體結合，進入細胞和病毒核酸脫殼，隨后病毒基因在細胞內復制。合成病毒蛋白和基因的新拷貝以后，這些組分裝配成后代病毒顆粒，所述顆粒隨后離開細胞。不同的病毒蛋白在這些步驟的各步中起作用。甲型流感顆粒由包囊病毒核心的脂質包膜構成。包膜的內側襯有基質蛋白(m1)，而外表面的特征在于2類糖蛋白刺突：血凝素(ha)和神經氨酸酶(na)。m2(一種跨膜離子通道蛋白)也是脂質包膜的一部分。參見例如，圖1。ha蛋白(一種三聚體i型膜蛋白)負責結合宿主細胞表面糖蛋白或糖脂上的唾液酸寡糖(含有與半乳糖連接的末端唾液酸的寡糖)。該蛋白也負責在通過胞吞而內化病毒粒子以后病毒和宿主細胞膜之間的融合。神經氨酸酶(na)(一種四聚體ii型膜蛋白)是從宿主細胞與ha和na的糖綴合物切割末端唾液酸殘基的唾液酸酶，且因而被公認為受體破壞酶。該唾液酸酶活性是后代病毒粒子從宿主細胞表面的有效釋放以及后代聚集的阻止(由于病毒的ha與其它糖蛋白的結合活性)所必需的。因而，ha的受體結合活性和na的受體破壞活性可能作為抗衡起作用，從而允許流感的有效復制。基因組區段被包裝進病毒顆粒的核心。rnp(rna+核蛋白，np)是呈螺旋形式，3個病毒聚合酶多肽與每個區段結合。流感病毒生命周期起始于ha與宿主細胞表面上的含唾液酸受體的結合，其后是受體介導的胞吞。圖1。晚期核內體的低ph會觸發ha的構象轉換，由此暴露出ha2亞基的n端(所謂的融合肽)。融合肽啟動病毒和胞內體膜的融合，并且基質蛋白(m1)和rnp復合物釋放到細胞質內。rnp由將vrna殼體化的核蛋白(np)以及由pa、pb1和pb2蛋白形成的病毒聚合酶復合物組成。rnp被轉運到細胞核中，在此發生轉錄和復制。rna聚合酶復合物催化3個不同的反應：(1)合成具有5′帽和3′聚腺苷酸結構的mrna、(2)合成全長互補rna(crna)，和(3)使用cdna作為模板合成基因組vrna。隨后，將新合成的vrna、np和聚合酶蛋白裝配成rnp，從細胞核輸出，轉運到質膜，在此發生后代病毒顆粒的出芽。神經氨酸酶(na)蛋白如下在感染后期起作用：從唾液酸寡糖除去唾液酸，由此從細胞表面釋放出新裝配的病毒粒子，并阻止病毒顆粒的自我聚集。盡管病毒裝配涉及蛋白-蛋白相互作用和蛋白-vrna相互作用，但是這些相互作用的性質很大程度上還是未知的。c.m2蛋白的作用如上所述，3種蛋白跨病毒膜：血凝素(ha)、神經氨酸酶(na)和m2。ha和na的細胞外結構域(胞外結構域)是高度可變的，而m2的胞外結構域在甲型流感病毒中是基本上不變的。不希望受理論的約束，在甲型流感病毒中，認為m2蛋白(其具有離子通道活性)在病毒生命周期的早期階段在宿主細胞穿透和病毒rna脫殼之間起作用。一旦病毒粒子經過胞吞作用，認為病毒粒子-相關的m2離子通道(一種同源四聚體螺旋束)會允許質子從核內體流到病毒粒子內部，以破壞酸不穩定的m1蛋白-核糖核蛋白復合物(rnp)相互作用，從而促進rnp釋放到細胞質中。另外，在其ha被細胞內切割的某些流感株(例如a/禽瘟疫/rostock/34)中，認為m2離子通道會升高跨高爾基體網絡的ph，從而避免在此隔室中由低ph條件引起的ha的構象變化。還證實了m2跨膜結構域自身可以充當離子通道。認為m2蛋白離子通道活性在流感病毒的生命周期中是必不可少的，因為已經證實，阻斷m2離子通道活性的鹽酸金剛烷胺會抑制病毒復制。但是，尚未直接證實該活性在甲型流感病毒復制中的必要條件。m2蛋白的結構顯示在圖2中。m2蛋白的核酸序列以及m1序列顯示在圖3中。盡管乙型和丙型流感病毒在結構上和在功能上類似于甲型流感病毒，但是存在一些差異。例如，乙型流感病毒沒有具離子通道活性的m2蛋白。相反，nb蛋白(na基因的產物)可能具有離子通道活性，且因而具有甲型流感病毒m2蛋白的類似功能。類似地，丙型流感病毒也沒有具離子通道活性的m2蛋白。但是，丙型流感病毒的cm1蛋白可能具有該活性。iii.m2病毒突變體在一個方面，公開了攜帶突變體m2vrna序列的甲型流感病毒。通常，這樣的突變體不具有m2離子通道活性，表現出減弱的體內生長性能，不可產生感染性后代，且在受感染的受試者中是非致病性的或表現出減少的發病機制。突變體病毒是免疫原性的，并且當用作疫苗時，會提供對抗相應野生型和/或其它致病性病毒的感染的保護。另外，不論使用何種宿主細胞，本文中公開的m2突變體是穩定的，且不會突變以表達功能性的m2多肽。額外地或可替換地，在某些實施方案中，在沒有可檢測地改變它的功能的情況下，產生這些突變體的m1蛋白。在某些實施方案中，攜帶突變體m2核酸序列的病毒不可在宿主細胞中復制，而對應的野生型病毒可以在所述宿主細胞中繁殖。作為例子，但是不作為限制，在某些實施方案中，所述野生型病毒可以在培養的mdck細胞、cho細胞和/或vero細胞中生長、繁殖和復制，而攜帶突變體m2序列的對應病毒不可在相同類型的細胞中生長、繁殖或復制。如上面所指出的，在某些實施方案中，所述m2突變體病毒是穩定的，且不會在宿主細胞中突變或恢復成野生型或編碼功能性m2蛋白的非野生型序列。例如，在某些實施方案中，所述m2突變體病毒可在宿主細胞中穩定2代、3代、5代、10代、12代、15代、20代、25代或超過25代。在某些實施方案中，所述宿主細胞是未修飾的宿主細胞。在其它實施方案中，所述宿主細胞是經修飾的宿主細胞，諸如表達m2蛋白的mdck細胞。在某些實施方案中，所述m2突變體包括一個或多個核酸置換和/或缺失。在某些實施方案中，所述突變局部化在編碼以下的一個或多個的核酸中：m2蛋白的細胞外結構域，m2蛋白的跨膜結構域，和/或m2蛋白的細胞質尾巴。額外地或可替換地，在某些實施方案中，一個或多個核酸突變會產生m2肽的剪接變體、一個或多個終止密碼子和/或一個或多個氨基酸缺失。在某些實施方案中，攜帶突變體m2核酸的病毒產生無功能的m2多肽。在某些實施方案中，攜帶突變體m2核酸的病毒不產生m2多肽。在某些實施方案中，攜帶突變體m2核酸的病毒產生截短的m2多肽。在某些實施方案中，截短的m2多肽具有氨基酸序列mslltevetpirnewgcrcngssd(seqidno:4)。在下面的表1-3中提供了3個示例性的、非限制性的m2病毒突變體(m2-1、m2-2和m2-3)。在所述表中，小寫字母對應于m2序列；大寫字母對應于m1序列；用粗體下劃線顯示突變體序列(例如，終止密碼子、剪接缺陷)。m2-2突變體中標有下劃線的(小寫字體)字母指示在m2-1和m2-3突變體中缺失的區域。從該突變體產生的m2多肽序列如下：mslltevetpirnewgcrcngssd.(seqidno:4)。從該突變體沒有產生m2多肽序列。從該突變體沒有產生m2多肽序列。額外地或可替換地，在某些實施方案中，將m2突變引入細胞質尾巴中。圖2。m2蛋白細胞質尾巴是感染性病毒生產的介質。在某些實施方案中，m2細胞質尾巴的截短會導致感染性病毒滴度的下降、包裝的病毒rna的量的減少、芽殖事件的下降和芽殖效率的下降。已經證實，對于基因組包裝而言，5’序列比3’序列更重要，并且較長的5’序列對于基因組包裝而言是較佳的。另外，研究已經證實，核苷酸長度是重要的，但是實際序列不太重要(隨機序列足以產生病毒)。穩定的m2細胞質尾巴突變體的開發已經成為挑戰性的，并且文獻包括突變體恢復的眾多例子。例如，pekosz等人jvi,2005；79(6):3595-3605在氨基酸位置70處用終止密碼子替代2個密碼子，但是病毒不久恢復。另一個示例性的m2細胞質尾巴突變被稱作m2del11。在m2del11突變體中，從細胞質尾巴的羧基末端刪除11個氨基酸殘基。該截短是由于2個終止密碼子的引入，且沒有產生全長m2多肽。盡管該突變體當在表達m2的mdck細胞(m2ck)中傳代時是穩定的，它在正常mdck細胞中的傳代過程中恢復成全長m2(jvirol.200882(5):2486-92)。不希望受理論的約束，恢復可能在mdck細胞的選擇壓力下發生。另一種m2細胞質尾巴突變體m2stop90ala78-81沒有降低病毒滴度，但是ala70-77卻降低(jvi2006；80(16)p8178-8189)。丙氨酸掃描實驗進一步指示，在m2尾巴的位置74-79處的氨基酸在病毒粒子形態發生中起作用，且影響病毒的侵染性(jvirol.200680(11):5233-40)。因此，本文中提供了新穎的細胞質突變體，其具有與上述的那些不同的特征。例如，在某些實施方案中，所述細胞質突變體在mdck細胞中是穩定的(不會恢復成表達全長m2多肽)。在某些實施方案中，所述細胞質突變體在宿主細胞中穩定2代、3代、5代、10代、15代、20代、25代或超過25代。在下面表4中顯示了野生型m2多肽。對于每個序列，粗體文字指示跨膜結構域。細胞外結構域是在前面(左)，繼之以跨膜結構域(中心)和細胞質尾巴序列(右)。制備了m2-4(m2delfg#1)，但是不可在正常mdck細胞中傳代，但是可在修飾的宿主細胞(例如，表達野生型m2多肽的細胞)中傳代。制備了m2-5(m2delfg#2)和m2-6(fg#3)，并在正常mdck細胞中傳代。這些病毒的m基因的核苷酸序列在mdck細胞中至少穩定至第10代。可以繁殖這些突變體，并也在其它細胞中傳代(例如，支持流感復制的細胞)。還發現，這些突變體不是減毒的，且是致病性的。如在下面的實施例中所述，本文描述的m2突變體病毒在雪貂模型中不會在呼吸道中復制或者傳播至其它器官，且不會在雪貂模型中傳播。包含m2突變體的疫苗在哺乳動物中引起穩健的免疫應答，且保護哺乳動物免于流感病毒攻擊。m2ko病毒在小鼠中引起體液和粘膜免疫應答，并且保護小鼠免于致命的同亞型和雜亞型攻擊。如本文中所述的包含m2突變體病毒的疫苗會提供針對流感攻擊的有效保護，且具有在哺乳動物宿主中減毒的優點。這些發現證實，本文描述的m2突變體病毒可用于抗流感疫苗。iv.基于細胞的病毒生產系統a.生產“第一代”突變體病毒通過如neumann等人,generationofinfluenzaavirusesentirelyfromclonecdnas,proc.natl.acad.sci.usa96:9345-9350(1999)(其通過引用整體并入本文)所述的基于質粒的反求遺傳學，可以制備突變體病毒，諸如攜帶突變體m2核酸的那些。簡而言之，用一個或多個編碼8個病毒rna的質粒轉染真核宿主細胞。每個病毒rna序列側接rna聚合酶i啟動子和rna聚合酶i終止子。值得注意的是，編碼m2蛋白的病毒rna包括突變體m2核酸序列。另外用一個或多個編碼病毒蛋白(例如，聚合酶、核蛋白和結構蛋白，包括野生型m2蛋白)的表達質粒轉染宿主細胞。用病毒rna質粒對宿主細胞的轉染會導致所有8個流感病毒rna的合成，其中之一攜帶突變體m2序列。共轉染的病毒聚合酶和核蛋白將病毒rna裝配成功能性的vrnp，后者進行復制和轉錄，最終形成具有突變體m2核酸序列的感染性流感病毒，其仍然具有摻入病毒脂質包膜中的功能性的m2多肽。生產“第一代”突變體病毒的替代方法包括核糖核蛋白(rnp)轉染系統，其允許用體外制備的重組rna分子替代流感病毒基因，如enami和palese,high-efficiencyformationofinfluenzavirustransfectants,j.virol.65(5):2711-2713(其通過引用并入本文)所述。在體外合成病毒rna，并用病毒核蛋白(np)和聚合酶蛋白包被rna轉錄物，所述聚合酶蛋白在轉染的細胞中充當生物活性的rnp，如luytjes等人,amplification,expression,andpackagingofaforeigngenebyinfluenzavirus,cell59:1107-1113(其通過引用并入本文)所證實的。可以將rnp轉染方法分成4個步驟：1)rna的制備：在體外轉錄反應中將編碼流感病毒區段的質粒dna轉錄成負義rna；2)rna的衣殼化：然后將轉錄的rna與分離自破碎的流感病毒的梯度純化的np和聚合酶蛋白混合，以形成生物活性的rnp復合物；3)衣殼化的rna的轉染和援救：將人工核糖核衣殼轉染至預先用輔助流感病毒感染的細胞，所述輔助流感病毒含有得自要援救的rna的不同基因；所述輔助病毒將擴增轉染的rna；4)轉染的基因的選擇：因為輔助病毒和含有援救的基因的轉染子是在培養物上清液中，使用抗體的適當選擇系統是分離攜帶轉染的基因的病毒所必需的。所述選擇系統允許制備具有特定生物和分子特征的新穎轉染子流感病毒。針對靶表面蛋白的抗體選擇然后可以用于陽性或陰性選擇。例如，可以在合適的哺乳動物細胞系中培養含有不表達m2蛋白的m2基因的轉染子或突變體病毒，所述細胞系已經被修飾以穩定地表達野生型功能性m2蛋白。為了防止或抑制表達野生型m2基因、并因此在膜表面處表達m2e蛋白的輔助病毒的復制，可以使用抗m2e的抗體。這樣的抗體是商購可得的，且會抑制輔助病毒的復制，并允許含有突變體m2的轉染子/突變體病毒生長和富集在上清液中。m2e抗體對流感病毒復制的抑制以前已經描述在：influenzaavirusm2protein:monoclonalantibodyrestrictionofvirusgrowthanddetectionofm2invirions,jvirol62:2762-2772(1988)和treanor等人,passivelytransferredmonoclonalantibodytothem2proteininhibitsinfluenzaavirusreplicationinmice,j.virol.64:1375-1377(1990)。額外地或可替換地，相同的抗體可以用于‘捕獲’輔助病毒，并允許富集轉染子。例如，可以用抗體包被組織培養皿的底部，或者可以用在柱矩陣中，以允許富集上清液或洗脫液中的轉染子。通過有限稀釋可以在多孔平板內的表達m2的細胞中培養轉染子病毒，然后鑒別和克隆，例如，通過制備復制平板。例如，含有培養的病毒的多孔板的給定孔的一半等分試樣可以用于感染mdck細胞，并可以用另一半感染表達m2蛋白的mdck細胞。轉染子病毒和輔助病毒都會在表達m2蛋白的mdck細胞中生長。但是，僅輔助病毒會在標準的mdck細胞中生長，從而允許鑒別多孔板中含有轉染子的孔。可以在表達m2蛋白的細胞中進一步噬斑純化轉染子病毒。b.繁殖病毒突變體在某些實施方案中，在宿主細胞中維持和傳代本文描述的病毒突變體。作為例子，但是不作為限制，適合用于培養流感病毒突變體(諸如甲型流感病毒突變體)的示例性宿主細胞包括任意數目的真核細胞，包括、但不限于madin-darby犬腎細胞(mdck細胞)、猿猴細胞諸如非洲綠猴細胞(例如，vero細胞)、cv-1細胞和恒河猴腎細胞(例如，llcomk.2細胞)、牛細胞(例如，mdbk細胞)、豬細胞、雪貂細胞(例如，貂肺細胞)bk-1細胞、嚙齒動物細胞(例如，中國倉鼠卵巢細胞)、人細胞例如胚胎人視網膜細胞(例如，)、293t人胚胎腎細胞和禽細胞(包括胚胎成纖維細胞)。額外地或可替換地，在某些實施方案中，修飾真核宿主細胞以增加病毒生產，例如，通過增加宿主細胞的病毒感染和/或通過增加病毒生長速率。例如，在某些實施方案中，修飾宿主細胞以在細胞表面上表達2,6-連接的唾液酸或增加其表達，從而允許突變型或野生型甲型流感病毒對這些細胞的更高效和有效的感染。參見例如，美國專利公開號2010-0021499和美國專利號7,176,021，通過引用整體并入本文。因而，在某些示例性實施方案中，使用被修飾成表達2,6-唾液酸轉移酶基因(st6gal1)的至少1個拷貝的中國倉鼠卵巢細胞(cho細胞)和/或vero細胞。作為例子，但是不作為限制，由登錄號bc040009.1表示的智人st6β-galatosamideα-2,6-唾液酸轉移酶基因序列是可以摻入cho細胞中并由cho細胞表達的st6gal基因的一個例子。可以將編碼功能性的st6gali基因產物的多核苷酸的一個或多個拷貝工程構建進細胞中。也就是說，可以使用已經被穩定地轉化以表達st6gali基因的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或超過12個拷貝的細胞。單個表達盒可以包括要表達的st6gali基因的一個或多個拷貝，其可操作地連接至調節元件，諸如啟動子、增強子和終止子和聚腺苷酰化信號序列，以促進st6gali基因或它的拷貝的表達。可替換地，可以將單個表達盒工程改造成表達st6gali基因的1個拷貝，并將多個表達盒整合進宿主細胞基因組中。因此，在某些實施方案中，將至少一個st6gali基因整合進宿主細胞的基因組中，使得所述細胞表達st6gali基因和它的酶蛋白產物。取決于拷貝數，單個宿主細胞可以表達許多功能性的st6gali基因蛋白。對于克隆、轉染和生產穩定的經修飾的細胞系而言合適的載體是本領域眾所周知的。一個非限制性例子包括pcdna3.1載體(invitrogen)。額外地或可替換地，在某些實施方案中，修飾真核宿主細胞以生產野生型形式的突變體病毒基因，由此將所述基因反向提供給病毒。例如，當在生產野生型m2蛋白的宿主細胞中傳代時，攜帶突變體m2蛋白的病毒株可以表現出增加的生長速率(例如，更大的病毒生產)。在某些實施方案中，攜帶突變體m2蛋白的病毒株可能不會在不表達野生型m2基因的細胞中生長或復制。另外，這樣的宿主細胞可能減慢或阻止病毒恢復成功能性的m2序列，因為，例如，在這樣的宿主中不存在恢復的選擇壓力。用于生產表達載體和經修飾的宿主細胞的方法是本領域眾所周知的。例如，通過將下面的m2核酸序列(m2orf序列；這是“野生型”m2的起始密碼子至終止密碼子(表5))放置在真核表達載體中，可以制備m2表達載體。然后可以通過本領域已知的方法，例如，使用商購可得的試劑和試劑盒，諸如lt1(mirusbio,madison,wi)，轉染宿主細胞(例如，mdck細胞)。作為例子，但是不作為限制，可以如下選擇細胞并針對m2表達進行試驗：通過用可檢測的標志物或選擇標記(例如，潮霉素抗性)共轉染，和/或通過例如使用m2抗體用間接免疫染色法進行篩選。通過間接免疫染色法、流式細胞計量術或elisa，可以確定m2表達。作為例子，但是不作為限制，分別在補充了10％胎牛血清的dulbecco氏改良的伊格爾培養基中和在含有5％新生小牛血清的最低必需培養基(mem)中，維持293t人胚胎腎細胞和madin-darby犬腎(mdck)細胞。在37℃在5％co2中維持所有細胞。通過用含有潮霉素抗性基因的質粒prhyg和表達全長m2蛋白的質粒pcaggs/m2以1:1的比例共轉染，建立穩定地表達得自a/puertorico/8/34(h1n1)的m2蛋白的潮霉素抗性的mdck細胞。通過使用抗-m2(14c2)單克隆抗體用間接免疫染色法進行篩選(iwatsuki等人,jvi,2006,第80卷,第1期,第5233-5240頁)，在含有0.15mg/ml潮霉素(roche,mannheim,德國)的培養基中選擇表達m2的穩定mdck細胞克隆(m2ck)。在補充了10％胎牛血清和0.15mg/ml潮霉素的mem中培養m2ck細胞。在m2ck細胞中，m2的表達水平和局部化類似于在病毒感染的細胞中的那些(數據未顯示)。以類似的方式可以制備表達m2的vero細胞。在某些實施方案中，通過本領域眾所周知的方法，培養和繁殖細胞和病毒突變體。作為例子，但是不作為限制，在某些實施方案中，在有補充了10％胎牛血清的mem存在下，培養宿主細胞。通過用pbs洗滌，然后在37℃吸附病毒，以0.001的moi感染表達m2的細胞。在某些實施方案中，加入含有胰蛋白酶/tpck的病毒生長培養基，并將細胞溫育2-3天，直到觀察到細胞病變效應。與這些系一起，已經為哺乳動物細胞(有或沒有病毒)開發了一次用棄的生物反應器系統，其益處包括更快的設備安裝和減少的交叉污染的風險。例如，可以在一次用棄的袋中培養本文描述的細胞，所述袋例如得自stedim,bioeaze的袋、得自safcbiosciences的袋、得自cellexusbiosytems的hybridbagtm、或得自hyclone的一次性使用的生物反應器或得自lonza的celltainer。生物反應器可以是1l、10l、50l、250l、1000l尺寸形式。在某些實施方案中，在經過優化的不含動物產品的無血清培養基中懸浮維持細胞。所述系統可以是：補料分批系統，其中可以在例如1l至10l的單個袋中擴增培養物；或灌注系統，其允許恒定地供給營養物，并同時避免潛在有毒副產物在培養基中的積累。為了長期貯存，可以將突變體病毒作為冷凍儲備物進行儲存。v.疫苗和施用方法a.免疫原性組合物/疫苗從本文中公開的基于細胞的病毒生產系統，可以制備多種不同類型的疫苗。本公開內容包括、但不限于：活減毒病毒疫苗、滅活的病毒疫苗、全病毒疫苗、裂解的病毒疫苗、病毒體病毒疫苗、病毒表面抗原疫苗和它們的組合的制備和生產。因而，存在眾多能夠產生對不同流感病毒特異性的保護性免疫應答的疫苗，其中這些疫苗類型中的任一種的適當制劑能夠產生免疫應答，例如，全身性免疫應答。活減毒病毒疫苗具有也能夠刺激呼吸道中的局部粘膜免疫的優點。在某些實施方案中，在本文描述的組合物中使用的疫苗抗原是“直接”抗原，即它們不是作為dna施用，而是抗原本身。這樣的疫苗可以包括全病毒或病毒的僅一部分，例如，但不限于病毒多糖，無論它們是單獨的還是與載體元件綴合，所述載體元件例如載體蛋白、活的減毒的完整微生物、滅活的微生物、重組肽和蛋白、糖蛋白、糖脂、脂肽、合成肽或裂解的微生物，在疫苗的情況下，被稱作“裂解”疫苗。在某些實施方案中，提供了全病毒粒子疫苗。可以通過超濾濃縮全病毒粒子疫苗，然后通過區帶離心或通過色譜法進行純化。通常，在純化之前或之后，使用例如福爾馬林或β-丙內酯滅活病毒粒子。在某些實施方案中，提供了包含純化的糖蛋白的亞單位疫苗。可如下制備這樣的疫苗：使用經去污劑處理而片段化的病毒混懸液，通過例如超速離心而純化表面抗原。因此，亞單位疫苗主要含有ha蛋白，也含有na。所用的去污劑可以是：陽離子去污劑，例如十六烷基三甲基溴化銨；陰離子去污劑，例如脫氧膽酸銨；或非離子去污劑，例如商品名為tritonx100的去污劑。也可以在用蛋白酶(諸如菠蘿蛋白酶)處理病毒粒子后分離血凝素，然后通過標準方法進行純化。在某些實施方案中，提供了裂解疫苗，其包含已經用溶解脂質的試劑處理過的病毒粒子。可如下制備裂解疫苗：在攪拌下，用脂質溶劑(例如乙醚或氯仿)以及去污劑處理如上獲得的、滅活的或未滅活的純化病毒的水性懸浮液。病毒包膜脂質的溶解會導致病毒顆粒的片段化。回收含裂解疫苗的水相，所述裂解疫苗主要由血凝素和神經氨酸酶(其原有的脂質環境被去除)以及核心或它的降解產物組成。然后，如果之前尚未經過滅活，則將殘留的感染性顆粒滅活。在某些實施方案中，提供了滅活的流感病毒疫苗。在某些實施方案中，通過用已知方法滅活病毒來制備滅活的疫苗，所述方法例如但不限于福爾馬林或β-丙內酯處理。可用于本發明中的滅活疫苗類型可以包括全病毒(wv)疫苗或亞病毒粒子(sv)(裂解)疫苗。wv疫苗含有完整的滅活病毒，而sv疫苗含有用去污劑(其溶解含脂質的病毒包膜)破壞、接著化學滅活殘余病毒的純化病毒。額外地或可替換地，在某些實施方案中，提供了活的減毒的流感病毒疫苗。根據已知方法步驟，這樣的疫苗可以用于預防或治療流感病毒感染。在某些實施方案中，根據已知方法(參見，例如，murphy,infect.dis.clin.pract.2,174(1993))，通過將得自減毒供體病毒的減毒基因轉移到分離物或重配的病毒，在單個步驟中實現減毒。在某些實施方案中，通過一個或多個病毒核酸序列的突變而使病毒減毒，從而產生突變體病毒。例如，在某些實施方案中，所述突變體病毒核酸序列編碼有缺陷的蛋白產物。在某些實施方案中，所述蛋白產物具有減少的功能或沒有功能。在其它實施方案中，不從突變體病毒核酸生產蛋白產物。因此，可根據已知方法將所述病毒減毒或滅活、配制并作為免疫原性組合物(例如，作為疫苗)施用，以在動物(例如，禽和/或哺乳動物)中誘導免疫應答。用于確定這樣的減毒或滅活疫苗是否維持與臨床分離物或由其衍生的高生長株相似的抗原性的方法是本領域眾所周知的。這樣的已知方法包括：利用抗血清或抗體消除表達供體病毒的抗原決定簇的病毒；化學選擇(例如金剛烷胺或金剛乙胺)；ha和na活性和抑制；以及dna篩選(諸如探針雜交或pcr)，以證實在減毒病毒中不存在編碼所述抗原決定簇的供體基因(例如，ha或na基因)或其它突變體序列(例如，m2)。參見，例如，robertson等人,giornalediigieneemedicinapreventiva,29,4(1988)；kilbourne,bull.m2worldhealthorg.,41,643(1969)；和robertson等人,biologicals,20,213(1992)。在某些實施方案中，所述疫苗包括不表達功能性m2蛋白的減毒流感病毒。在某些實施方案中，所述突變體病毒在表達m2蛋白的細胞中較好地復制，但是在對應的野生型細胞中，表達病毒蛋白，而不產生感染性的后代病毒粒子。適合用于真皮內施用、接種或胃腸外或口服施用的本發明的藥物組合物包含減毒的或滅活的流感病毒，且可以任選地進一步包含無菌的水性或非水性溶液、混懸液和乳劑。所述組合物可以進一步包含本領域已知的助劑或賦形劑。參見，例如，berkow等人,themerckmanual,第15版,merckandco.,rahway,n.j.(1987)；goodman等人,編,goodmanandgilman'sthepharmacologicalbasisoftherapeutics,第8版,pergamonpress,inc.,elmsford,n.y.(1990)；avery'sdrugtreatment:principlesandpracticeofclinicalpharmacologyandtherapeutics,第3版,adispress,ltd.,williamsandwilkins,baltimore,md.(1987)；和katzung,編,basicandclinicalpharmacology,第5版,appletonandlange,norwalk,conn.(1992)。在某些實施方案中，用于胃腸外施用的制劑包括無菌的水性或非水性溶液、混懸液和/或乳劑，其可含有本領域已知的助劑或賦形劑。非水性溶劑的例子為丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄欖油)以及可注射的有機酯(例如油酸乙酯)。載體或封閉敷料可用于增加皮膚透過性并增強抗原吸收。用于口服施用的液體劑型通常可以包括含有脂質體溶液的液體劑型。適合用于懸浮脂質體的形式包括乳劑、混懸液、溶液、糖漿劑和酏劑，其含有本領域常用的惰性稀釋劑，例如凈化水。除了惰性稀釋劑外，這樣的組合物還可以包含佐劑、潤濕劑、乳化劑和助懸劑、或者甜味劑、矯味劑或芳香劑。當本發明的組合物用于施用給個體時，其可以進一步包含鹽、緩沖劑、佐劑或對于提高所述組合物的效力而言需要的其它物質。對于疫苗來說，可以使用佐劑，即增強特異性免疫應答的物質。通常，在呈現給免疫系統之前將佐劑和組合物混合在一起，或者分開呈現，但是呈現在待免疫的生物體的相同部位。在某些實施方案中，本文中公開的免疫原性組合物(例如，疫苗)包括多種不同類型的病毒或病毒抗原，其中的至少一種包括突變體m2基因(例如，包含m2ko(δtm)(seqidno:1)突變的病毒)和/或在該病毒的m2功能等效物(例如，乙型流感的nb蛋白，或丙型流感的cm1蛋白)中的對應突變。在其它實施方案中，所述免疫原性組合物包括單一類型的病毒或病毒抗原，其包括突變體m2基因(例如，包含m2ko(δtm)(seqidno:1)突變的病毒)和/或在該病毒的m2功能等效物(例如，乙型流感的nb蛋白，或丙型流感的cm1蛋白)中的對應突變。例如，在某些實施方案中，免疫原性組合物(諸如疫苗組合物)中的主要組分包括：一種或多種甲型、乙型或丙型流感病毒，或它們的任意組合，或得自這些病毒的抗原的任意組合，其中至少一種病毒包括突變體m2基因(例如，包含m2ko(δtm)(seqidno:1)突變的病毒)和/或在該病毒的m2功能等效物(例如，乙型流感的nb蛋白，或丙型流感的cm1蛋白)中的對應突變。例如，在某些實施方案中，在免疫原性組合物(例如，疫苗)中提供3種類型中的至少2種、不同亞型中的至少2種、相同類型中的至少2種、相同亞型中的至少2種、或不同的分離物或重配株。作為例子，但是不作為限制，人甲型流感病毒包括h1n1、h2n2和h3n2亞型。在某些實施方案中，所述免疫原性組合物(例如，疫苗)包括：包含突變體m2基因(例如，包含m2ko(δtm)(seqidno:1)突變的病毒)和/或在該病毒的m2功能等效物(例如，乙型流感的nb蛋白，或丙型流感的cm1蛋白)中的對應突變的病毒，和約0.1-200μg(例如，10-15μg)得自進入所述組合物中的每個病毒株的血凝素。通過混合至少2個流感病毒株(諸如2-50個病毒株或其間的任意范圍或值)的重復流感病毒，可以在疫苗中提供異質性。在某些實施方案中，使用具有現代抗原組成的甲型或乙型流感病毒株。另外，使用本領域已知的技術，可以為單個流感病毒株中的變異提供免疫原性組合物(例如，疫苗)。在某些實施方案中，所述疫苗包含這樣的病毒：其包含m2ko(δtm)(seqidno:1)突變以及其它病毒組分和/或表達其它病毒組分的基因。在某些實施方案中，所述疫苗(例如，包含m2ko(δtm)(seqidno:1)突變的病毒)包含得自其它病毒株的基因，包括、但不限于，例如，得自其它病毒株的ha和na基因。在某些實施方案中，所述疫苗包含得自人甲型流感病毒亞型h5n1、h1n1、h2n2或h3n2的ha和na基因。在某些實施方案中，所述疫苗包含得自例如pr8x布里斯班/10/2007、a/越南/1203/2004或a/加利福尼亞/07/2009(ca07)病毒的ha和na基因。根據本發明的藥物組合物可以進一步或另外包含至少一種化療化合物，例如用于基因治療的免疫抑制劑、抗炎劑或免疫刺激劑，或抗病毒劑，包括、但不限于，γ球蛋白、金剛烷胺、胍、羥基苯并咪唑、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、縮氨基硫脲類、美替沙腙、利福平、利巴韋林、嘧啶類似物、嘌呤類似物、膦甲酸、膦酰基乙酸、阿昔洛韋、二脫氧核苷、蛋白酶抑制劑或更昔洛韋。所述組合物還可含有可變的、但小量的無內毒素的甲醛和防腐劑，其已被發現是安全的，并且在給其施用所述組合物的生物體中不會促成不希望的作用。b.施用通過疫苗常規使用的或推薦的途徑(非腸道途徑、粘膜途徑)中的任一種，可以施用本文中公開的免疫原性組合物(例如，疫苗)，且可以呈不同的形式：可注射的或可噴射的液體，已經冷凍干燥的或通過霧化干燥的或風干的制劑，等。借助于注射器或借助于用于肌肉內、皮下或真皮內注射的無針注射器，可以施用疫苗。還可以借助于能夠將干粉或液體噴霧遞送至粘膜(不論它們是鼻粘膜、肺粘膜、陰道粘膜還是直腸粘膜)的噴霧器來施用疫苗。本文中公開的疫苗可以通過被動免疫接種或者主動免疫接種而賦予針對一種或更多種流感株的抗性。在主動免疫接種中，給宿主(例如哺乳動物)預防性地施用滅活的或減毒的活疫苗組合物，宿主的針對所述施用的免疫應答會保護免于感染和/或疾病。對于被動免疫接種，可以回收激發的抗血清，并將其施用給疑似具有至少一種流感病毒株引起的感染的受體。因此，本發明包括用于預防或緩解疾病或障礙(例如，由至少一種流感病毒株引起的感染)的方法。如本文中使用的，如果疫苗的施用會引起疾病的征狀或病況的全部或部分緩解(即抑制)，或使個體產生針對該疾病的全部或部分免疫，則認為該疫苗會預防或緩解疾病。通過達到預期目的的任何方式，使用如前所述的藥物組合物，可以施用本發明的至少一種滅活的或減毒的流感病毒或其組合物。例如，這樣的組合物的施用可以是通過各種胃腸外途徑，諸如皮下的、靜脈內的、真皮內的、肌肉內的、腹膜內的、鼻內的、口服的或透皮的途徑。可采用快速推注或隨著時間梯度灌注進行胃腸外施用。在某些實施方案中，本文中公開的免疫原性組合物是通過肌肉內或皮下施用。在某些實施方案中，用于預防、抑制或治療流感病毒相關病理的方案包括：施用有效量的如本文中所述的疫苗組合物，其作為單次治療施用，或者在1周至約24個月(包括端值)之間的周期內或者其間的任何范圍或值內作為加強或增強劑量重復施用。在某些實施方案中，每年施用本文中公開的流行性感冒疫苗。根據本發明，疫苗組合物的“有效量”是足以達到期望的生物學效應的量。應當理解，在某些實施方案中，有效劑量將取決于受體的年齡、性別、健康和重量、并行治療的種類(如果有的話)、治療頻率和所期望的作用的性質。下面提供的有效劑量的范圍無意成為限制性的，且代表示例性的劑量范圍。因而，在某些實施方案中，將為個別受試者定制劑量，這是本領域技術人員理解的且可確定的。用于成年哺乳動物(例如，人)的減毒病毒疫苗的劑量可為約約103-107噬斑形成單位(pfu)或其間的任何范圍或值。滅活疫苗的劑量范圍可為約0.1-200(例如，50μg)血凝素蛋白。但是，使用現有疫苗作為起始點，通過常規方法確定，所述劑量應當是安全且有效的量。c.皮內遞送傳統上鼻內遞送活流感疫苗，以模仿天然的感染途徑和促進對天然病毒感染的類似免疫應答。作為一個替代方案，本文中公開了真皮內遞送方法，其包括使用新穎的微型針裝置來利用真皮內遞送的免疫學益處。在某些實施方案中，在用于真皮內施用的疫苗組合物中使用減毒病毒(例如，m2病毒突變體)。在某些實施方案中，在疫苗中提供m2病毒突變體，其不產生感染性后代病毒。因而，基本上消除了野生型循環流感病毒重配的任何潛力。在本文中公開的實施方案中，真皮內遞送(皮內)將疫苗施用至皮膚。在某些實施方案中，使用微型針遞送裝置執行真皮內遞送。如在本文中公開的，皮內遞送具有眾多優點。例如，通過觸發皮膚免疫系統的免疫學潛力，增強疫苗的免疫原性。所述疫苗可直接接近有效的呈遞抗原的皮膚樹突細胞，即，表皮的朗格漢斯細胞和真皮的樹突細胞。皮膚細胞會產生促炎信號，所述信號增強對穿過皮膚引入的抗原的免疫應答。此外，皮膚免疫系統會產生抗原特異性的抗體和細胞免疫應答。考慮到上述因素，當皮內遞送時，真皮內遞送允許疫苗劑量減小，即，更低劑量的抗原可能是有效的。并且，因為通過所述裝置的微型針陣列將疫苗遞送至皮膚，會減少非故意的針刺風險，與使用常規針和注射器的肌肉內注射相比，經由微型針陣列的皮內疫苗遞送是相對無痛的。微型針裝置是本領域已知的，包括、例如，在公開的美國專利申請2012/0109066、2011/0172645、2011/0172639、2011/0172638、2011/0172637和2011/0172609中描述的那些。微型針裝置可以例如如下制成：通過濕法蝕刻從不銹鋼片(例如，trinitybrandindustries,georgia；ss304；50μm厚)制造。在某些實施方案中，單個微型針具有約500μm至1000μm(例如，約750μm)的長度和約100μm至500μm(例如，約200μm)的寬度。然后可以將疫苗作為涂層施加于微型針。作為例子，但是不作為限制，涂層溶液可以包括1％(w/v)羧甲基纖維素鈉鹽(低粘度，美國藥典級；carbo-mer,sandiegoca)、0.5％(w/v)lutrolf-68nf(basf,mt.olive,nj)和抗原(例如，5ng/ml的可溶性的ha蛋白；活的減毒病毒諸如本文描述的m2突變體病毒等)。為了達到更高的疫苗濃度，可以將涂層溶液在室溫(～23℃)蒸發5-10分鐘。可以通過浸漬涂布法執行涂布。可以如下確定每行微型針的疫苗的量：將微型針浸沒在200μl磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中5分鐘，并通過本領域已知的方法測定抗原。在某些實施方案中，使用主要由聚丙烯和不銹鋼粗切割(first-cut)塊制成的微型針裝置，所述塊用簡單的搭扣配合和熱封配合在一起。在某些實施方案中，所述裝置是完全自含式的，且包括疫苗、泵機構、活化機構和微型針單元。這些組分被隱藏在塑料罩內。利用所述裝置，通過按壓致動按鈕來啟動疫苗輸注。按壓所述按鈕會同時將微型針插入皮膚中，并啟動泵送機構，后者在主要藥物容器上施加壓力。當彈簧機構在疫苗蓄池上施加足夠的壓力時，疫苗開始流過微型針陣列并進入皮膚中。在某些實施方案中，在裝置致動以后約2分鐘內完成疫苗劑量的遞送。輸注結束以后，從皮膚輕輕除去裝置。在某些實施方案中，提供了一種使用微型針裝置皮內施用免疫原性組合物(例如，疫苗)的方法。在某些實施方案中，所述微型針裝置包括穿刺機構和免疫原性組合物層，其包括多個能夠刺穿皮膚和允許免疫原性組合物皮內施用的微型針。在某些實施方案中，所述方法包括壓迫所述穿刺機構。在某些實施方案中，所述免疫原性組合物(例如疫苗)包含病毒，所述病毒包含編碼被表達的突變體m2蛋白或不被表達的突變體m2蛋白的核酸序列；其中所述表達的突變體m2蛋白包含seqidno:4的氨基酸序列或由其組成。在某些實施方案中，所述微型針陣列最初位于裝置殼體的內部，并在桿致動后，允許微型針延伸穿過裝置底部并插入皮膚中，由此允許疫苗流體輸注進皮膚中。本文描述的遞送裝置可以用于遞送可能期望的任意物質。在一個實施方案中，要遞送的物質是藥物，且遞送裝置是被構造成給受試者遞送藥物的藥物遞送裝置。本文中使用的術語“藥物”意圖包括為了任何治療、預防或醫學目的而遞送給受試者的任意物質(例如，疫苗、藥物、營養物、營養制品等)。在一個這樣的實施方案中，所述藥物遞送裝置是被構造成給受試者遞送一定劑量的疫苗的疫苗遞送裝置。在一個實施方案中，所述遞送裝置被構造成遞送流感疫苗。在本文中討論的實施方案主要涉及被構造成經皮地遞送物質的裝置。在某些實施方案中，所述裝置可以被構造成將物質直接地遞送至除了皮膚以外的器官。實施例盡管用甲型流感證實了下述實施例，應當理解，本文描述的突變和方法同樣適用于表達m2、m2-樣蛋白或具有與甲型流感m2蛋白相同或類似的功能的蛋白的其它病毒。實施例1：m2病毒突變體的制備如下構建m2突變體。a)m2-1：m2胞外結構域+2個終止密碼子+tm缺失(pr8m區段+2個停止(786-791)沒有792-842(tm))使用如下所示的寡物集合1和寡物集合2，通過pcr從pr8擴增部分野生型m基因。表6寡物集合1acacaccgtctctaggatcgtctttttttcaaatgcatttacc(seqidno:10)cacacacgtctcctattagtagaaacaaggtagttttt(seqidno:11)寡物集合2acacaccgtctcatcctattaatcacttgaaccgttgc(seqidno:12)cacacacgtctccgggagcaaaagcaggtag(seqidno:13)然后用bsmbi消化pcr產物。還用bsmbi消化表達載體(phh21)，并使用t4dna連接酶將消化的pcr產物連接進載體。用該載體轉化大腸桿菌細胞，并在適當的溫育以后，通過本領域已知的方法分離和純化載體。通過核酸測序，表征載體的突變體m2部分。b)m2-2：m2胞外結構域+2個停止+剪接缺陷(pr8m區段+2個停止(786-791)+剪接缺陷核苷酸51)使用下面顯示的引物集合，通過pcr從pr8擴增部分野生型m基因。表7pcr引物5’acacaccgtctccctacgtactctctatcatcccg(seqidno:14)5’cacacacgtctcctattagtagaaacaaggtagttttt(seqidno:15)然后用bsmbi消化pcr產物。還用bsmbi消化表達載體(phh21)。然后通過退火下面顯示的2種核苷酸，制備雙鏈dna片段。表8退火核苷酸5’gggagcaaaagcaggtagatattgaaagatgagtcttctaaccgaggtcgaaac(seqidno:16)5’gtaggtttcgacctcggttagaagactcatctttcaatatctacctgcttttgc(seqidno:17)[0205]然后使用t4dna連接酶連接經消化的載體、pcr產物和雙鏈片段。用該載體轉化大腸桿菌細胞，并在適當的溫育以后，通過本領域已知的方法分離和純化載體。通過核酸測序，表征載體的突變體m2部分。c)m2-3:m2胞外結構域+2個停止+剪接缺陷+tm缺失(pr8m區段+2個停止(786-791)沒有792-842(tm)+剪接缺陷核苷酸51)使用下述引物，通過pcr從pr8擴增部分m2-1突變體(m2胞外結構域+2個終止密碼子+tm缺失(pr8m區段+2個停止(786-791)沒有792-842(tm))：表9pcr引物5’acacaccgtctccctacgtactctctatcatcccg(seqidno:18)5’cacacacgtctcctattagtagaaacaaggtagttttt(seqidno:19)然后用bsmbi消化pcr產物。還用bsmbi消化表達載體(phh21)。然后通過退火下面顯示的2種核苷酸，制備雙鏈dna片段。表10退火核苷酸5’gggagcaaaagcaggtagatattgaaagatgagtcttctaaccgaggtcgaaac(seqidno:20)5’gtaggtttcgacctcggttagaagactcatctttcaatatctacctgcttttgc(seqidno:21)然后使用t4dna連接酶連接經消化的載體、pcr產物和雙鏈片段。用該載體轉化大腸桿菌細胞，并在適當的溫育以后，通過本領域已知的方法分離和純化載體。通過核酸測序，表征載體的突變體m2部分。在表1-3中提供了3種m2突變體構建體中的每一種的序列。實施例2：m2突變體病毒的制備和培養本實施例證實了包含m2ko(δtm)(seqidno:1)突變的pr8病毒的培養。如在neumann等人,generationofinfluenzaavirusesentirelyfromclonecdnas,proc.natl.acad.sci.usa96:9345-9350(1999)中所報道的，經過一些修改，制備突變體病毒。簡而言之，用17種質粒轉染293t細胞：針對8種rna區段的8種poli構建體，其中之一攜帶突變體m2序列；和針對如下5種結構蛋白的9種蛋白表達構建體：np(pcaggs-wsn-np0/14)；m2(pep24c)；pb1(pcdna774)；pb2(pcdna762)；和a/puertorico/8/34(h1n1)病毒的pa(pcdna787)。將質粒與轉染試劑(2μltranslt-1(mirus,madison,wis.)/μgdna)混合，在室溫溫育15-30分鐘，并加入1x106個293t細胞中。48小時后，將上清液中的病毒系列稀釋，并接種進m2ck細胞中。接種后2-4天，將最后稀釋孔(其中細胞表現出明顯的細胞病變效應(cpe))內的上清液中的病毒接種進m2ck細胞，用于生產儲備病毒。將制備的病毒的m基因測序，以證實預期的突變的基因和存在，并確保不存在不希望的突變。如下培養和傳代突變體m2病毒。在有補充了10％胎牛血清的mem存在下，培養m2ck宿主細胞。通過用pbs洗滌，然后在37℃吸附病毒，以0.001的moi感染細胞。加入含有胰蛋白酶/tpck的病毒生長培養基，并將細胞溫育2-3天，直到觀察到細胞病變效應。實施例3：正常細胞中的m2ko復制受限在正常mdck細胞和穩定地表達m2蛋白的mdck細胞(m2ck)中，分析了具有m2ko(δtm)(seqidno:1)突變的pr8病毒和野生型pr8的生長動力學。以10-5的感染復數，用病毒感染細胞。在mdck或m2ck細胞中確定細胞上清液的病毒滴度。野生型pr8在兩種細胞類型中生長至高滴度，而m2ko僅在m2ck細胞中較好地生長，且在mdck細胞中根本不生長(圖4)。實施例4：m2ko病毒在正常細胞中產生病毒抗原，但是不產生m2本實施例證實，具有m2ko(δtm)(seqidno:1)突變的pr8病毒在正常細胞中產生病毒抗原，但是不產生m2蛋白。通過在不含胰蛋白酶(以確保病毒僅完成1個生命周期)的培養基中用野生型pr8或m2ko以0.5的感染復數(moi)感染野生型mdck細胞，評價了病毒蛋白表達。在4-12％sds-page凝膠上分離細胞裂解物中的病毒蛋白，并使用pr8感染的小鼠血清(組a)或抗-m2單克隆抗體(14c2,santacruzbiotechnology)(組b)通過蛋白質印跡進行檢測。圖5中的組a表明，針對pr8的抗血清檢測到pr8和m2ko的類似蛋白表達水平。當用抗-m2單克隆抗體探測裂解物時(組b)，僅在pr8感染的細胞中檢測到m2表達，在m2ko中未檢測到。這些結果指示，m2ko病毒以與pr8病毒類似的水平表達除了m2蛋白以外的所有病毒蛋白(圖5)。實施例5：m2突變體是體內減毒的進行一項實驗來證實，m2突變體病毒是體內減毒的。給6周齡balb/c雌性小鼠(23只/組)鼻內地接種下述突變體之一：如在j.virol(2009)83:5947-5950中描述的m2ko(yk)；m2-1(tmdelm2koakam2ko(δtm))和m2-2(splicedefm2ko)(共同地稱作“m2ko變體”)。以1.2x104pfu/小鼠的劑量施用突變體。給對照組的小鼠施用pbs。接種后針對體重的任何變化和感染征狀觀察小鼠14天。另外，接種后3天以后，從每組3只小鼠的肺和鼻甲(nt)獲取病毒滴度。如圖6所示，接種m2ko變體和pbs的小鼠在14天時段內沒有表現出感染的任何臨床癥狀，也沒有減輕任何體重。在14天時段內，組之間的體重的變化是相當的。另外，在從肺和nt收集的滴度中，沒有檢測到病毒。臨床癥狀的缺乏、體重減輕的缺乏和病毒的缺乏一起指示，m2突變體病毒在小鼠中是減毒的且非致病性的。實施例6：m2突變體誘導針對流感病毒的抗體和保護小鼠免于致命性病毒攻擊還進行試驗以確定得自上面實施例5中描述的小鼠的抗體滴度和在用致命性病毒劑量攻擊以后它們的存活。在接種以后3周采集血清樣品，并通過酶聯免疫吸附測定(elisa)來確定得自血清樣品的抗-病毒igg抗體滴度。體液應答顯示在圖7中，該圖表明，所有3種m2突變體升高了抗-流感病毒抗體，高于pbs對照組。另外，在接種后28天用相同量的m2突變體病毒強化每組內的一半小鼠。然后在第一次接種以后6周收集血清，并確定針對病毒的igg滴度。如圖7b所示，用m2突變體病毒強化的小鼠具有比未強化的小鼠更高水平的抗-流感病毒抗體。在第一次接種以后49天(強化以后3周)，用致死劑量的pr8病毒攻擊小鼠(40只小鼠50％致死劑量(mld50))。如圖8和圖9所示，用m2ko變體接種疫苗的所有小鼠度過了攻擊且沒有減輕重量。但是，僅施用pbs的對照小鼠減輕體重，且沒有活過攻擊日以后8天。在攻擊以后第3天，得到肺和nt，并通過菌斑測定在mdck細胞中確定病毒滴度。如表11中所示，m2ko變體中的肺病毒滴度比原初對照pbs中的滴度低至少1個對數，且在m2ko變體組的鼻甲中幾乎沒有檢測到病毒，但是在原初對照pbs組中檢測到超過100,000pfu/g，這指示，m2突變體疫苗會賦予保護和限制攻擊病毒的復制。表11：攻擊以后小鼠組織中的病毒滴度(log10pfu/g)肺鼻甲m2ko(vk)6.1，5.9，nd1.7，nd，ndm2ko(δtm)5.8±0.252.5，nd，ndm2ko(5plicedef)nd，nd，ndnd，nd，ndpbs7.9±0.275.3±0.55在另一個實驗中，在免疫接種后6周，用同亞型或雜亞型流感病毒攻擊m2ko(δtm)組。用aichi(h3n2)病毒攻擊小鼠，并針對存活評分14天。雜亞型攻擊的結果顯示在圖16中。實施例7：真皮內疫苗遞送進行實驗來證實，真皮內疫苗遞送/免疫會保護受試者免于流感。以每只小鼠1.8x101、1.8x102、1.8x103或1.8x104pfu(50μl)的濃度，給6-7周齡的balb/c雌性小鼠(5只/組)(harlandlaboratories)鼻內地(in)、肌肉內地(im)或真皮內地(id)接種pr8病毒(3.5x107pfu)。還通過3種不同的施用途徑，給對照小鼠施用pbs。接種后監測體重和存活14天。對于小鼠實驗，使用具有真皮內斜角針頭的變態反應注射器。使用常規針頭和注射器，通過肌肉內或皮下注射施用大多數疫苗。但是，最近的研究證實，真皮內疫苗遞送會實現比肌肉內或皮下施用更好的免疫原性。真皮內疫苗接種會將抗原直接地遞送至富集的皮膚免疫系統，且已經被證實對多種疫苗(包括狂犬病、乙型肝炎和流感)而言是有效的。真皮內遞送也可以提供劑量減小，從而使用比肌肉內注射所需更少的疫苗實現相同的免疫應答。用于真皮內遞送(使用常規針頭和注射器)的當前現有技術是芒圖技術，其需要大量訓練，難以執行，且經常導致錯誤方向的(皮下的)或不完全的施用。合適的遞送裝置的缺乏已經阻礙了真皮內疫苗接種研究和產物開發，盡管已經記載了利用該施用途徑的優良免疫應答。如表12所示，in-接種的小鼠會在1.8x103和1.8x104pfu/小鼠的較高劑量發生流感感染，僅在1.8x101的最低劑量具有完全存活。但是，im-和id-接種的小鼠在所有劑量都存活。表13顯示了in-接種組的小鼠的半數致死劑量(mld50)。圖10表明用1.8x104pfu的病毒im-和id-接種的小鼠沒有表現出體重變化，且表明用1.8x104pfu的病毒in-接種的小鼠缺乏存活。在接種后2周(圖11a)和7周(圖11b)收集血清，并評價抗-pr8igg抗體(如通過elisa確定)。“hi”代表1.8x104pfu接種，“lo”代表1.8x101pfu。in-、im-和id-接種的小鼠在兩個時間段的應答是類似的。在每個時間段，in-接種的小鼠呈現最高抗體數目。僅鑒別出用1.8x101pfuin-接種的小鼠(即，“lo”)，因為至該時間，用更高劑量in-接種的小鼠已經死亡。im-和id-接種的小鼠呈現比in-接種的小鼠更低水平的抗體，盡管與僅施用pbs的對照小鼠相比，在更高劑量接種的小鼠表現出更大量的抗體。另外，真皮內施用途徑隨時間產生比肌肉內途徑更多的抗體，如通過圖11b所示的更高滴度水平所證實的。在另一個實驗中，在疫苗接種以后8周，攻擊in-、im-和id-接種的小鼠組(除了1.8x103組的4只小鼠以外，5只小鼠/組)。具體地，攻擊1.8x101in-接種的小鼠、1.8x103im-接種的小鼠、1.8x104im-接種的小鼠、1.8x103id-接種的小鼠和1.8x104id-接種的小鼠。將減輕它們的體重超過25％的小鼠安樂死。如圖12所示，100％的以1.8x103的劑量im-接種的小鼠沒有活過攻擊后8天。所有id-接種的小鼠的存活率是在40％至60％之間。但是，以1.8x104im-接種的小鼠的存活率為100％。圖13表明，id-接種的和im-接種的(1.8x104)小鼠組具有最初的平均重量減輕，但是以相對于攻擊日期的低重量減輕結束。id-接種的小鼠(1.8x104)的評價表明，2只小鼠(在圖14和圖15中的1和5)引起了比其它小鼠更好的免疫應答，且另外沒有發展流感感染的征狀(例如，體重減輕、不光滑的皮毛、安靜等)。但是，在im-接種組(1.8x104)中的所有小鼠表現出一些征狀，且減輕至少10％的體重。實施例8：m2ko變體的穩定性為了試驗m2ko變體的m2基因在野生型細胞中的穩定性，在缺少m2蛋白表達的野生型mdck細胞以及m2ck細胞(其為表達m2蛋白的mdck細胞)中傳代m2ko變體。所有m2ko變體都是可在m2ck細胞中傳代的，在至少第10代之前沒有任何突變。盡管m2-1(tmdelm2ko)、m2-2(splicedefm2ko)和m2-3(tmdel+splicedefm2ko)不能在野生型mdck細胞中傳代(在野生型mdck細胞中沒有觀察到細胞病變效應(cpe))，m2ko(yk)甚至在mdck細胞中第4代以后表現出cpe。從野生型mdck中的m2ko(yk)第4代提取m區段rna，并對cdna測序。如表14所示，編輯了m2ko(yk)的2個插入的終止密碼子，并且野生型mdck中的m2ko(yk)第4代具有全長m2蛋白基因。實施例9：m2ko疫苗接種為了證實m2ko疫苗可以刺激與天然流感感染類似的免疫應答，進行了疫苗實驗。用pr8病毒的低接種物代表天然流感感染，并用通過標準的肌肉內途徑和鼻內途徑遞送的滅活pr8病毒(charlesriver)代表標準的滅活流感疫苗。用鼻內地和肌肉內地遞送的活病毒(10pfupr8)、包含m2ko(δtm)的pr8病毒(104pfu)或1μg滅活的pr8病毒免疫6-7周齡balb/c小鼠。鼻內地施用104個m2ko(δtm)的感染性顆粒的小鼠沒有減輕重量，且沒有表現出感染征象。此外，在接種后3天，用m2ko(δtm)處理的小鼠的肺不含有可檢測的感染性顆粒。在第21天，從免疫小鼠得到血清，并通過標準elisa測定確定針對血凝素的抗體滴度。圖17表明，與滅活的疫苗組相比，抗-haigg滴度在活病毒和m2ko(δtm)組中是最高的。僅在活pr8或m2ko接種疫苗的小鼠的血清中檢測到針對流感的粘膜iga抗體。免疫接種后6周，用同亞型(pr8,h1n1)或雜亞型(aichi,h3n2)流感病毒攻擊所有組。m2ko和滅活的疫苗接種都會保護小鼠免于同亞型病毒感染(圖18)。但是，僅m2ko接種疫苗的小鼠被保護免于雜亞型病毒攻擊(圖19)。用滅活疫苗免疫的小鼠發生與原初小鼠類似的感染。實施例10：m2ko(δtm)病毒不會在呼吸道或其它器官中復制概要-本實施例證實，m2ko(δtm)病毒不會在呼吸道中復制或者在雪貂模型中擴散至其它器官。以1x107tcid50的劑量水平，將m2ko(δtm)病毒鼻內地施用給3只雄性雪貂。作為對照，以1x107tcid50的劑量給第二組3只雄性雪貂鼻內地施用a/布里斯班/10/2007(h3n2)甲型流感病毒。在病毒接種以后，針對死亡率觀察雪貂至接種后第3天，每天測量體重、體溫和臨床征象。在接種后3天，對所有動物進行尸檢。收集器官用于組織病理學和病毒滴度。接受a/布里斯班/10/2007(h3n2)的對照組在接種后2天表現出重量的短暫下降和體溫的升高，這在m2ko(δtm)組中沒有觀察到。a/布里斯班/10/2007組中的活性水平也下降，在感染后第2-3天觀察到噴嚏。在m2ko(δtm)組中沒有觀察到與病毒暴露有關的活性水平或臨床征象的變化。組織病理學分析揭示了暴露于甲型流感/布里斯班/10/2007(h3n2)的動物中的鼻甲的變化，所述變化沒有在暴露于m2ko(δtm)病毒的雪貂中觀察到。向a/布里斯班/10/2007的暴露會導致呼吸上皮的萎縮、嗜中性粒細胞的浸潤和鼻甲的水腫。病毒接種沒有影響其它器官。在實驗條件下，m2ko(δtm)病毒沒有誘導感染的臨床征象或導致分析的器官的組織學變化。材料和方法a.疫苗材料和對照病毒：m2ko(δtm)病毒是這樣的重組病毒：其具有pr8的內部6個基因(核蛋白(np)、聚合酶基因(pa、pb1、pb2)、非結構(ns)、基質(m))，但是其不表達功能性m2蛋白，以及甲型流感/布里斯班/10/2007-樣a/烏拉圭/716/2007(h3n2)的ha和na基因。a/布里斯班/10/2007(h3n2)野生型病毒充當對照病毒，并由iitri提供。在使用之前在-65℃冷凍保存該病毒。b.試驗物和陽性對照劑量制劑：通過將8μl1x1010tcid50/ml稀釋進2.528mlpbs中，制備每316μl的1x107tcid50/ml的m2ko(δtm)病毒施用溶液。不經稀釋地使用每316μl的1x107tcid50/ml滴度的a/布里斯班/10/2007(h3n2)。c.動物和動物護理：從tripleffarms購買8只雄性雪貂，將6只雪貂用于研究。在研究起始時，動物為大約4月齡。所述動物經過供應商檢驗為健康的，且沒有對感染性疾病的抗體。到達后，將動物單個地圈養在具有條板底的懸絲籠子中，懸掛在襯紙的廢物盤上面。在接收動物之前，根據接受的動物護理實踐和有關的標準操作規程，已經清潔和消毒動物房和籠子。隨意供給certifiedtekladglobalferretdiet#2072(tekladdiets,madisonwi)和芝加哥城市自來水，并至少每天1次地更新。將動物房中的熒光照明維持在12-小時光照/黑暗周期。在研究過程中，動物室溫度和相對濕度是在各自的方案限度內，且分別是在22.0-25.0℃和33-56％的范圍內。d.動物隔離和隨機化：將雪貂保持隔離5天，然后隨機化，并每天觀察。基于指示動物的總體良好健康的每天觀察，從隔離釋放雪貂用于隨機化和試驗。隔離以后，將雪貂稱重，并使用計算機化的隨機化操作，基于產生類似的組平均值的體重，將其分配至治療組[2.1.e.11版(pdspathologydatasystems,inc.,basel,瑞士)]。在一組內，所有體重是在它們的平均值的20％內。為研究選擇的動物通過耳標接受永久標識號，并且發射機應答器和各個籠子卡片也通過各個編號和組鑒別研究動物。分配的鑒別編號在研究中是獨有的。e.實驗設計：根據位于iitresearchinstitute的動物護理和使用委員會批準的方案，在動物生物安全性水平-2設備中進行所有動物操作。將6只雄性雪貂(tripleffarms,sayrepa)(在研究起始時4月齡)用于研究。在感染之前，監測雪貂3天以測量體重和建立基線體溫。每天通過皮下地植入每只雪貂中的發射機應答器(biomedic數據系統,seaford,de)記錄溫度讀數。在研究起始之前通過頸靜脈收集血液，并針對流感抗體試驗血清。將不含流感抗體的研究動物隨機化，并分成2組(3只雪貂/組)，如表15所示。將一組3只雪貂麻醉，并鼻內地接種單次劑量的316μl的1x107tcid50的m2ko(δtm)病毒。給對照組(3只雪貂)接種316μl的1x107tcid50的a/布里斯班/10/2007(h3n2)。每天觀察雪貂，以監測體重、體溫和臨床癥狀。在接種后第3天，將雪貂(3只雪貂/組)安樂死，并尸檢。收集下述組織樣品：鼻甲、氣管、肺、腎、胰腺、嗅球、腦、肝、脾、小腸和大腸。用緩沖的中性福爾馬林固定收集的樣品的一部分用于組織學評價，并將樣品的另一部分在-65℃保存用于病毒滴定。表15:免疫接種和樣品收集計劃f.病毒接種：給雪貂接種m2ko(δtm)病毒或野生型a/布里斯班/10/2007(h3n2)甲型流感病毒。將一瓶冷凍的儲備物融化，并在磷酸鹽緩沖鹽水溶液中稀釋至適當的濃度。用氯胺酮/賽拉嗪麻醉雪貂，并以316μl(對于m2ko(δtm)病毒)和316μl(對于a/布里斯班/10/2007(h3n2)病毒)的體積鼻內地施用病毒劑量。為了證實a/布里斯班/10/2007(h3n2)病毒的接種滴度，在iitri對制備的病毒攻擊溶液的一部分進行tcid50測定。根據illinoisinstituteoftechnologyresearchinstitute(iitri)標準操作規程，執行病毒滴度測定。g.垂死率(moribundity)/死亡率觀察：攻擊后，針對死亡率或垂死率的證據每天2次地觀察所有動物。在攻擊后3天，觀察動物。通過靜脈內地施用的劑量過量的150mg/kg戊巴比妥鈉，將動物安樂死。h.體重和體重變化：在接收時(隨機的10％樣品)、在隨機化時(第-3至0天)和病毒接種后每天，記錄動物的體重。i.臨床觀察：每天確定每只雪貂的溫度變化(以攝氏度為單位)。每天評估臨床征象、食欲不振、呼吸征象(諸如呼吸困難、噴嚏、咳嗽和鼻漏)和活性水平。使用基于reuman,等人,“assessmentofsignsofinfluenzaillnessintheferretmodel,”j.virol,methods24:27-34(1989)描述的評分，如下評估活性水平：0，警覺的和多趣的；1，警覺的，但是僅在受刺激時是多趣的；2，警覺的，但是在受刺激時不是多趣的；和3，既不是警覺的，也不是在受刺激時多趣的。將相對無活性指數(rii)計算為在研究期間每組雪貂每次觀察(天)的平均評分。j.安樂死：通過靜脈內施用的150mg/kg戊巴比妥鈉，將研究動物安樂死。通過可觀察的心搏和呼吸的缺失來確認死亡。對所有研究動物進行尸檢。k.尸檢：收獲鼻甲、氣管、肺、腎、胰腺、嗅球、腦、肝、脾、小腸和大腸。將每個組織的一部分在福爾馬林中固定，并給其它部分施用iitri桿用于冷凍和貯存。收獲的用于滴度的組織是：右鼻甲、氣管的上部1/3、右顱側肺葉、右腎、胰腺的右分支(靠近十二指腸)、右嗅球、右腦、右側肝葉、脾的右半(在打開腹腔時看到的脾的末端)、小腸和大腸。l.組織病理學分析：將組織包埋進石蠟塊，以大約5-微米厚度切片，并用蘇木精和伊紅(h&e)染色。m.血清收集：疫苗接種前(第-3天)，從所有雪貂收集血清。用氯胺酮(25mg/kg)和賽拉嗪(2mg/kg)混合物麻醉雪貂。經由腔靜脈從每只雪貂收集血液樣品(大約0.5-1.0ml)，并處理成血清。將血液收集進serumgelz/1.1試管(sarstedtinc.newton,nc)，并在室溫儲存不超過1小時，然后收集血清。將serumgelz/1.1試管在10,000xg離心3分鐘，并收集血清。收集各個接種前血清樣品，并從每個樣品制備2個等分試樣。在研究起始之前試驗一個等分試樣，以證實雪貂不含有針對甲型流感病毒的抗體，并將一個血清等分試樣在-65℃儲存。n.血凝集抑制(hi)測定：用受體破壞酶(rde)(denkaseiken,tokyo,日本)處理血清樣品，以消除非特異性的血凝集的抑制劑。按照生產商的說明書，重構rde。將血清在rde中1:3稀釋，并在37℃±2℃水浴中溫育18-20小時。加入等體積的2.5％(v/v)檸檬酸鈉以后，將樣品在56±2℃水浴中溫育30±5分鐘。在rde處理后，將0.85％nacl加入每個樣品，至1:10的最終血清稀釋度。然后將經稀釋的樣品在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中一式兩份稀釋成4個2倍稀釋度(1:10至1:80)，然后與4個血凝單位的a/布里斯班/10/2007(h3n2)甲型流感病毒一起溫育。溫育后，將0.5％雞紅血細胞加入每個樣品，并溫育。然后將血凝集的存在或不存在評分。o.病毒滴度：通過madin-darby犬腎(mdck)細胞中的tcid50，確定攻擊前和攻擊后病毒接種物樣品中的感染性病毒的濃度。簡而言之，將在-65℃保存的樣品融化，并離心以除去細胞碎片。將得到的上清液在96-孔微孔滴定板內的dulbecco氏改良的伊格爾培養基(dmem)(gibco,carlsbad,ca,usa)中一式三份地10倍稀釋，所述dmem含有青霉素/鏈霉素、0.1％慶大霉素、3％naco3、0.3％bsa級分v(sigmast.louis,mo)、1％mem維生素溶液(sigma)和1％l-谷氨酰胺(mediatech,馬納薩斯,va,usa)。在制備10倍系列稀釋物以后，將100l轉移進96-孔板的各個孔中，所述孔含有單層mdck細胞。在37℃±2℃、5±2％co2、70％濕度溫育平板。48小時以后，觀察孔的細胞致病效應(cpe)。將得自每個孔的上清液(50μl)轉移至96孔板，并確定和記錄血凝集(ha)活性。通過使用0.5％填充的火雞紅血細胞(crbc)的ha測定，評估上清液的ha活性。使用reedlj和muenchh,“asimplemethodforestimating50％endpoints,”am.j.hygiene27:493-497(1938)的方法，計算tcid50滴度。p.數據分析：確定每只單獨動物的體重和體重增加(減輕)和體溫的變化，表達為每個試驗組的平均值和平均值標準差。結果用m2ko(δtm)病毒或a/布里斯班/10/2007(h3n2)甲型流感病毒接種后，監測雪貂的存活和感染臨床征象。將結果呈現在表16a和16b中。所有雪貂度過了m2ko(δtm)病毒和a/布里斯班/10/2007(h3n2)的感染。接種了a/布里斯班/10/2007的雪貂在第2和3天呈現呼吸征象(噴嚏)。接種了a/布里斯班/10/2007的雪貂的相對無活性指數為0.67；而接種了m2ko(δtm)的雪貂沒有表現出活性水平的下降，具有0.0的相對無活性指數。病毒接種以后的體重和溫度的變化顯示在圖20和圖21中。用a/布里斯班/10/2007(h3n2)接種后，在接種后第2天在所有動物中觀察到2-3％體重減輕。在接種了m2ko(δtm)病毒的雪貂中觀察到輕微至零重量減輕。一只m2ko(δtm)接種的雪貂在接種后第2天表現出1％的重量減輕。在接種后第2天在接種了a/布里斯班10/2007的雪貂中觀察到40.3-40.7℃的高體溫。體溫在第3天恢復至正常范圍。m2ko(δtm)接種的雪貂的體溫在研究期間保持在正常范圍內。為了確定m2ko(δtm)病毒是否在呼吸道或其它器官中復制和誘導病理學，在接種后第3天在組織學上檢查雪貂的組織，并與得自接種了a/布里斯班/10/2007的雪貂的那些組織進行對比。在接種了a/布里斯班/10/2007的雪貂中，僅在鼻甲中觀察到病理學。在鼻甲中觀察到呼吸上皮的萎縮、嗜中性粒細胞的浸潤和水腫。在接種了m2ko(δtm)病毒的雪貂中，沒有觀察到與病毒感染有關的組織病理學變化。攻擊前和攻擊后病毒施用溶液的濃度分別為107.5tcid50/ml和107.75tcid50/ml，從而指示攻擊材料在施用中的良好穩定性。表16a：病毒接種對雪貂的存活和感染臨床征象的影響.a在病毒接種之前在雪貂血清中針對同源病毒的血凝集抑制(hi)抗體滴度。b在病毒接種以后觀察臨床征象3天。除了嗜睡以外，將臨床征象的發現給出為具有征象的雪貂的數目/總數。呼吸征象包括噴嚏。c基于評分系統每天2次地確定，持續觀察3天，并計算為在3-天時段內每次觀察(天)每組雪貂的平均評分。接種之前的相對無活性指數為0。表16b：m2ko(δtm)不會在第3天收獲的雪貂呼吸器官中復制結論本實施例表明，在接種后第3天，m2ko(δtm)病毒沒有誘導疾病的臨床征象或與野生型病毒感染有關的組織病理學變化。這表明，本技術的m2ko(δtm)病毒可用于鼻內流行性感冒疫苗。實施例11：m2ko(δtm)病毒相對于其它疫苗的免疫應答和保護作用概要-本實施例證實了由m2ko(δtm)疫苗引起的免疫應答和該疫苗在雪貂模型中的保護作用。以1x107tcid50的劑量水平，將m2ko(δtm)病毒鼻內地施用給12只雄性雪貂。作為對照，以1x107tcid50的劑量，給第二組12只雄性雪貂鼻內地施用fm#6病毒。給第三組雪貂施用opti-memtm作為安慰劑對照。對于每個治療組，使用僅激發或激發-強化疫苗接種方案。給接受激發-強化疫苗接種方案的雪貂施用激發疫苗(第0天)，并在28天后(第28天)施用強化疫苗接種。在給激發-強化雪貂施用加強疫苗的同一天(第28天)，給僅接受激發疫苗的雪貂施用單次疫苗接種。每次疫苗接種以后，針對死亡率觀察雪貂至接種后14天，每天測量體重、體溫和臨床征象。在激發疫苗接種后第1、3、5、7和9天，從雪貂收集鼻洗液，以觀察病毒的脫落。每周從疫苗接種后的所有雪貂收集鼻洗液和血清，以隨時間評價抗體水平。在第56天，用1x107tcid50的a/布里斯班/10/2007(h3n2)鼻內地攻擊所有動物。攻擊后，針對死亡率監測雪貂至接種后14天，每天測量體重、體溫和臨床征象。在攻擊后第1、3、5、7、9和14天，從每組中的雪貂收集鼻洗液用于病毒滴度。另外，在攻擊后(第70天)從存活雪貂收集血清用于分析。在攻擊后3天，對每組3只雪貂進行尸檢。收集器官用于組織病理學和病毒滴度。在5組中沒有觀察到疫苗相關的不利事件。攻擊以后，安慰劑對照組表現出攻擊后2天的體溫增加和重量減輕。也在m2ko(δtm)和fm#6接種疫苗組中觀察到重量減輕；但是，所述減輕小于在opti-memtm組中觀察到的減輕。活性水平在任何組中沒有降低；但是，在攻擊后在所有組中觀察到噴嚏。組織病理學分析揭示，與opti-memtm對照組中的肺浸潤相比，接種疫苗的雪貂的肺中的混合細胞浸潤的嚴重程度的增加。在鼻甲中，與opti-memtm對照組相比，接受m2ko(δtm)或fm#6的激發或激發+強化方案的動物具有更低嚴重程度的呼吸上皮萎縮。使用m2ko(δtm)病毒的疫苗接種似乎會提供與fm#6病毒類似的對抗病毒攻擊的保護。材料和方法a.疫苗材料：m2ko(δtm)病毒是這樣的重組病毒：其具有pr8的內部6個基因(核蛋白(np)、聚合酶基因(pa、pb1、pb2)、非結構(ns)、基質(m))，但是其不表達功能性m2蛋白，以及甲型流感/布里斯班/10/2007-樣a/烏拉圭/716/2007(h3n2)的ha和na基因。fm#6病毒是得自(2009-2010制劑)的a/烏拉圭/716/2007(h3n2)甲型流感病毒的克隆#6。以316μl劑量的1x107tcid50(50％組織培養物感染劑量)，將m2ko(δtm)病毒和fm#6病毒鼻內地施用給動物。b.試驗物和陽性對照劑量制劑：通過將120μl1x109tcid50/ml稀釋進3.680mlpbs中，制備每316μl的1x107tcid50/ml的m2ko(δtm)病毒施用溶液。通過通過將120μl1x109tcid50/ml稀釋進3.680mlpbs中，制備每316μl的1x107tcid50/ml滴度的fm#6病毒。c.動物和動物護理：從tripleffarms購買36只雄性雪貂，并將30只雪貂用于研究。在研究起始時，動物為大約4月齡。所述動物經過供應商檢驗為健康的，且沒有對感染性疾病的抗體。到達后，將動物單個地圈養在具有條板底的懸絲籠子中，懸掛在襯紙的廢物盤上面。在接收動物之前，根據接受的動物護理實踐和有關的標準操作規程，已經清潔和消毒動物房和籠子。隨意供給certifiedtekladglobalferretdiet#2072(tekladdiets,madisonwi)和芝加哥城市自來水，并每周至少3次地更新。將動物房中的熒光照明維持在12-小時光照/黑暗周期。在研究過程中，動物室溫度和相對濕度是在各自的方案限度內，且分別是在20.0-25.0℃和30-63％的范圍內。d.動物隔離和隨機化：將雪貂保持隔離7天，然后隨機化，并每天觀察。基于指示動物的總體良好健康的每天觀察，從隔離釋放雪貂用于隨機化和試驗。隔離以后，將雪貂稱重，并使用計算機化的隨機化操作，基于產生類似的組平均值的體重，將其分配至治療組[2.1.e.11版(pdspathologydatasystems,inc.,basel,瑞士)]。在一組內，所有體重是在它們的平均值的20％內。為研究選擇的動物通過耳標接受永久標識號，并且發射機應答器和各個籠子卡片也通過各個編號和組鑒別研究動物。分配的鑒別編號在研究中是獨有的。e.實驗設計：為了評估m2ko(δtm)疫苗效力，用m2ko(δtm)病毒、冷適應的活減毒病毒(fm#6)免疫雪貂，或者用介質(opti-memtm)假免疫。監測動物體重、體溫和臨床癥狀，并評價免疫學應答。將30只在研究起始時4月齡的雄性雪貂(tripleffarms,sayrepa)用于研究。根據位于iitresearchinstitute的動物護理和使用委員會批準的方案，在動物生物安全性水平-2或生物安全性水平-3設備中進行所有動物操作。在接種之前，監測雪貂3天以測量體重和建立基線體溫。每天通過皮下地植入每只雪貂中的發射機應答器(biomedic數據系統,seaford,de)記錄溫度讀數。在研究起始之前收集血液，并針對流感抗體試驗血清。僅具有針對a/布里斯班/10/2007(h3n2)的hai(血凝集抑制)滴度40的雪貂被認為是血清陰性的，并用在該研究中。將研究動物隨機化，并分成5組(6只雪貂/組)，如表17所示。2組(1&3)接受m2ko(δtm)病毒，2組(2&4)接受fm#6病毒。用opti-memtm假免疫一組(5)。在每個疫苗組內，將雪貂分成2個疫苗方案，6只僅接受激發疫苗接種(僅激發)，6只接受激發疫苗接種和激發疫苗接種以后28天的加強疫苗(激發/強化)。激發/強化組：在第0和28天給雪貂鼻內地接種單次劑量的316μl1x107tcid50的m2ko(δtm)病毒。在第0和28天給對照組鼻內地接種316μl1x107tcid50(與m2ko(δtm)相同劑量)的fm#6或假接種316μlopti-memtm。每天監測雪貂體溫、重量和臨床癥狀至接種后14天。在激發疫苗接種后第1、3、5、7、9和14天(用于細胞中的病毒滴定)和在第21和49天(用于抗體滴定)，從所有雪貂(包括opti-memtm對照組)收集鼻洗液。在-65℃保存鼻洗液樣品。在接種前(第-3至-5天)和第7、14、2135、42和49天，收集血液，并在-65℃保存血清，直到通過elisa和hi測定測量抗體滴度。僅激發組：在第28天，給雪貂鼻內地接種單次劑量的316μl1x107tcid50的m2ko(δtm)病毒。在第28天，給對照組鼻內地接種316μl1x107tcid50(與m2ko(δtm)相同劑量)的fm#6或假接種316μlopti-memtm。每天監測雪貂體溫、重量和臨床癥狀至14天接種后。在第29、31、33、35、37和42天(用于細胞中的病毒滴定)和第49天(用于抗體滴定)，從所有雪貂收集鼻洗液。在-65℃保存鼻洗液樣品。在接種前(第23-25天)和第35、42和49天收集血液，并在-65℃保存血清，直到通過elisa和hai測定測量抗體滴度。在施用激發/強化疫苗以后4周，在第56天用316μl劑量的1x107tcid50的野生型a/布里斯班/10/2007(h3n2)流感病毒攻擊所有雪貂。監測雪貂體重、體溫和臨床癥狀至攻擊后14天，并收集鼻洗液和器官。在攻擊后第1、3、5、7、9和14天(第57、59、61、63、65和70天)，從攻擊的雪貂收集鼻洗液，并在-65℃保存樣品，用于細胞中的病毒滴定。在攻擊后第3天(第59天)，將動物(3只動物/組，共15只動物)安樂死，并收集下述組織樣品：鼻甲、氣管和肺。用緩沖的中性福爾馬林固定收集的樣品的一部分用于組織學評價，并將樣品的另一部分在-65℃儲存用于病毒滴定。在攻擊后14天(第70天)收集血液，并將所有存活的動物安樂死。表17：疫苗接種和樣品收集計劃1以1x107tcid50的劑量鼻內接種2僅從激發疫苗接種后的動物收集的鼻洗液3從每組3只雪貂收集的器官(鼻甲、氣管和肺)用于組織學和病毒滴度f.病毒接種：給雪貂接種m2ko(δtm)病毒或fm#6甲型流感病毒。將一瓶冷凍的儲備物融化，并在磷酸鹽緩沖鹽水溶液中稀釋至適當的濃度。用氯胺酮/賽拉嗪麻醉雪貂，并以316μl(對于m2ko(δtm)病毒)和316μl(對于fm#6病毒)的體積鼻內地施用病毒劑量。為了證實m2ko(δtm)和fm#6病毒的接種滴度，在施用之前(施用前)和在施用之后(施用后)收集施用溶液的等分試樣。在-65℃儲存等分試樣用于病毒滴定。g.攻擊病毒：使用甲型流感病毒、a/布里斯班/10/2007株、血清型h3n2攻擊雪貂。在使用之前在大約-65℃儲存病毒。以316μl的體積，在1x107tcid50制備使用的攻擊病毒的劑量水平。在iitri對制備的病毒攻擊溶液的一部分執行定量病毒侵染性測定，即tcid50測定。根據iitri標準操作規程，執行病毒滴度測定。h.垂死率/死亡率觀察：攻擊后，針對死亡率或垂死率的證據每天2次地觀察所有動物。觀察動物至疫苗接種后14天和攻擊后14天。i.體重和體重變化：在接收的2天內和在隨機化時，記錄體重。在接種之前將所有研究動物稱重，每天稱重至每次疫苗接種后14天，并每天評估至攻擊后14天。在接種之前，監測雪貂3-5天，以測量建立基線體溫。每天通過皮下地植入每只雪貂中的發射機應答器(biomedic數據系統,seaford,de)記錄溫度讀數至每次疫苗接種后14天，并記錄至攻擊后14天。在每個時間點記錄每只動物的溫度的變化(以攝氏度為單位)。j.臨床觀察：每天確定每只雪貂的溫度的變化(以攝氏度為單位)。每天評估臨床征象、食欲不振、呼吸征象(諸如呼吸困難、噴嚏、咳嗽和鼻漏)和活性水平。使用基于reuman,等人,“assessmentofsignsofinfluenzaillnessintheferretmodel,”j.virol,methods24:27-34(1989)描述的評分，如下評估活性水平：0，警覺的和多趣的；1，警覺的，但是僅在受刺激時是多趣的；2，警覺的，但是在受刺激時不是多趣的；和3，既不是警覺的，也不是在受刺激時多趣的。將相對無活性指數(rii)計算為在研究期間每組雪貂每次觀察(天)的平均評分。k.存活檢查：在研究過程中，每天對所有研究動物進行2次存活檢查。兩次存活檢查與臨床觀察同時進行。在同一天內稍后進行第二次檢查。l.鼻洗液：用氯胺酮(25mg/kg)和賽拉嗪(2mg/kg)混合物麻醉雪貂，并將0.5ml含有青霉素(100u/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和慶大霉素(50μg/ml)的無菌pbs注射進每個鼻孔，當從雪貂排出時，收集進樣本杯中。將鼻洗液收集進冷凍小瓶中，并記錄回收的體積。m.安樂死：通過靜脈內施用150mg/kg戊巴比妥鈉，將研究動物安樂死。通過可觀察的心搏和呼吸的缺失，證實死亡。n.尸檢：由charlesriverlaboratories,pathologyassociates(pai)執行尸檢。pai團隊由1個監督病理學家和2個解剖員組成。收獲鼻甲、氣管和肺。將每個組織的一部分在福爾馬林中固定，并給其它部分施用iitri桿用于冷凍和貯存。收獲的用于滴度的組織是：右鼻甲、氣管的上部1/3和右顱側肺葉。o.組織病理學分析：在每次尸檢以后，將組織運輸至paichicago設備。接收后，將得自所有15只雪貂的部分組織包埋進石蠟塊，以大約5-微米厚度切片，并用蘇木精和伊紅(h&e)染色。在顯微鏡下評價所有石蠟h&e切片。p.血清收集：從雪貂收集疫苗接種前血清(對于第3、4和5組，第-3至-5天；對于第1和2組，第23-25天)。接種后，在第7、14、21、35、42、49和70天從第3、4和5組收集血清。在第35、42、49和70天從第1和2組收集血清。用氯胺酮(25mg/kg)和賽拉嗪(2mg/kg)混合物麻醉雪貂。經由腔靜脈從每只雪貂收集血液樣品(大約0.5-1.0ml)，并加工成血清。將血液收集進serumgelz/1.1試管(sarstedtinc.newton,nc)，并在室溫儲存不超過1小時，然后收集血清。將serumgelz/1.1試管在10,000xg離心3分鐘，并收集血清。q.血凝集抑制(hi)測定：用受體破壞酶(rde)(denkaseiken,tokyo,日本)處理血清樣品，以消除非特異性的血凝集的抑制劑。按照生產商的說明書，重構rde。將血清在rde中1:3稀釋，并在37℃±2℃水浴中溫育18-20小時。加入等體積的2.5％(v/v)檸檬酸鈉以后，將樣品在56±2℃水浴中溫育30±5分鐘。在rde處理后，將0.85％nacl加入每個樣品，至1:10的最終血清稀釋度。然后將經稀釋的樣品在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中一式兩份稀釋成4個2倍稀釋度(1:10至1:80)，然后與4個血凝單位的a/布里斯班/10/2007(h3n2)甲型流感病毒一起溫育。溫育后，將0.5％禽紅血細胞加入每個樣品，并溫育30±5分鐘。然后將血凝集的存在或不存在評分。r.病毒滴度：通過madin-darby犬腎(mdck)細胞中的tcid50，確定攻擊前和攻擊后病毒接種物樣品中的感染性病毒的濃度。簡而言之，將在-65℃保存的樣品融化，并離心以除去細胞碎片。將得到的上清液在96-孔微孔滴定板內的dulbecco氏改良的伊格爾培養基(dmem)(gibco,carlsbad,ca,usa)中一式三份地10倍稀釋，所述dmem含有青霉素/鏈霉素、0.1％慶大霉素、3％naco3、0.3％bsa級分v(sigmast.louis,mo)、1％mem維生素溶液(sigma)和1％l-谷氨酰胺(mediatech,馬納薩斯,va,usa)。在制備10倍系列稀釋物以后，將100μl轉移進96-孔板的各個孔中，所述孔含有單層mdck細胞。在37℃±2℃、5±2％co2、70％濕度溫育平板。48小時以后，觀察孔的細胞致病效應(cpe)。將得自每個孔的上清液(50μl)轉移至96孔板，并確定和記錄血凝集(ha)活性。通過使用0.5％填充的火雞紅血細胞(trbc)的ha測定，評估上清液的ha活性。使用reedlj和muenchh,“asimplemethodforestimating50％endpoints,”am.j.hygiene27:493-497(1938)的方法，計算tcid50滴度。s.數據分析：確定每只單獨動物的體重和體重增加(減輕)和體溫的變化，表達為每個試驗組的平均值和平均值標準差。結果在鼻內疫苗接種m2ko(δtm)病毒或fm#6病毒以后，每天監測雪貂的感染臨床征象。在激發疫苗接種以后收集鼻洗液以監測病毒的脫落，并收集血清以測量血清抗體滴度。結果呈現在表18a、18b和18c中。表18a：疫苗接種對雪貂的存活和感染臨床征象的影響.a在病毒接種之前雪貂血清中的針對同源病毒的血凝集抑制(hi)抗體滴度。b觀察臨床征象至病毒接種以后3天。除了嗜睡以外，將臨床征象的發現給出為具有征象的雪貂的數目/總數。呼吸征象包括噴嚏。c基于評分系統每天2次地確定，持續觀察3天，并計算為在3-天時段內每次觀察(天)每組雪貂的平均評分。接種之前的相對無活性指數為0。表18b：攻擊以后雪貂呼吸器官中的病毒滴度表18c：雪貂中的粘膜iga應答所有雪貂度過了使用m2ko(δtm)病毒和fm#6病毒的疫苗接種。激發疫苗接種以后，2只接種了m2ko(δtm)病毒的雪貂在第8天呈現出呼吸征象(噴嚏)。強化疫苗接種以后，接種了fm#6病毒的雪貂在疫苗接種后7天呈現呼吸征象(噴嚏)。還在強化后第4天在opti-memtm雪貂中觀察到噴嚏。激發疫苗接種以后，接種了m2ko(δtm)病毒和fm#6病毒的雪貂的相對無活性指數分別為0.07和0.27。在激發疫苗接種以后，該活性下降僅在每種病毒的一個組中觀察到。強化疫苗接種以后，沒有觀察到活性水平的下降。病毒接種以后體重和溫度的變化顯示在圖22和圖23中。在疫苗接種以后沒有觀察到重量減輕；但是，疫苗接種似乎對重量增加具有影響。疫苗接種以后，opti-memtm對照雪貂的體重在14天觀察期中增加了20％，而m2ko(δtm)或fm#6接種疫苗的雪貂的體重增加范圍為激發以后的6-15％和強化以后的4-6％。在疫苗接種以后在任何組中沒有觀察到體溫的增加。攻擊以后的體重和溫度的變化顯示在圖24和圖25中，臨床征象總結在表19中。表19：病毒攻擊對雪貂的存活和感染臨床征象的影響a觀察臨床征象至病毒接種以后3天。除了嗜睡以外，將臨床征象的發現給出為具有征象的雪貂的數目/總數。呼吸征象包括噴嚏。b基于評分系統每天2次地確定，持續觀察3天，并計算為在3-天時段內每次觀察(天)每組雪貂的平均評分。接種之前的相對無活性指數為0。用a/布里斯班/10/2007(h3n2)攻擊以后，在攻擊后第2天在所有動物中觀察到2-4％體重減輕。在14天觀察期中，動物體重保持低于它們的初始重量。opti-memtm雪貂減輕最大的重量(8％)。接種疫苗的雪貂的重量減輕取決于疫苗方案。接受m2ko(δtm)或fm#6的僅激發方案的雪貂分別減輕5％和4％的最大值。接受強化劑的雪貂減輕以下最大值：fm#6組為3％，m2ko(δtm)組為2％。在第2天在opti-memtm雪貂中和在第1天在接受m2ko(δtm)或fm#6的僅激發方案的雪貂中觀察到攻擊后的高體溫(圖25)。接受強化劑的雪貂的體溫保持在正常范圍內。為了確定疫苗接種是否會阻止攻擊病毒在呼吸道中的復制和減輕器官病理學，在接種后第3天在組織學上檢查了攻擊的雪貂的組織。將接受m2ko(δtm)僅激發或激發/強化方案的動物的肺中的變化與相對于opti-memtm組的肺中的混合細胞浸潤的嚴重程度的增加相關聯。在m2ko(δtm)激發組和m2ko(δtm)激發/強化組之間觀察到肺浸潤發生率的微小差異。與opti-memtm組相比，也在fm#6激發組和fm#6激發/強化組中觀察到肺中的混合細胞浸潤的嚴重程度的增加。在fm#6激發/強化組中觀察到相對于fm#6僅激發組的肺混合細胞浸潤的嚴重程度的輕微增加。在鼻甲中，與opti-memtm組相比，接受m2ko(δtm)病毒的激發或激發/強化的動物具有更低嚴重程度的呼吸上皮萎縮。當將激發組相對于激發/強化m2ko(δtm)組進行對比時，不存在鼻甲萎縮差異。相對于接受fm#6僅激發方案的動物，在接受fm#6激發/強化方案的動物中觀察到呼吸上皮萎縮的嚴重程度的輕微增加；所有fm#6動物中的呼吸上皮萎縮的嚴重程度都低于在opti-memtm組中觀察到的結果。與opti-memtm組相比，在m2ko(δtm)激發和激發/強化組中存在向鼻腔(內腔)中的嗜中性粒細胞性浸潤的發生率的下降。m2ko(δtm)僅激發組中的嗜中性粒細胞性內腔浸潤被解釋為與opti-memtm組沒有不同。與opti-memtm組相比，在fm#6僅激發和激發/強化組中存在內腔嗜中性粒細胞性浸潤的嚴重程度的輕微增加。攻擊前和攻擊后病毒施用溶液的濃度分別為107.83tcid50/ml和107.25tcid50/ml，從而指示攻擊材料在施用中的良好穩定性。圖45顯示了雪貂呼吸道中的m2ko(δtm)和病毒復制。圖46顯示了用a/布里斯班/10/2007(h3n2)病毒鼻內攻擊以后鼻洗液中的m2ko(δtm)和病毒滴度。圖47顯示了僅用m2ko(δtm)和激發組疫苗接種以后雪貂中的igg滴度。圖48顯示了用m2ko(δtm)和激發-加強組疫苗接種以后雪貂中的igg滴度。圖49顯示了從用m2ko(δtm)或疫苗接種至攻擊后，雪貂血清中的elisaigg滴度的總結。結論本實施例表明，m2ko(δtm)病毒的鼻內施用沒有與任何疫苗相關的不利事件(體溫升高、重量減輕或臨床征象)關聯。這些結果表明，本技術的m2ko(δtm)病毒可用于鼻內流感疫苗。實施例12：m2ko(δtm)病毒未在雪貂模型中傳播概要-本實施例證實，m2ko(δtm)病毒未在雪貂模型中傳播。以1x107tcid50的劑量水平，將m2ko(δtm)病毒鼻內地施用給3只雌性雪貂。作為對照，以1x107tcid50的劑量給第二組3只雌性雪貂鼻內地施用a/布里斯班/10/2007(h3n2)病毒。接種后24小時，將每只供體雪貂引入具有2只原初雪貂(直接接觸和氣溶膠接觸)的傳播室。接種后，針對死亡率觀察雪貂至接種后14天，每天測量體重、體溫和臨床征象。從所有接種的供體雪貂(在第1、3、5、7、9天)和從所有接觸(直接和氣溶膠)雪貂(在第2、4、6、8、10天)收集鼻洗液，以查看病毒的脫落。在研究接種時(第14天)，從所有雪貂收集鼻洗液和血清，以評價抗體水平。在m2ko(δtm)組中沒有觀察到感染臨床征象；但是，在a/布里斯班/10/2007(h3n2)組中的雪貂具有重量減輕、增加的體溫，且打噴嚏。用布里斯班/10接種后，供體雪貂在攻擊和重量減輕以后2天表現出體溫的增加。任何組中的活性水平沒有降低。與供體雪貂直接接觸的雪貂在接種后第4天之前表現出進行性重量增加。從接種后第6天開始，在氣溶膠接觸雪貂中觀察到類似的趨勢。接觸雪貂的體重減少與體溫的增加有關。用m2ko(δtm)病毒接種沒有在接種的動物中引起感染臨床征象。向接觸雪貂的傳播是不太可能的。材料和方法a.疫苗材料：m2ko(δtm)病毒是這樣的重組病毒：其具有pr8的內部6個基因(核蛋白(np)、聚合酶基因(pa、pb1、pb2)、非結構(ns)、基質(m))，但是其不表達功能性m2蛋白，以及甲型流感/布里斯班/10/2007-樣a/烏拉圭/716/2007(h3n2)的ha和na基因。以316μl劑量的1x107tcid50(50％組織培養物感染劑量)，將m2ko(δtm)病毒鼻內地施用給動物。b.試驗物劑量制劑：通過將45的1x109tcid50/ml稀釋進1.377mlpbs中，制備每316μl1x107tcid50/ml的m2ko(δtm)病毒施用溶液。c.動物和動物護理：從tripleffarms購買22只雌性雪貂，將18只雪貂用于研究。在研究起始時，動物為大約4月齡。所述動物經過供應商檢驗為健康的，且沒有對感染性疾病的抗體。到達后，將動物單個地圈養在具有條板底的懸絲籠子中，懸掛在襯紙的廢物盤上面。在接收動物之前，根據接受的動物護理實踐和有關的標準操作規程，已經清潔和消毒動物房和籠子。隨意供給certifiedtekladglobalferretdiet#2072(tekladdiets,madisonwi)和芝加哥城市自來水，并至少每天1次地更新。將動物房中的熒光照明維持在12-小時光照/黑暗周期。在研究過程中，動物室溫度和相對濕度是在各自的方案限度內，且分別是在23.0-25.0℃和36-50％的范圍內。d.動物隔離和隨機化：將雪貂保持隔離7天，然后隨機化，并每天觀察。基于指示動物的總體良好健康的每天觀察，從隔離釋放雪貂用于隨機化和試驗。隔離以后，將雪貂稱重，并使用計算機化的隨機化操作，基于產生類似的組平均值的體重，將其分配至治療組[2.1.e.11版(pdspathologydatasystems,inc.,basel,瑞士)]。在一組內，所有體重是在它們的平均值的20％內。為研究選擇的動物通過耳標接受永久標識號，并且發射機應答器和各個籠子卡片也通過各個編號和組鑒別研究動物。分配的鑒別編號在研究中是獨有的。e.實驗設計：為了評估m2ko(δtm)病毒的傳播性，給雪貂接種m2ko(δtm)病毒或a/布里斯班/10/2007(h3n2)病毒。監測動物體重、體溫、臨床癥狀和病毒脫落，并評價免疫學應答。將18只在研究起始時為4月齡的雌性雪貂(tripleffarms,sayrepa)用于研究。在動物生物安全性水平-2或水平3設備中執行所有動物操作。在接種之前，監測雪貂3天以測量體重和建立基線體溫。每天通過皮下地植入每只雪貂中的發射機應答器(biomedic數據系統,seaford,de)記錄溫度讀數。在研究起始之前收集血液，并針對流感抗體來試驗血清。僅具有針對a/布里斯班/10/2007(h3n2)病毒的hi滴度40的雪貂被認為是血清陰性的，并用在該研究中。將研究動物隨機化，并分成2組(9只雪貂/組，3只/傳播室)，如表20所示。指定組1中的雪貂(室a-c)接收m2ko(δtm)病毒。指定組2中的雪貂(室a-c)接收a/布里斯班/10/2007(h3n2)病毒。在每個組內，將雪貂分成接種的供體或原初接觸。表20:研究設計1每個室由3只雌性雪貂組成：1只受感染的供體雪貂和2只原初接觸雪貂(1只直接接觸和1只氣溶膠接觸)。2鼻內地接種單次劑量的316μl的1x107tcid50的m2ko或1x107tcid50的a/布里斯班/10/2007(h3n2)病毒。將每組圈養在單獨的房間中，并操作所述動物的個人遵循嚴格的工作流模式，以防止兩組之間的交叉污染。在每個組中，給1只供體雪貂鼻內地接種單次劑量的316μl的1x107tcid50的m2ko(δtm)(組1)或1x107tcid50的a/布里斯班/10/2007(h3n2)病毒(組2)。接種后24小時，將每只供體放入含有1只原初雪貂的相同籠子中(直接接觸)，在絲籠內雙圈養。將另一只雪貂(氣溶膠接觸)放入傳播室內的單獨鄰近絲籠(單圈養)，其與供體的籠子隔開10-12cm的距離。每天監測雪貂體溫、重量和臨床癥狀至接種后14天。從所有接種的供體雪貂(在第1、3、5、7、9天)和從所有接觸(直接和氣溶膠)雪貂(在第2、4、6、8、10天)收集鼻洗液，用于細胞中的病毒滴定。在第14天從所有雪貂收集鼻洗液用于抗體滴定。在-65℃保存鼻洗液樣品。f.傳播室：每個傳播室是2立方米。使用計算機化的空氣處理單元進行hepa過濾，并監測和控制傳播室內的環境條件。為了提供定向氣流，穿過位于室一端處的入口供給hepa-過濾的空氣，并穿過在室的相對端處的出口離開，用hepa過濾，并排入室中。空氣交換速率是每個室每小時20次完全換氣，將氣流維持為<0.1m/秒。將室維持在-0.15英寸水的負壓。將雪貂圈養在具有條板底的絲籠中，懸掛在襯紙的廢物盤上面。將雪貂在32x24x14籠子中雙圈養或者在24x24x14絲籠中單圈養，所述籠子放在每個hepa-過濾的傳播室內。g.病毒接種：給雪貂接種m2ko(δtm)病毒。融化1瓶冷凍的儲備物，并在磷酸鹽緩沖鹽水溶液中稀釋至適當的濃度。用氯胺酮/賽拉嗪麻醉雪貂，并以316μl的體積鼻內地施用m2ko(δtm)病毒劑量。為了證實m2ko(δtm)病毒的接種滴度，在給藥之前(給藥前)和給藥之后(給藥后)收集施用溶液的等分試樣。在65℃儲存等分試樣用于病毒滴定。h.攻擊病毒：使用甲型流感病毒菌株a/布里斯班/10/2007血清型h3n2接種對照雪貂。在使用之前在大約-65℃儲存病毒。以316μl的體積，在1x107tcid50制備使用的攻擊病毒的劑量水平。在iitri對制備的病毒攻擊溶液的一部分進行定量病毒侵染性測定，即tcid50測定。根據iitri標準操作規程，執行病毒滴度測定。i.垂死率/死亡率觀察：攻擊后，針對死亡率或垂死率的證據每天2次地觀察所有動物。觀察動物至疫苗接種后14天和攻擊后14天。j.體重和體重變化：在接收的2天內和在隨機化時記錄體重。在接種之前將所有研究動物稱重，每天稱重至每次疫苗接種后14天，并每天評估至攻擊后14天。在接種之前，監測雪貂3-5天，以測量建立基線體溫。每天通過皮下地植入每只雪貂中的發射機應答器(biomedic數據系統,seaford,de)記錄溫度讀數至每次疫苗接種后14天，并記錄至攻擊后14天。在每個時間點計算每只動物的溫度的變化(以攝氏度為單位)。k.臨床觀察：每天確定每只雪貂的溫度變化(以攝氏度為單位)。每天評估臨床征象、食欲不振、呼吸征象(諸如呼吸困難、噴嚏、咳嗽和鼻漏)和活性水平。使用基于reuman,等人,“assessmentofsignsofinfluenzaillnessintheferretmodel,”j.virol,methods24:27-34(1989)描述的評分，如下評估活性水平：0，警覺的和多趣的；1，警覺的，但是僅在受刺激時是多趣的；2，警覺的，但是在受刺激時不是多趣的；和3，既不是警覺的，也不是在受刺激時多趣的。將相對無活性指數(rii)計算為在研究期間每組雪貂每次觀察(天)的平均評分。l.存活檢查：在研究過程中，每天對所有研究動物進行2次存活檢查。兩次存活檢查與臨床觀察同時進行。在同一天內稍后進行第二次檢查。m.鼻洗液：用氯胺酮(25mg/kg)和賽拉嗪(2mg/kg)混合物麻醉雪貂，并將0.5ml含有青霉素(100u/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和慶大霉素(50μg/ml)的無菌pbs注射進每個鼻孔，當從雪貂排出時，收集進樣本杯中。n.安樂死：通過靜脈內施用150mg/kg戊巴比妥鈉，將研究動物安樂死。通過可觀察的心搏和呼吸的缺失，證實死亡。對所有研究動物進行尸檢。o.血清收集：從所有雪貂收集疫苗接種前血清(第-3至-5天)和接種后血清(第14天)。用氯胺酮(25mg/kg)和賽拉嗪(2mg/kg)混合物麻醉雪貂。經由腔靜脈從每只雪貂收集血液樣品(大約0.5-1.0ml)，并加工成血清。將血液收集進serumgelz/1.1試管(sarstedtinc.newton,nc)，并在室溫儲存不超過1小時，然后收集血清。將serumgelz/1.1試管在10,000xg離心3分鐘，并收集血清。收集單個接種前血清樣品，并從每個樣品制備2個等分試樣。在研究起始之前試驗1個等分試樣，以證實雪貂不含針對甲型流感病毒的抗體，并在-65℃儲存血清的1個等分試樣。p.血凝集抑制(hi)測定：用受體破壞酶(rde)(denkaseiken,tokyo,日本)處理血清樣品，以消除非特異性的血凝集的抑制劑。按照生產商的說明書，重構rde。將血清在rde中1:3稀釋，并在37℃±2℃水浴中溫育18-20小時。加入等體積的2.5％(v/v)檸檬酸鈉以后，將樣品在56±2℃水浴中溫育30±5分鐘。在rde處理后，將0.85％nacl加入每個樣品，至1:10的最終血清稀釋度。然后將經稀釋的樣品在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中一式兩份稀釋成4個2倍稀釋度(1:10至1:80)，然后與4個血凝單位的a/布里斯班/10/2007(h3n2)甲型流感病毒一起溫育。溫育后，將0.5％禽紅血細胞加入每個樣品，并溫育30±5分鐘。然后將血凝集的存在或不存在評分。q.病毒滴度：通過madin-darby犬腎(mdck)細胞中的tcid50測定，確定攻擊前和攻擊后病毒接種物樣品中的感染性病毒的濃度。簡而言之，將在-65℃保存的樣品融化，并離心以除去細胞碎片。將得到的上清液在96-孔微孔滴定板內的dulbecco氏改良的伊格爾培養基(dmem)(gibco,carlsbad,ca,usa)中一式三份地10倍稀釋，所述dmem含有青霉素/鏈霉素、0.1％慶大霉素、3％naco3、0.3％bsa級分v(sigmast.louis,mo)、1％mem維生素溶液(sigma)和1％l-谷氨酰胺(mediatech,馬納薩斯,va,usa)。在制備10倍系列稀釋物以后，將1oofll轉移進96-孔板的各個孔中，所述孔含有單層mdck細胞。在37℃±2℃、5±2％co2、70％濕度溫育平板。48小時以后，觀察孔的細胞致病效應(cpe)。將得自每個孔的上清液(50μl)轉移至96孔板，并確定和記錄血凝集(ha)活性。通過使用0.5％填充的火雞紅血細胞(trbc)的ha測定，評估上清液的ha活性。使用reedlj和muenchh,“asimplemethodforestimating50％endpoints,”am.j.hygiene27:493-497(1938)的方法，計算tcid50滴度。r.數據分析：確定每只單獨動物的體重和體重增加(減輕)和體溫的變化，表達為每個試驗組的平均值和平均值標準差。結果給供體雪貂接種m2ko(δtm)病毒或a/布里斯班/10/2007(h3n2)甲型流感病毒以后，將供體雪貂引入含有原初接觸雪貂的傳播室。每天監測雪貂的感染臨床征象，收集鼻洗液以監測病毒的脫落，并收集血清以測量血清抗體滴度。所有雪貂度過了使用m2ko(δtm)病毒和a/布里斯班/10/2007的接種(表21)。在m2ko(δtm)組雪貂中沒有觀察到疾病的臨床征象。用a/布里斯班/10/2007病毒接種的3只供體雪貂中的2只在第6和8天呈現呼吸征象(噴嚏)。所有室中的直接接觸雪貂在第8天呈現噴嚏。在氣溶膠接觸雪貂中沒有觀察到噴嚏。沒有觀察到活性水平的下降。表21：接種的供體雪貂和接觸雪貂中的臨床征象.a在病毒接種之前在雪貂血清中針對同源病毒的血凝集抑制(hi)抗體滴度。b觀察臨床征象至病毒接種以后14天。除了嗜睡以外，將臨床征象的發現給出為具有征象的雪貂的數目/總數。呼吸征象是噴嚏，每只雪貂的發作天數在括弧中。c基于評分系統每天2次地確定，持續觀察14天，并計算為在14-天時段內每次觀察(天)每組雪貂的平均評分。接種之前的相對無活性指數為0。病毒接種以后的體重和溫度的變化顯示在圖26和圖27中。在用m2ko(δtm)病毒接種后，沒有觀察到顯著的重量減輕。氣溶膠接觸的重量減輕的平均值為1％；但是，這不可能是由于暴露于病毒。在14天觀察期中，m2ko(δtm)病毒雪貂的體重增加為9％(對于供體雪貂)和10-11％(對于接觸雪貂)(圖26a)。a/布里斯班/10/2007的體重增加僅為3％(對于供體雪貂)和6-8％(對于接觸雪貂)，從而指示病毒感染(圖26b)。在m2ko(δtm)組中，除了感染后第3天以外，體溫保持在正常水平內(圖27a)。體溫低于氣溶膠接觸雪貂的正常值。這歸因于有缺陷的或失敗的溫度發射機應答器，在研究的其它部分中記錄在正常范圍內的溫度。在a/布里斯班/10/2007供體雪貂中在第2天和對于氣溶膠接觸而言在第7天，觀察到高體溫(圖27b)。攻擊前和攻擊后病毒施用溶液的濃度分別為107.50tcid50/ml和107.25tcid50/ml，從而指示攻擊材料在施用過程中的良好穩定性。圖50顯示了在病毒傳播研究中得自雪貂的鼻洗液中的病毒滴度。數據表明，m2ko(δtm)病毒沒有傳播(未檢測到病毒)，而對照brisb/10病毒傳播。結論本實施例表明，用a/布里斯班/10/2007病毒接種的雪貂表現出感染臨床征象(噴嚏、體重減輕和短暫體溫升高)，而用m2ko(δtm)病毒接種的雪貂沒有表現出疾病的臨床征象。因此，用m2ko(δtm)接種供體雪貂似乎不會經由接觸或經由氣溶膠造成感染或傳播病毒。這些發現表明，本技術的m2ko(δtm)病毒可用于鼻內流行性感冒疫苗。實施例13.m2ko(δtm)病毒會在小鼠中引起體液和粘膜免疫應答.本實施例證實，m2ko(δtm)病毒會在小鼠中引起體液和粘膜免疫應答。在小鼠中評價了m2ko(δtm)的免疫原性，并與由其它疫苗接種模式產生的免疫應答進行對比。如表22所示，進行含有以下組的免疫原性研究：1.m2ko(δtm)病毒，2.pr8病毒(10pfu)，代表性的活疫苗，3.滅活的pr8病毒(charlesriverlaboratories,wilmington,ma)，1μg，鼻內(in)，4.滅活的pr8病毒，1μg，肌肉內(im)，或僅pbs。表22：在免疫原性研究中的疫苗組免疫原遞送途徑劑量原理m2ko(δtm)病毒鼻內1x104pfu包含m2ko(δtm)(seqidno:1)突變pr8病毒鼻內10pfu代表與天然感染和/或活流感疫苗有關的免疫應答滅活的pr8，全病毒鼻內1μg證實由鼻內遞送的殺死的流感病毒產生的基線應答滅活的pr8，全病毒肌肉內1μg傳統的滅活流感疫苗的標準遞送途徑為了試驗m2ko(δtm)病毒的免疫原性，與肌肉內地施用1μg滅活的全pr8的組一起，給小鼠鼻內地接種1.2x104pfu的m2ko(δtm)、10pfu的野生型pr8、1μg滅活的全pr8(charlesriverlaboratories,wilmington,ma)或作為對照的pbs。免疫接種后3周，從小鼠收集血清和氣管-肺洗液，并通過酶聯免疫吸附測定(elisa)測量抗-pr8免疫球蛋白g(igg)和iga水平。簡而言之，用滅活的全pr8包被elisa平板，用牛血清白蛋白(bsa)封閉，并施加樣品。用辣根過氧化物酶標記的抗-小鼠igg-和iga-山羊抗體(kpl,inc.,gaithersburg,md)和surebluetmb(kpl,inc.)底物檢測小鼠igg和iga抗體。如預期的，與僅pbs組相比，免疫組中的小鼠表現出血清和氣管-肺洗液中的抗-pr8抗體的顯著升高(圖28)。m2ko(δtm)病毒組的血清中的抗-pr8igg水平高于滅活的pr8組，且類似于活pr8病毒。更重要的是，抗-pr8iga抗體僅存在于pr8和m2ko(δtm)免疫的小鼠的血清和氣管-肺洗液中。這些數據提示，m2ko(δtm)病毒會在小鼠中引起顯著的體液和粘膜免疫應答。實施例14m2ko(δtm)病毒會保護小鼠免于致命的同亞型和雜亞型攻擊.本實施例證實，m2ko(δtm)病毒會保護小鼠免于致命的同亞型和雜亞型攻擊。通過在免疫接種后6周用致死劑量的野生型pr8(h1n1；同亞型攻擊)或小鼠適應的甲型流感/aichi/2/68(aichi；h3n2；雜亞型攻擊)攻擊免疫的小鼠，評價了m2ko(δtm)病毒的保護效力。用m2ko(δtm)或10pfu的pr8免疫并隨后用野生型pr8攻擊的小鼠沒有表現出任何臨床癥狀，包括重量減輕(圖29a)。相比而言，原初pbs小鼠死亡，或者由于在第5天之前大于20％重量減輕而被安樂死。在攻擊后第3天，通過在mdck細胞中的tcid50測定，確定攻擊的小鼠的呼吸道中的病毒復制。如圖30a所示，在m2ko(δtm)或pr8免疫的小鼠的肺中沒有檢測出病毒(檢測限度102.75tcid50/器官)，從而指示m2ko(δtm)會提供與pr8感染類似的無菌免疫。相比而言，從滅活的pr8和pbs組回收到攻擊病毒。對于雜亞型攻擊，用aichi(h3n2)攻擊小鼠。m2ko(δtm)和野生型pr8免疫的小鼠度過攻擊，而接受滅活的pr8或pbs的小鼠發生感染(圖29)。在m2ko(δtm)-接種疫苗的小鼠中在攻擊后第3天在小鼠呼吸道中的病毒滴度與其它組中的小鼠相比沒有顯示出顯著下降(圖30)。這些結果提示，針對aichi攻擊觀察到的交叉保護可以部分地歸因于由m2ko(δtm)疫苗誘導的t-細胞介導的免疫應答。在得自攻擊的小鼠的攻擊后血清中，針對aichi的血凝集抑制(hi)抗體不是可檢測的(小于1:40)，從而提示保護不是由中和抗體介導。m2ko(δtm)病毒會刺激體液和細胞免疫應答，并賦予動物對抗致命的同亞型和雜亞型攻擊的保護性免疫，如表23所示。表23同亞型(h1n1)和雜亞型(h3n2)流感攻擊以后的保護實施例15相對于和的m2ko(δtm)疫苗本實施例證實了m2ko(δtm)病毒相對于活減毒病毒滅活流感疫苗的效力。用m2ko(δtm)病毒、冷適應的活減毒病毒滅活流感疫苗免疫小鼠，或用pbs假免疫。通過將甲型流感/布里斯班/10/2007-樣a/烏拉圭/716/2007(h3n2)的ha和na編碼序列插入m2ko(δtm)主鏈(seqidno:1)中，構建m2ko(δtm)-h3病毒。從2009/2010三價疫苗制劑噬斑純化即得自冷適應的a/aa/6/60主鏈的內部基因，其含有甲型流感/布里斯班/10/2007-樣a/烏拉圭/716/2007(h3n2)的ha和na基因。將2009/2010制劑直接地用作三價制劑。在免疫接種后第7、14、21天得到血清，以通過elisa對比抗體應答的動力學(圖31)。m2ko(δtm)-h3病毒(一種復制缺陷型病毒)比(以衰減的方式經歷多循環復制的活流感病毒疫苗)更早地形成抗體。滅活的疫苗具有最高血清抗體滴度，因為它是抗原的濃縮呈現。通過elisa評價了抗-ha粘膜抗體在血清、肺洗液和鼻甲中的存在。與滅活的疫苗相比，m2ko(δtm)-h3和(兩種活流感疫苗)在呼吸道中具有更高的iga(圖32)實施例16：由活病毒引起的保護和免疫原性的對比.在第0和28天用106tcid50/50μlm2ko(δtm)-h3(上述)、(2009-2010)(h3n2)ivr-147(pr8x布里斯班/10/2007)鼻內地感染6周齡雌性balb/c小鼠(用異氟烷麻醉)。ivr-147是m2ko(δtm)病毒的野生型形式；即含有功能性m2蛋白。假感染的對照小鼠接受50μlpbs替代病毒。每周從所有小鼠收集血清，并通過elisa分析抗-ha抗體的存在。如圖33所示，與相比，m2ko(δtm)病毒和ivr-147產生更高的抗體水平，具有快速動力學。監測動物的體重至感染后14天。接種疫苗的小鼠沒有減輕任何重量。在強化后第21天，將每組3只小鼠安樂死，并收集它們的氣管-肺洗液、鼻洗液和血清用于抗體滴度確定(圖34a-34c)。m2ko(δtm)誘導體液和粘膜抗體至與血清和呼吸道中的和ivr-147類似的水平。在強化后6周，用40mld50的a/aichi/2/68病毒鼻內地攻擊小鼠。觀察小鼠的體重減輕和存活持續14天(圖35a-35b)。m2ko(δtm)會保護小鼠免于致命的aichi攻擊，如相對于而言更少的體重減輕(組a)和100％存活(組b)所指示的。在攻擊后第3天，將每組3只小鼠安樂死，并收集它們的肺和鼻甲用于病毒滴度確定(表24)。m2ko(δtm)比更好地控制攻擊病毒，如表24所示。表24.呼吸道中的攻擊病毒滴度.實施例17：針對高度致病性的禽h5n1流感病毒的m2ko(δtm)疫苗的制備概要：m2ko(δtm)是缺乏功能性m2蛋白表達的流感病毒。m2蛋白對于流感病毒感染起始而言和對于病毒rna向后代病毒粒子中的有效整合而言是關鍵性的。m2ko(δtm)可以進入細胞和表達病毒蛋白，但是由于m2基因的缺失而不可制備感染性后代病毒。m2ko(δtm)在許可的m2蛋白表達細胞中生產，但是不在非許可的野生型細胞中生產。m2ko(δtm)會在小鼠中引起粘膜和體液免疫，并保護免于同亞型和雜亞型致命攻擊。h5n1m2ko(δtm)病毒在m2ko(δtm)主鏈上含有a/越南/1203/2004的ha(無毒性)和na基因。“m2ko(δtm)主鏈”是指包含m2ko(δtm)(seqidno:1)突變的pr8序列。使用的a/越南/1203/2004ha(無毒性)(seqidno:24)和na(seqidno:25)序列顯示在下面。>無毒性的vn1203haorf+pr8非編碼agcaaaagcaggggaaaataaaaacaaccaaaatggagaaaatagtgcttctttttgcaatagtcagtcttgttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaactcgacagagcaggttgacacaataatggaaaagaacgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaagaaacacaacgggaagctctgcgatctagatggagtgaagcctctaattttgagagattgtagcgtagctggatggctcctcggaaacccaatgtgtgacgaattcatcaatgtgccggaatggtcttacatagtggagaaggccaatccagtcaatgacctctgttacccaggggatttcaatgactatgaagaattgaaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcagatcatccccaaaagttcttggtccagtcatgaagcctcattaggggtgagctcagcatgtccataccagggaaagtcctcctttttcagaaatgtggtatggcttatcaaaaagaacagtacatacccaacaataaagaggagctacaataataccaaccaagaagatcttttggtactgtgggggattcaccatcctaatgatgcggcagagcagacaaagctctatcaaaacccaaccacctatatttccgttgggacatcaacactaaaccagagattggtaccaagaatagctactagatccaaagtaaacgggcaaagtggaaggatggagttcttctggacaattttaaagccgaatgatgcaatcaacttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaatatgcatacaaaattgtcaagaaaggggactcaacaattatgaaaagtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaatgggggcgataaactctagcatgccattccacaatatacaccctctcaccattggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcgactgggctcagaaatagccctcaaagagagactagaggattatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaatgagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtcaccaataaggtcaactcgatcattgacaaaatgaacactcagtttgaggccgttggaagggaatttaacaacttagaaaggagaatagagaatttaaacaagaagatggaagacgggttcctagatgtctggacttataatgctgaacttctggttctcatggaaaatgagagaactctagactttcatgactcaaatgtcaagaacctttacgacaaggtccgactacagcttagggataatgcaaaggagctgggtaacggttgtttcgagttctatcataaatgtgataatgaatgtatggaaagtgtaagaaatggaacgtatgactacccgcagtattcagaagaagcgagactaaaaagagaggaaataagtggagtaaaattggaatcaataggaatttaccaaatactgtcaatttattctacagtggcgagttccctagcactggcaatcatggtagctggtctatccttatggatgtgctccaatgggtcgttacaatgcagaatttgcatttaagattagaatttcagagatatgaggaaaaacacccttgtttctact>vn1203naorf+pr8非編碼agcaaaagcaggggtttaaaatgaatccaaatcagaagataataaccatcggatcaatctgtatggtaactggaatagttagcttaatgttacaaattgggaacatgatctcaatatgggtcagtcattcaattcacacagggaatcaacaccaatctgaaccaatcagcaatactaattttcttactgagaaagctgtggcttcagtaaaattagcgggcaattcatctctttgccccattaacggatgggctgtatacagtaaggacaacagtataaggatcggttccaagggggatgtgtttgttataagagagccgttcatctcatgctcccacttggaatgcagaactttctttttgactcagggagccttgctgaatgacaagcactccaatgggactgtcaaagacagaagccctcacagaacattaatgagttgtcctgtgggtgaggctccctccccatataactcaaggtttgagtctgttgcttggtcagcaagtgcttgccatgatggcaccagttggttgacgattggaatttctggcccagacaatggggctgtggctgtattgaaatacaatggcataataacagacactatcaagagttggaggaacaacatactgagaactcaagagtctgaatgtgcatgtgtaaatggctcttgctttactgtaatgactgacggaccaagtaatggtcaggcatcacataagatcttcaaaatggaaaaagggaaagtggttaaatcagtcgaattggatgctcctaattatcactatgaggaatgctcctgttatcctaatgccggagaaatcacatgtgtgtgcagggataattggcatggctcaaatcggccatgggtatctttcaatcaaaatttggagtatcaaataggatatatatgcagtggagttttcggagacaatccacgccccaatgatggaacaggtagttgtggtccggtgtcctctaacggggcatatggggtaaaagggttttcatttaaatacggcaatggtgtctggatcgggagaaccaaaagcactaattccaggagcggctttgaaatgatttgggatccaaatgggtggactgaaacggacagtagcttttcagtgaaacaagatatcgtagcaataactgattggtcaggatatagcgggagttttgtccagcatccagaactgacaggactagattgcataagaccttgtttctgggttgagttgatcagagggcggcccaaagagagcacaatttggactagtgggagcagcatatctttttgtggtgtaaatagtgacactgtgggttggtcttggccagacggtgccgagttgccattcaccattgacaagtagtctgttcaaaaaactccttgtttctacth5n1m2ko(δtm)的制備：基于每個基因的cdc序列(cdcid:2004706280，登錄號：ef541467和ef541403)，通過genesynthesis來化學合成a/越南/1203/2004(h5n1)的無毒性ha和na。確認構建體的序列，并亞克隆進適當的載體中，以允許使用標準方案制備種子病毒。在m2ck細胞(穩定表達m2蛋白的mdck細胞)中擴增m2ko(δtm)vn1203avha,na(h5n1m2ko(δtm))病毒，將上清液除去細胞碎片，并通過centriconplus-70(millipore)濃縮100倍。使用該病毒作為小鼠研究中的免疫原。小鼠研究設計：給小鼠(7-8周齡,雌性balb/c)鼻內地接種h5n1m2ko(δtm)(106tcid50/小鼠)、m2ko(δtm)ca07ha、na(106tcid50/小鼠)，或肌內地施用vn1203蛋白(1.5μg)。觀察體重和臨床癥狀至接種后14天。在接種后第7、14、21天，收集血清。在第28天強化小鼠，同時開始的新的僅激發組。強化免疫接種組和‘僅激發’組：在第28天，用106pfu/小鼠的第二次免疫接種，強化以前用h5n1m2ko(δtm)接種的小鼠。同時，給‘僅激發’組施用它們的第一劑量。在第28天接種以后，跟蹤所有組的重量減輕。接受強化劑量的m2ko(δtm)疫苗的小鼠減輕了它們的體重的至多5％。‘僅激發’組減輕了它們的體重的至多10％。表25.小鼠研究中的疫苗組h5n1m2ko(δtm)會引起針對ha的igg抗體滴度：在接種后第7、14、21天從小鼠得到血清，并通過elisa分析針對血凝素的抗體。m2ko(δtm)產生了比h5ha蛋白高至少100倍的滴度(圖36)。在第28天強化小鼠，并在1周后(第35天)得到血清。m2ko(δtm)滴度增強了130倍，而ha蛋白僅增強了13倍。m2ko(δtm)僅激發組在第35天的第一周抽血表現出與激發-加強組的第一周一樣高的igg滴度。用致死劑量的越南/1203/2004病毒(20mld50)攻擊小鼠。所有h5n1m2ko(δtm)接種疫苗的(僅激發和激發-強化)小鼠存活(圖54和55)。免疫接種后5個月攻擊的小鼠的高存活率提示，h5n1m2ko(δtm)疫苗會激發記憶應答。免疫接種后4周攻擊的小鼠僅接受一劑疫苗，從而指示m2ko(δtm)疫苗會刺激強免疫應答。h1n1pdmm2ko(δtm)免疫的小鼠也度過5個月后的h5n1攻擊，從而指示m2ko(δtm)會激發提供對抗異源攻擊的保護的交叉反應性免疫應答。實施例18:h1n1pdm：ca07相對于m2ko(δtm)ca07通過標準分子生物學方案，制備了a/加利福尼亞/07/2009(ca07)(h1n1pdm)的ha和nacdna克隆。使用標準方案，證實構建體的序列，并亞克隆進適當的載體中，以允許制備種子m2ko(δtm)病毒和m2wtca07/pr8病毒。在mdck細胞中從2011-2012疫苗批號b11k1802噬斑純化ca07(h1n1pdm)。使用的a/加利福尼亞/07/2009(ca07)ha(seqidno:26)和na(seqidno:27)序列顯示在下面。在m2ktmdel中的a/加利福尼亞/07/2009(h1n1)haagcaaaagcaggggaaaacaaaagcaacaaaaatgaaggcaatactagtagttctgctatatacatttgcaaccgcaaatgcagacacattatgtataggttatcatgcgaacaattcaacagacactgtagacacagtactagaaaagaatgtaacagtaacacactctgttaaccttctagaagacaagcataacgggaaactatgcaaactaagaggggtagccccattgcatttgggtaaatgtaacattgctggctggatcctgggaaatccagagtgtgaatcactctccacagcaagctcatggtcctacattgtggaaacacctagttcagacaatggaacgtgttacccaggagatttcatcgattatgaggagctaagagagcaattgagctcagtgtcatcatttgaaaggtttgagatattccccaagacaagttcatggcccaatcatgactcgaacaaaggtgtaacggcagcatgtcctcatgctggagcaaaaagcttctacaaaaatttaatatggctagttaaaaaaggaaattcatacccaaagctcagcaaatcctacattaatgataaagggaaagaagtcctcgtgctatggggcattcaccatccatctactagtgctgaccaacaaagtctctatcagaatgcagatgcatatgtttttgtggggtcatcaagatacagcaagamgttcaagccggaaatagcaataagacccaaagtgagggatcragaagggagaatgaactattactggacactagtagagccgggagacaaaataacattcgaagcaactggaaatctagtggtaccgagatatgcattcgcaatggaaagaaatgctggatctggtattatcatttcagatacaccagtccacgattgcaatacaacttgtcaaacacccaagggtgctataaacaccagcctcccatttcagaatatacatccgatcacaattggaaaatgtccaaaatatgtaaaaagcacaaaattgagactggccacaggattgaggaatatcccgtctattcaatctagaggcctatttggggccattgccggtttcattgaaggggggtggacagggatggtagatggatggtacggttatcaccatcaaaatgagcaggggtcaggatatgcagccgacctgaagagcacacagaatgccattgacgagattactaacaaagtaaattctgttattgaaaagatgaatacacagttcacagcagtaggtaaagagttcaaccacctggaaaaaagaatagagaatttaaataaaaaagttgatgatggtttcctggacatttggacttacaatgccgaactgttggttctattggaaaatgaaagaactttggactaccacgattcaaatgtgaagaacttatatgaaaaggtaagaagccagctaaaaaacaatgccaaggaaattggaaacggctgctttgaattttaccacaaatgcgataacacgtgcatggaaagtgtcaaaaatgggacttatgactacccaaaatactcagaggaagcaaaattaaacagagaagaaatagatggggtaaagctggaatcaacaaggatttaccagattttggcgatctattcaactgtcgccagttcattggtactggtagtctccctgggggcaatcagtttctggatgtgctctaatgggtctctacagtgtagaatatgtatttaacattaggatttcagaagcatgagaaaaaaacacccttgtttctact>在m2k0tmdel中的a/加利福尼亞/07/2009(h1n1)naagcaaaagcaggagtttaaaatgaatccaaaccaaaagataataaccattggttcggtctgtatgacaattggaatggctaacttaatattacaaattggaaacataatctcaatatggattagccactcaattcaacttgggaatcaaaatcagattgaaacatgcaatcaaagcgtcattacttatgaaaacaacacttgggtaaatcagacatatgttaacatcagcaacaccaactttgctgctggacagtcagtggtttccgtgaaattagcgggcaattcctctctctgccctgttagtggatgggctatatacagtaaagacaacagtgtaagaatcggttccaagggggatgtgtttgtcataagggaaccattcatatcatgctcccccttggaatgcagaaccttcttcttgactcaaggggccttgctaaatgacaaacattccaatggaaccattaaagacaggagcccatatcgaaccctaatgagctgtcctattggtgaagttccctctccatacaactcaagatttgagtcagtcgcttggtcagcaagtgcttgtcatgatggcatcaattggctaacaattggaatttctggcccagacaatggggcagtggctgtgttaaagtacaacggcataataacagacactatcaagagttggagaaacaatatattgagaacacaagagtctgaatgtgcatgtgtaaatggttcttgctttactgtaatgaccgatggaccaagtaatggacaggcctcatacaagatcttcagaatagaaaagggaaagatagtcaaatcagtcgaaatgaatgcccctaattatcactatgaggaatgctcctgttatcctgattctagtgaaatcacatgtgtgtgcagggataactggcatggctcgaatcgaccgtgggtgtctttcaaccagaatctggaatatcagataggatacatatgcagtgggattttcggagacaatccacgccctaatgataagacaggcagttgtggtccagtatcgtctaatggagcaaatggagtaaaagggttttcattcaaatacggcaatggtgtttggatagggagaactaaaagcattagttcaagaaacggttttgagatgatttgggatccgaacggatggactgggacagacaataacttctcaataaagcaagatatcgtaggaataaatgagtggtcaggatatagcgggagttttgttcagcatccagaactaacagggctggattgtataagaccttgcttctgggttgaactaatcagagggcgacccaaagagaacacaatctggactagcgggagcagcatatccttttgtggtgtaaacagtgacactgtgggttggtcttggccagacggtgctgagttgccatttaccattgacaagtaatttgttcaaaaaactccttgtttctact給小鼠(7-8周齡,雌性balb/c)鼻內地接種m2ko(δtm)ca07(106tcid50/小鼠)、m2wtca07(106tcid50/小鼠)、ca07(106tcid50/小鼠)或作為原初對照的opti-memtm。觀察體重和臨床癥狀至接種后14天。圖37表明，m2ko(δtm)和接種疫苗的小鼠沒有減輕重量，而含有wtm2的病毒減輕重量且發生和感染。這些結果證實，m2基因的缺失會使該病毒減毒，且m2ko(δtm)是減毒的。圖38顯示了m2ko(δtm)、flumist、和m2野生型病毒滴度肺和鼻終止。在疫苗接種后第3天收獲肺和鼻甲，用于細胞上的病毒滴定。在m2ko(δtm)免疫的小鼠中，在肺或鼻甲中沒有檢測到病毒。相比而言，確實具有在肺和鼻甲中的病毒復制，盡管在比野生型病毒更低的水平。圖39通過elisa確定了在接種后第7、14和21天收集的血清中的m2ko(δtm)和滴度和抗-haigg滴度。m2ko(δtm)誘導更高的應答，其比應答更早地檢測到。在第21天之前，2種病毒達到峰抗體水平。圖40顯示了用40mld50的異源病毒、小鼠適應的甲型流感/aichi/2/1968(h3n2)免疫接種后12周攻擊的小鼠的存活百分比。觀察體重變化和臨床癥狀至攻擊后14天。所有m2ko(δtm)(h1n1pdmha,na)免疫的小鼠被保護免于aichi(h3n2)攻擊，而僅80％的(h1n1pdmha,na)受到保護。存活的小鼠減輕了它們的體重的接近20％，而m2ko(δtm)小鼠減輕了它們的體重的約10％。表26顯示了在攻擊后第3天收集的肺和鼻甲的病毒滴度。m2ko(δtm)和控制肺和鼻甲中的攻擊病毒復制至類似水平，而原初小鼠表現出肺和鼻甲中高1個對數的病毒滴度。支氣管肺泡灌洗(bal)的細胞的細胞內染色.攻擊后3天收集bal，并通過流式細胞計量術用免疫染色的表面標志物染色，以檢測cd8+cd4+、cd8+cd4-、cd8-cd4+、cd8-cd4-細胞群體。在接種疫苗的小鼠中的cd4+和cd8+細胞群體與原初小鼠相比更大，指示m2ko(δtm)激發與類似的細胞應答。m2ko(δtm)接種疫苗的小鼠具有比更大的cd8+cd4-細胞群體(49％相對于40％)(圖41)。表26小鼠的呼吸道的病毒滴度實施例19相對于和野生型病毒的m2ko(δtm)mrna表達在某些實施方案中，在穩定地反式提供m2蛋白的細胞中生產m2ko(δtm)病毒，從而產生在病毒膜中具有功能性m2蛋白、但是在它的基因組中不編碼m2的病毒。因此，我們假定，m2ko(δtm)病毒與正常細胞中的野生型病毒的初始感染和第一輪復制類似地表現。我們提議，病毒抗原的mrna水平與感染早期的野生型水平類似，并且比減毒的復制病毒疫苗更快地刺激有效免疫應答。以0.5的感染復數用m2ko(δtm)、和野生型病毒感染人肺癌(a549)細胞。通過用pbs洗滌5次，除去未吸附的病毒。加入病毒生長培養基以后，將受感染的細胞置于35℃co2培養箱中。沒有向生長培養基加入胰蛋白酶，以確保所有病毒的單個循環復制。收獲細胞單層，并在感染后4、9和22小時提取rna。將得自對照和受感染的a549細胞的總rna(100ng)用于定量rt-pcr分析。用寡-dt引物和superscriptii逆轉錄酶(invitrogen)合成cdna，并通過實時定量pcr分析使用早期流感基因m1和晚期流感基因ha和細胞因子ip-10基因的基因特異性引物進行定量。根據生產商的說明書，使用sybrgreen試劑(invitrogen,carlsbad)進行反應。使用持家基因γ-肌動蛋白和樣品基因的系列10倍稀釋，計算反應效率。在abi7300實時pcr系統(appliedbiosystems,fostercity,ca,usa)上進行反應，使用的熱方案是：階段1:50℃保持30min；階段2:95℃保持15min；階段3:94℃保持15秒，55℃保持30秒；和72℃保持30秒，重復30個循環。將所有定量(閾值循環[ct]值)標準化為持家基因的值以產生δct，并且將樣品的δct值和參照(野生型樣品)的δct值之間的差異計算為-δδct。將mrna表達的相對水平表達為2-δδct。在感染后4小時，就h3(表27)、pr8(表28)和h1n1pdm(圖42)而言，m2ko(δtm)病毒hamrna表達類似于野生型m2病毒。由于更緩慢的復制動力學，冷適應的在早期時間點小于野生型和m2ko(δtm)。在m1(早期時間點基因)時，試驗了mrna表達，觀察到類似的結果(表27,圖42)。這些結果提示，m2ko(δtm)在早期感染循環中產生類似水平的mrna，以從頭產生病毒抗原，所述抗原產生與野生型病毒類似的‘危險信號’并誘導有效免疫應答。表27.h3ha基因的相對mrna表達.表28.pr8ha和m1基因的相對mrna表達.實施例20：m2vero生產細胞的制備通過標準分子技術，將pr8病毒的m2基因克隆進表達載體pcmv-sc(stratagene,lajolla,ca)中，以制備pcmv-pr8-m2。用ecor1消化質粒以證實300bpm2基因和4.5kb載體的存在，如圖43所示。確認含有m2基因插入片段的質粒的序列，如圖44a-44d所示。m2vero細胞的制備：根據生產商的說明書，使用transit-lt1轉染試劑(mirus)，將以前描述的且含有新霉素抗性基因的pcmv-pr8-m2質粒轉染進vero細胞(atccccl-81)。簡而言之，在轉染前一天，以5x105個細胞/100-mm盤將vero細胞鋪板。在第1天，將10μg質粒dna與20μgtransit-lt1在0.3mloptimem(invitrogen)中混合，并與這些細胞一起在37℃在5％co2溫育過夜。在第2天，用完全培養基替換轉染混合物，所述完全培養基是補充了5％新生小牛血清的改良伊格爾培養基(mem)。所述培養基還含有1mg/ml遺傳霉素(invitrogen)，即用于選擇表達新霉素蛋白的哺乳動物細胞的廣譜抗生素。抗性細胞(穩定地表達m2基因的vero細胞)開始在選擇培養基中生長，用新鮮選擇培養基替代該培養基，并通過在tc-96平板中的有限稀釋來分離遺傳霉素抗性的克隆。使用m2特異性的單克隆抗體14c2(santacruzbiotechnology)，通過免疫染色證實m2蛋白的表面表達。用m2ko(δtm)病毒感染親本和修飾的m2vero細胞：通過用m2ko(δtm)-pr8病毒感染，試驗了m2vero細胞的充當m2ko(δtm)病毒的生產細胞的能力。簡而言之，使用標準流感感染操作，用m2ko(δtm)-pr8病毒的10倍系列稀釋物(10-1-10-6)感染單層m2vero和親本vero細胞。將受感染的細胞在35℃溫育，并每天觀察細胞病變效應(cpe)。僅m2vero細胞表現出指示病毒生長的cpe。在第4天從10-3孔收獲上清液，并通過tcid50測定在穩定表達m2基因的mdck細胞(m2ck)上確定病毒滴度。在m2vero細胞上生長的m2ko(δtm)-pr8病毒滴度為106.75tcid50/ml，從而指示m2vero細胞可以充當用于制備m2ko(δtm)疫苗的生產細胞。實施例21：流行性感冒疫苗的真皮內遞送本實施例證實了當肌內地(im)、真皮內地(id)和使用皮下微型針裝置(諸如在公開的美國專利申請2011/0172609中描述的裝置)施用時，季節性流行性感冒疫苗flulaval(2011-2012制劑)的免疫原性。在第0天給無毛豚鼠接種，并在第30天強化選定的組。在第0、30和60天收集血清，并通過酶聯免疫吸附測定(elisa)分析血凝素特異性的igg應答。結果顯示在圖51-53中。數據顯示了針對在季節性流行性感冒疫苗flulaval中配制的3個株的抗體水平的定性吸光度：a/加利福尼亞/7/2009nymcx-181、a/維多利亞/210/2009nymcx-187(a/珀斯/16/2009-樣病毒)和b/布里斯班/60/2008。在第30天，im和id遞送產生了針對所有病毒ha的相同igg應答。id僅激發組在第60天表現出更高的滴度，這提示，id遞送誘導針對所有病毒ha的持久免疫。序列表<110>復爾健有限公司<120>流感病毒突變體及其用途<130>cn1312550fpc<140>pct/us2012/043606<141>2012-06-21<150>us61/501,034<151>2011-06-24<160>33<170>patentin3.5版<210>1<211>976<212>dna<213>甲型流感病毒<400>1agcaaaagcaggtagatattgaaagatgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtacgtact60ctctatcatcccgtcaggccccctcaaagccgagatcgcacagagacttgaagatgtctt120tgcagggaagaacaccgatcttgaggttctcatggaatggctaaagacaagaccaatcct180gtcacctctgactaaggggattttaggatttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcg240aggactgcagcgtagacgctttgtccaaaatgcccttaatgggaacggggatccaaataa300catggacaaagcagttaaactgtataggaagctcaagagggagataacattccatggggc360caaagaaatctcactcagttattctgctggtgcacttgccagttgtatgggcctcatata420caacaggatgggggctgtgaccactgaagtggcatttggcctggtatgtgcaacctgtga480acagattgctgactcccagcatcggtctcataggcaaatggtgacaacaaccaatccact540aatcagacatgagaacagaatggttttagccagcactacagctaaggctatggagcaaat600ggctggatcgagtgagcaagcagcagaggccatggaggttgctagtcaggctagacaaat660ggtgcaagcgatgagaaccattgggactcatcctagctccagtgctggtctgaaaaatga720tcttcttgaaaatttgcaggcctatcagaaacgaatgggggtgcagatgcaacggttcaa780gtgattaataggatcgtctttttttcaaatgcatttaccgtcgctttaaatacggactga840aag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