【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種花生轉(zhuǎn)錄因子ahj11-far1-5基因的克隆及功能表達(dá)方法。

背景技術(shù)：

我國(guó)是世界花生生產(chǎn)大國(guó)，種植面積居世界第二位，而總產(chǎn)量占世界花生總產(chǎn)量的40％以上，居世界第一位。但是，花生產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展受到旱災(zāi)的威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年因干旱引起的花生減產(chǎn)達(dá)30％～50％。除產(chǎn)量下降外，干旱還有可能導(dǎo)致花生黃曲霉毒素污染、品質(zhì)下降等一系列后果。此外，隨著干旱氣候出現(xiàn)頻率的增加，如果在逆境脅迫下保持甚至增加花生的產(chǎn)量，成為科學(xué)研究的一個(gè)方向。

隨著科技的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物脅迫耐受能力的研究取得了巨大進(jìn)步。當(dāng)脅迫信號(hào)產(chǎn)生后，花生會(huì)啟動(dòng)一系列相應(yīng)信號(hào)，最后傳導(dǎo)到相關(guān)基因，啟動(dòng)該基因表達(dá)以協(xié)助花生適應(yīng)或抵御逆境。轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控這些基因表達(dá)的重要因素。轉(zhuǎn)錄因子是指能夠與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用的dna結(jié)合蛋白，通過(guò)它們之間以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用，調(diào)控基因的表達(dá)。

farl作為phya信號(hào)通路的正調(diào)控因子，1999年通過(guò)圖位克隆得到(hudsoneta1.1999)。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)錄因子含有一個(gè)與玉米mutator家族的轉(zhuǎn)座酶mura(hudsoneta1.2003)以及轉(zhuǎn)座酶jittery相似的序列(lisch，2002；xuetal.2004)。作為一個(gè)起源進(jìn)化于轉(zhuǎn)座子的基因新家族，farl能夠穩(wěn)定地存在于擬南芥基因組中，且沒(méi)有檢測(cè)到顯著的末端反向重復(fù)序列(tir)和其他的轉(zhuǎn)座子類(lèi)似結(jié)構(gòu)(hudsoneta1.2003)。farl和mutator類(lèi)似的轉(zhuǎn)座子擁有相似的結(jié)構(gòu)，包括n端c2h2鋅指結(jié)構(gòu)域，中部推測(cè)的轉(zhuǎn)座子核心結(jié)構(gòu)域以及c端swim鋅指結(jié)構(gòu)域。其中n端c2h2結(jié)構(gòu)域具有dna結(jié)合活性，c端結(jié)構(gòu)域具有轉(zhuǎn)錄激活活性。基于這種進(jìn)化過(guò)程，farl成為了一種新型的轉(zhuǎn)錄因子，能夠特異的識(shí)別fbs(fhy3-bindingmotif，cacgcgc)順式作用元件(lineta1.2007)，因此能夠與啟動(dòng)子上含有fbs序列的基因特異性結(jié)合，調(diào)控它們的表達(dá)，行使生物學(xué)功能。到目前為止，花生中farl基因的研究報(bào)道較少，關(guān)于其功能的研究報(bào)道更少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種花生轉(zhuǎn)錄因子ahj11-far1-5基因的克隆及功能表達(dá)方法，顯著提高花生的抗干旱能力。

本發(fā)明提供了一種花生轉(zhuǎn)錄因子ahj11-far1-5基因的克隆方法，主要包括以下步驟：

(a)材料的準(zhǔn)備與處理，其包括花生種子的萌發(fā)、生長(zhǎng)以及干旱脅迫處理。具體步驟如下：材料選擇花生品種j11，花生種子在hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)萌發(fā)，萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)條件為14h光照/10h黑暗，溫度為26-28℃，生長(zhǎng)12天用于后續(xù)的干旱脅迫處理；

干旱脅迫用peg6000處理，花生根浸泡在15％peg6000溶液中，在處理0h、6h、12h、18h、24h、36h和48h時(shí)取花生的根作為材料，所有材料均保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

(b)花生幼苗的rna的提取和cdna的合成

其具體步驟如下：用takara的minibestuniversalrnaextractionkit試劑盒方法分離提取花生幼苗rna，將得到的rna去除dna污染后再進(jìn)行cdna合成，用smart-race試劑盒方法進(jìn)行cdna合成，之后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫陨纤闷髅蠖夹杞?jīng)過(guò)去除rna酶處理。器皿用0.1％的depc浸泡12小時(shí)，然后高壓滅菌去除。溶液試劑用0.1％的depc處理(37℃放置12小時(shí)后高壓消毒)，不耐高溫的試劑直接用depc-h2o配制。

(c)通過(guò)race進(jìn)行克隆

具體步驟如下:

race所用試劑盒為clontech的smart-race試劑盒，race擴(kuò)增基因全長(zhǎng)所用引物為3-gps-ahj11-far1-5:5’-cgtgctgagggtgcagaaatga-3’、5-1-ahj11-far1-5:5’-tgttgcccgccgagaaagatg-3’、5-2-ahj11-far1-5:5’-cgtagcaacgcccttgatctgtt-3’、5-3-ahj11-far1-5:5’-atccgacatcatctcaccatccac-3’和ngps-ahj11-far1-5：5’-gtataatcagtcactgggaag-3。

race克隆產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后用uniq-10pcrpurificationkit試劑盒(上海生工)回收純化。純化產(chǎn)物與pgem-teasy載體(北京全是金生化科技有限公司)連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌(北京全是金生化科技有限公司)中，lb培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液pcr擴(kuò)增預(yù)檢測(cè)是否有插入片段并測(cè)序。

將測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行拼接后設(shè)計(jì)全長(zhǎng)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，用uniq-10pcrpurificationkit試劑盒純化，純化產(chǎn)物與pgem-teasy載體連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，lb培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液pcr擴(kuò)增預(yù)檢測(cè)是否有插入片段并測(cè)序，擴(kuò)增引物為ahj11-far1-5-s1：5’-cgcagtggtttccaatggattt-3’和ahj11-far1-5-s2：5’-gccacacctgggttggtggacccc-3’。

進(jìn)一步的，所述全長(zhǎng)pcr擴(kuò)增所用聚合酶為takarapcrmix，在20μl體系中加入以下成分：10μltakarapcrmix、1μl總cdna、0.5μlahap2er-s1、0.5μlahap2er-s2和8μl無(wú)菌雙蒸水；

全長(zhǎng)pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件：a)94℃5min；(b)94℃1min；57℃1min；72℃4min；共30cycles；(c)72℃10min。

進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的ahj11-far1-5基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?727bp，共編碼908個(gè)氨基酸。

進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的ahj11-far1-5基因的氨基酸序列在ncbi網(wǎng)站上通過(guò)blast分析后發(fā)現(xiàn)該基因氨基酸序列與arachisipaensis的far1-5蛋白(xp_016184350.1)的相似性為94％、arachisduranens相關(guān)蛋白(xp_015950391.1))的相似性為68％，見(jiàn)圖1。

進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的ahj11-far1-5基因的核苷酸序列是序列表中sequence1。

進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的ahj11-far1-5基因的氨基酸序列是序列表中sequence2。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述花生轉(zhuǎn)錄因子ahj11-far1-5基因的功能表達(dá)方法，其使用熒光定量rt-pcr對(duì)ahj11-far1-5基因干旱下的表達(dá)進(jìn)行分析，其方法如下：

熒光定量rt-pcr所用cdna模板稀釋到8ng/μl，用的聚合酶是sybrgreen，采用的儀器是7500fast熒光定量pcr儀，每反應(yīng)體系加2μl稀釋的cdna；

pcr反應(yīng)程序如下：(a)95℃，10s；(b)95℃，5s；(c)60℃，30s；(d)72℃，10s；40個(gè)循環(huán)；繪制溶解曲線，溫度增加梯度為每10s增加0.5℃，actin為rt-pcr的內(nèi)參基因。

所述的ahj11-far1-5熒光定量用的引物序列為：ahj11-far1-5-r：5’-aggactacttcaagatgtg-3’和ahj11-far1-5-f:5’-gctgttacttcattattacga-3’。

所述的內(nèi)參基因actin所用引物序列為：actin-f:5’-gaggagaagcagaagcaagttg-3’和actin-r:5’-agacagcatatcggcactcatc-3’。

本發(fā)明通過(guò)熒光定量pcr驗(yàn)證了ahj11-far1-5基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果表明該基因干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄水平均有明顯升高。從圖2可以看出，該基因在干旱脅迫處理后相對(duì)表達(dá)量一直處于上升的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明ahj11-far1-5基因在花生對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用。將該基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段導(dǎo)入花生中，轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的抗旱特性，說(shuō)明ahj11-far1-5基因能顯著提高花生抗旱性。

【附圖說(shuō)明】

圖1是花生ahj11-far1-5蛋白與其他花生中far1-5類(lèi)蛋白氨基酸序列比較；

圖2是花生ahj11-far1-5基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式分析。

【具體實(shí)施方式】

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)路線做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限定。

1.1實(shí)施材料：

材料準(zhǔn)備與處理：材料選擇花生品種j11，花生種子在hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)萌發(fā)，萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)條件為14h光照/10h黑暗，溫度為26℃，生長(zhǎng)12天用于后續(xù)的干旱脅迫處理。干旱脅迫用peg6000處理。花生根浸泡在15％peg6000溶液中，在處理0h，6h，12h，18h，24h，36h和48h時(shí)取花生的根作為材料，所有材料均保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2rna的提取和cdna的合成

所用器皿都需經(jīng)過(guò)去除rna酶處理。器皿用0.1％的depc浸泡12小時(shí)，然后高壓滅菌去除。溶液試劑用0.1％的depc處理(37℃放置12小時(shí)后高壓消毒)，不耐高溫的試劑直接用depc-h2o配制。總rna提取按takara的minibestuniversalrnaextractionkit的操作要求單鏈cdna合成，具體參照clontech的smart-race試劑盒方法。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3ahj11-far1-5基因克隆

通過(guò)race進(jìn)行克隆，race所用試劑盒為clontech的smart-race試劑盒方法參照試劑盒說(shuō)明。race擴(kuò)增基因全長(zhǎng)所用引物為3-gps-ahj11-far1-5:5’-cgtgctgagggtgcagaaatga-3’、5-1-ahj11-far1-5:5’-tgttgcccgccgagaaagatg-3’、5-2-ahj11-far1-5:5’-cgtagcaacgcccttgatctgtt-3’、5-3-ahj11-far1-5:5’-atccgacatcatctcaccatccac-3’和ngps-ahj11-far1-5：5’-gtataatcagtcactgggaag-3。

race克隆產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后用uniq-10pcrpurificationkit試劑盒(上海生工)回收純化。純化產(chǎn)物與pgem-teasy載體(北京全是金生化科技有限公司)連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌(北京全是金生化科技有限公司)中，lb培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液pcr擴(kuò)增預(yù)檢測(cè)是否有插入片段并測(cè)序(sangon，shanghai)。

將測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行拼接后設(shè)計(jì)全長(zhǎng)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，pcr擴(kuò)增所用的聚合酶為takarapcrmix，在20μl體系中加入以下成分10μltakarapcrmix，1μl總cdna，0.5μlahap2er-s1，0.5μlahap2er-s2，8μl無(wú)菌雙蒸水。反應(yīng)條件：94℃5min→(94℃1min→57℃1min→72℃4min)30cycles→72℃10min。uniq-10pcrpurificationkit試劑盒(上海生工)回收純化。純化產(chǎn)物與pgem-teasy載體(北京全是金生化科技有限公司)連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌(北京全是金生化科技有限公司)中，lb培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液pcr擴(kuò)增預(yù)檢測(cè)是否有插入片段并測(cè)序(sangon,shanghai)。

擴(kuò)增引物：ahj11-far1-5-s1：5’-cgcagtggtttccaatggattt-3’和ahj11-far1-5-s2：5’-gccacacctgggttggtggacccc-3’。

1.4熒光定量pcr

用熒光定量pcr對(duì)ahap2er基因進(jìn)行功能表達(dá)：熒光定量pcr所用cdna模板稀釋到8ng/μl，用的聚合酶是sybrgreen，用的儀器是7500fast熒光定量pcr儀(abi公司)，每反應(yīng)體系加2μl稀釋的cdna；pcr反應(yīng)程序如下：95℃10s；95℃5s，60℃30s，72℃10s，40個(gè)循環(huán)；繪制溶解曲線，溫度每10s升高0.5℃。以2-δδct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。actin為rt-pcr的內(nèi)參基因。

ahj11-far1-5基因熒光定量rt-pcr用的引物序列為：ahj11-far1-5-r：5’-aggactacttcaagatgtg-3’和ahj11-far1-5-f:5’-gctgttacttcattattacga-3’。

內(nèi)參基因actin所用引物序列為：actin-f:5′-gaggagaagcagaagcaagttg-3′；和actin-r:5′-agacagcatatcggcactcatc-3′。

2試驗(yàn)結(jié)果

2.1ahj11-far1-5核苷酸全長(zhǎng)及其編碼的氨基酸序列

通過(guò)pcr擴(kuò)增及測(cè)序，得到了目的基因，該基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?727bp，共編碼908個(gè)氨基酸。圖1顯示了將該基因的氨基酸序列在ncbi網(wǎng)站上通過(guò)blast分析后發(fā)現(xiàn)該基因氨基酸序列與arachisipaensis的far1-5蛋白(xp_016184350.1)的相似性為94％、arachisduranens相關(guān)蛋白(xp_015950391.1)的相似性為68％，故將該基因命名為ahj11-far1-5(arachishypogaeaj11far1-5-liketranscriptionfactor)。

圖2是花生ahj11-far1-5基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式分析。本發(fā)明通過(guò)熒光定量pcr驗(yàn)證了ahj11-far1-5在干旱脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果表明：該基因干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄水平均有明顯升高。從圖2可以看出，干旱脅迫處理后相對(duì)表達(dá)量一直處于上升的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明ahj11-far1-5基因在花生對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用。將該基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段導(dǎo)入花生中，轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照具有明顯的抗旱特性，說(shuō)明ahj11-far1-5基因能顯著提高花生抗旱性。

以上所述，僅是本發(fā)明的最佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍情況下，利用上述揭示的方法內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，均屬于權(quán)利要求書(shū)保護(hù)的范圍。