本發(fā)明食品技術領域，具體涉及一種酶法水解紅花籽油富集不飽和脂肪酸工藝。

背景技術：

紅花籽是菊科紅花屬植物，在食品行業(yè)中逐漸發(fā)展使用。近年來對多不飽和脂肪酸(PUFA)食品的開發(fā)研究已成為熱點。紅花籽油是我國的特有油種，其不飽和脂肪酸含量可高達90％，亞油酸(ω-6)含量高達75％以上，有“亞油酸之王”之稱^[1]。

功能性油脂因具有抗癌、減肥、調節(jié)免疫等作用而成為藥品和食品等領域的研究熱點。多不飽和脂肪酸(PUFA)已被普遍證明具有免疫調節(jié)和預防心腦血管疾病功能，特別是亞油酸可預防或減少心腦血管疾病的發(fā)病率，具有“血管清道夫”的美譽^[2]。魚油中的PUFA類含量通常在15％-25％之間，這樣低的含量并不能滿足現代保健品的要求，同時魚油中PUFA多為非甘油酯型(主要是乙酯型和游離型)，PUFA乙酯型在人體中消化和吸收比較困難，可能存在安全隱患；游離型PUFA雖易于被人體消化和吸收，但易氧化產生過氧化物，且有酸味、口感不好，難以接受。紅花籽油均以天然安全的甘油三酯形式存在，易于被人體消化吸收，是人類天然安全的多不飽和脂肪酸重要來源之一，已被許多國家推選為優(yōu)質的食用油^[3-4]。

水酶法是近年來在植物油脂提取中被廣泛應用，該技術是利用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶等處理干燥破碎的油料，破壞油料組織中油體結構，繼而分離出油脂^[7-9]，與壓榨法和浸出法提取的油脂相比在營養(yǎng)、安全方面突出，但油料中脂蛋白、脂多糖等復合體過多，使料液乳化現象嚴重，出油率較低，且多種酶的添加使生產成本過高，難以實現工業(yè)化。

脂肪酶水解富集法是利用脂肪酶催化水解過程中對不同脂肪酸的選擇性，飽和脂肪酸易被水解，不飽和脂肪酸不易被水解，不飽和度越高的脂肪酸越不易被水解。因此利用脂肪酶水解紅花籽油，去除飽和脂肪酸，有效地提高了PUFA甘油酯的含量，使油脂的營養(yǎng)和功能性得到有效的提高。劉艷國、鄭毅等人脂肪酶法富集魚油中EPA和DHA甘油酯，通過單因素實驗和響應面分析得到最佳酶解條件，使富集后總含量從7.3％提高到21.5％。這些試驗均說明脂肪酶水解富集法在富集PUFA在是可行的。隨著酶固定化技術的發(fā)展，酶法將會成為未來油脂提取工業(yè)發(fā)展方向之一^[12]。

技術實現要素：

本發(fā)明提供一種酶法水解紅花籽油富集不飽和脂肪酸工藝，以提取的紅花籽油為原料，采用脂肪酶水解富集法紅花籽油中的PUFA，為開發(fā)高值化、工業(yè)化生產紅花籽油提供技術參考。

本發(fā)明所采用的技術方案是：

一種酶法水解紅花籽油富集不飽和脂肪酸工藝，所述工藝包括以下步驟：

1)將紅花籽油中加入酶，酶解，滅酶，得到物料1；

2)物料1離心得到上清油脂和下層乳化層；

3)將步驟2)得到的下層乳化層進行破乳處理后離心得到上層游離油；

4)合并步驟2)得到的上清油脂和步驟3)得到的上層游離油，加入抗氧化劑；

完成酶法水解紅花籽油富集不飽和脂肪酸。

優(yōu)選地，所述步驟1)紅花籽油的提取方法為75～85℃烘干恒重的紅花籽用粉碎機粉碎，過篩，加入石油醚，30～38℃超聲15～25min后，4000～5000rpm平衡離心3～8min，收集上清，旋轉蒸發(fā)得到紅花籽油。

優(yōu)選地，所述步驟1)酶為米曲霉脂肪酶或假絲酵母脂肪酶或胰脂肪酶或南極假絲酵母脂肪酶B。

優(yōu)選地，所述步驟1)的酶在進行酶解還有前處理工藝，所述前處理工藝為：酶置于超聲功率190～225W、超聲頻率15～25kHz、超聲時間與間歇時間比為1：1、超聲處理3～7min后，再于35～45℃、110～180MPa、處理5～15min。

優(yōu)選地，所述步驟1)酶解條件為pH值6.5～7.5、溫度30～40℃、酶添加量240～360u/g、酶解2～3h。

進一步優(yōu)選地，所述步驟1)米曲霉脂肪酶，酶解條件為pH值7、溫度40℃、酶添加量300u/g、酶解3h。

優(yōu)選地，所述步驟1)滅酶方法為100℃沸水中水浴4～5min。

優(yōu)選地，所述步驟2)離心條件4000-6000r/min真空離心10-18min。

優(yōu)選地，所述步驟3)破乳處理方法為首先將乳化層進行冷凍處理，然后經過冷凍處理的乳化液經超聲波、微波協同處理，再加破乳劑處理后離心得到上層游離油；

所述冷凍處理條件為-25～-30℃條件冷凍15-26h；

所述超聲波、微波協同處理條件為超聲波功率300-400w、超聲頻率15～25kHz、微波150-250w協同至乳化液解凍升至20-30℃；

所述破乳劑處理條件為添加乳狀液質量0.05％-0.08％的破乳劑破乳10-25min。

進一步優(yōu)選地，所述破乳劑為甘露聚糖：黃原膠：鼠李糖：烷基糖苷按質量比為2～4:0.2～0.5:1～3:1～4的生物破乳劑。

優(yōu)選地，所述步驟4)加入抗氧化劑3％維生素C或茶多酚或生育酚作為抗氧化劑。

本發(fā)明有益效果：

1、本發(fā)明脂肪酶主要是通過反應有效分離油脂中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸，在低溫、冷凍離心的過程中，使得飽和脂肪酸冷凍凝固，不飽和脂肪酸得以分離出來。此方法便捷，又加大了不飽和脂肪酸的提取率。通過優(yōu)化酶解富集過程中酶的種類、酶解的溫度、pH值、時間和酶的添加量，提高不飽和脂肪酸的提取率。

2、氣質色譜檢測表明：采用本發(fā)明方法后紅花籽油不飽和脂肪酸提取率達到92％以上，比酶解前提高了22.24％，其中的亞油酸酶解后提高了7％。

3、本發(fā)明方法與傳統的水酶法不同之處在于，先得到紅花籽油再進行酶解處理得到不飽和脂肪酸，酶解后乳液與油脂能有效分離，成本更低，酶解后不飽和脂肪酸含量高，今后通過固定化酶技術降低用酶成本可實現工業(yè)化生產。

4、采用超聲波、超高壓處理對酶進行前處理可使酶的活性中心更暴露，底物結構更松散，促進酶與底物的結合，降低了酶解反應的活化能，加速傳質，降低了底物和產物對反應的抑制作用，提高酶的催化活性和酶反應速度，從而促進脂肪酶選擇性水解甘油脂上飽和脂肪酸。

5、采用脂肪酶水解富集紅花籽油提取脂肪酸，分離純化不飽和脂肪酸，通過冷凍離心、低溫分離、破乳處理和抗氧化劑，有效分離不飽和脂肪酸防止氧化變質。

6、本發(fā)明冷凍處理、超聲波、微波及破乳劑結合處理，并將破乳與離心有機結合，可使乳化層中的游離脂肪酸充分分離，得到澄清透明的游離脂肪酸。

附圖說明

圖1不同脂肪酶酶解對不飽和脂肪酸提取率的影響；

圖2溫度對不飽和脂肪酸提取率的影響；

圖3時間對不飽和脂肪酸提取率的影響；

圖4 pH值對不飽和脂肪酸提取率的影響；

圖5酶加量對不飽和脂肪酸含量的影響；

圖6交互作用對不飽和脂肪酸提取率的響應面圖；

圖7紅花籽油中脂肪酸氣相色譜；

圖8紅花籽油中脂肪酸質譜圖；

圖9酶解后紅花籽油脂肪酸氣相色譜圖；

圖10酶解后紅花籽油脂肪酸質圖譜。

具體實施方式

下面結合實施案例及附圖來進一步說明本發(fā)明，但實施案例不會構成對本發(fā)明的限制。

實施例1

一種酶法水解紅花籽油富集不飽和脂肪酸工藝，所述工藝包括以下步驟：

1)將紅花籽油中加入酶，酶解，滅酶，得到物料1；

2)物料1冷凍離心得到上層游離油，

完成酶法水解紅花籽油富集不飽和脂肪酸。

所述步驟1)紅花籽油的提取方法為80℃烘干恒重的紅花籽用粉碎機粉碎，過篩，加入石油醚，35℃超聲20min后，5000rpm平衡離心5min，收集上清，旋轉蒸發(fā)得到紅花籽油。

所述步驟1)滅酶方法為100℃沸水中水浴5min。

所述步驟2)離心條件-25℃、5000r/min、離心15min。

脂肪酶的篩選

四種脂肪酶按表1在相同酶用量，和各自最適溫度及pH值條件下水解紅花籽油后，測定不飽和脂肪酸提取率，結果如圖1所示。

表1不同脂肪酶酶解條件

由圖1可知，酶含量相同的條件下，四種酶中假絲酵母脂肪酶與米曲霉脂肪酶對油脂水解效果較好，但假絲酵母脂肪酶在價錢上較為貴，為了節(jié)約成本合理利用資源，故選擇米曲霉脂肪酶作為最佳水解酶。

溫度對不飽和脂肪酸提取率的影響

在酶解時間為3h，酶加量為150u/g，pH值為7.0的條件下，設定酶解溫度為30℃、32℃、36℃、40℃、42℃，以不飽和脂肪酸提取率為指標，確定酶解最佳溫度。結果如圖2所示。

由圖2可看出，溫度低于40℃時，不飽和脂肪酸提取率隨著溫度的升高逐漸增大，高于40℃時，不飽和脂肪酸的提取率降低，考慮到本次試驗用到的米曲霉脂肪酶的穩(wěn)定性在40℃以內，為了保證水解效率，所以選擇了40℃做為米曲霉脂肪酶水解的最佳溫度。

時間對不飽和脂肪酸提取率的影響

在酶解溫度為40℃，酶加量為150u/g，pH值為7.0的條件下，設定酶解時間為1h、2h、3h、4h、5h，以不飽和脂肪酸提取率為指標，確定最佳酶解時間。結果如圖3所示。

由圖3可看出，在3h以前，不飽和脂肪酸的提取率逐漸增加，在3h后隨著時間的增加，不飽和脂肪酸提取率呈下降趨勢，因此在3h后不飽和脂肪酸提取率會下降，由此可選擇3h作為米曲霉脂肪酶的反應時間。

pH值對不飽和脂肪酸提取率的影響

在酶解溫度40℃，酶加量150u/g，酶解時間3h的條件下，設定體系pH值設為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以不飽和脂肪酸提取率為指標，確定最佳pH值。結果如圖4。

由圖4可看出，pH值在7.0的時提取率最高，偏離這個值，酶活性降低，甚至會使酶蛋白質變性。故最佳pH值為7.0。

酶添加量對不飽和脂肪酸提取率的影響

在酶解時間為3h，酶解溫度為40℃，緩沖液pH值為7.0的條件下，設定酶添加量為180u/g、240u/g、300u/g、360u/g、420u/g，以不飽和脂肪酸提取率為指標，確定最佳的酶添加量，如圖5。

由圖5可看出，酶加量在300u/g左右的時候不飽和脂肪酸含量達到最大值。

響應面實驗

響應面設計

從單因素實驗可看出，每種單因素到一定范圍時，不飽和脂肪酸提取率會達到最大值，因此選擇多個因素里面的最適條件綜合實驗，以提高不飽和脂肪的提取率，采用Design Expert軟件程序，根據表2設計響應面實驗，結果分析見表3、圖6。

表2響應面設計因素水平表

表3響應面實驗數據

試驗數據采用Design Expert軟件優(yōu)化，得到回歸方程：不飽和脂肪酸提取率＝88.69+0.015A+7.500E-003B+0.39C-1.19AB+0.065AC-0.14BC-0.87A²-2.08B²-1.24C²。

式中各項系數的絕對值反映了各因素對不飽和脂肪酸的影響方向。為使回歸模型有顯著性的驗證，回歸方差分析可見表4所示：

表4不飽和脂肪酸回歸模型方差分析及顯著性試驗

由表4所示，方差變量與自變量之間的關系顯著，可知pH值對結果的作用明顯，溫度與酶加量沒有達到顯著值。模型顯著說明響應面實驗成立，失誤項P＝0.5211>0.05，失誤項不顯著，未知因素的干擾性較小。根據回歸方程模型顯示，P<0.05的視為顯著，P<1的視為不顯著。由F檢驗可得因子貢獻率：酶解pH(B)>酶加量(C)>溫度(A)。當溫度為40℃、pH7.0、酶加量300u/g時，不飽和脂肪酸提取率達到88.73％。

酶解溫度、pH值和酶加量交互作用對紅花籽油中的不飽和脂肪酸提取率作響應面圖，見圖6。

根據響應面數據表明，pH對不飽和脂肪酸的提取率有顯著的影響，酶的最適pH才能反映脂肪酶的酶解效果，偏離這個最佳值就會導致酶失活，蛋白變性。隨著酶加量的增加，酶與底物反應充分，酶滲透到質體膜內，分解蛋白和多糖，達到一定程度后，反應達到飽和，再增加酶用量對不飽脂肪酸的提取效果不明顯。脂肪酶的溫度范圍在36℃-40℃，取值范圍較小，提取率影響也比較小。

響應面驗證實驗

按照響應面設計實驗數據，選取最高值作為驗證性的實驗基礎，即pH 7.0，溫度39.06℃、酶解3h，酶加量307.85u/g，預測不飽和脂肪酸提取率為88.72％；實際響應面取值為pH7.0、溫度40℃、酶解3h、酶加量300u/g，做平行實驗測得不飽和脂肪酸的提取率分別為88.16％、88.11％和88.13％，平均值達到88.13％。

不同地區(qū)紅花籽油不飽和脂肪酸提取率

地區(qū)不同存在的差異導致紅花籽油的不飽和脂肪酸提取率均有不同，在本次實驗中，選用河南、新疆、云南三個地區(qū)的紅花籽作為原料，運用響應面實驗中最佳條件對不飽和脂肪酸的提取率的測定，結果如表5。

表5不同地區(qū)紅花籽油不飽和脂肪酸提取率

由表5可知：用米曲霉脂肪酶水解后的不飽和脂肪酸提取率均有提高，最高可達到93.43％。但在試驗中，稱量轉移油脂次數較多，過程中損失難免，實際提取率比檢測值略高。

脂肪酸主要組成分析

將預處理的樣品，用質譜解析、計算機分析、標準圖譜對照，鑒定結果如圖7-10和表6所示。

表6紅花籽油酶解前后脂肪酸主要組成分析

由表6可知：紅花籽油中脂肪酸組成成分最主要的為亞油酸、油酸、十六烷酸和十八烷酸，其中亞油酸和油酸屬于不飽和脂肪酸，十八烷酸和十六烷酸屬于飽和脂肪酸。在不飽和脂肪酸中亞油酸的含量最高，酶解后亞油酸的含量提高了7％。同時不飽和脂肪酸也提高了22.24％，由此可見，脂肪酶水解可以促進不飽和脂肪酸的提取，同時純化不飽和脂肪酸。

實施例2

一種酶法水解紅花籽油富集不飽和脂肪酸工藝，所述工藝包括以下步驟：

1)將紅花籽油中加入酶，酶解，滅酶，得到物料1；

2)物料1離心得到上清油脂和下層乳化層；

3)將步驟2)得到的下層乳化層進行破乳處理后離心得到上層游離油；

4)合并步驟2)得到的上清油脂和步驟3)得到的上層游離油，加入抗氧化劑；完成酶法水解紅花籽油富集不飽和脂肪酸。

所述步驟1)紅花籽油的提取方法為80℃烘干恒重的紅花籽用粉碎機粉碎，過篩，加入石油醚，35℃超聲20min后，5000rpm平衡離心5min，收集上清，旋轉蒸發(fā)得到紅花籽油。

所述步驟1)酶為米曲霉脂肪酶，酶解條件為pH值7、溫度40℃、酶添加量300u/g、酶解3h。

所述步驟1)的酶在進行酶解還有前處理工藝，所述前處理工藝為(酶前處理工藝1)：酶置于超聲功率190W、超聲頻率15kHz、超聲時間與間歇時間比為1：1、超聲處理3min后，再于35℃、110MPa、處理5min。

所述步驟1)滅酶方法為100℃沸水中水浴5min。

所述步驟2)離心條件5000r/min真空離心15min。

所述步驟3)破乳處理方法(破乳工藝1)為首先將乳化層進行冷凍處理，然后經過冷凍處理的乳化液經超聲波、微波協同處理，再加破乳劑處理后離心得到上層游離油；

所述冷凍處理條件為-25℃條件冷凍25h；

所述超聲波、微波協同處理條件為超聲波功率300w、超聲頻率20kHz、微波200w協同至乳化液解凍升至25℃；

所述破乳劑處理條件為添加乳狀液質量0.06％的破乳劑破乳15min。

所述破乳劑為甘露聚糖：黃原膠：鼠李糖：烷基糖苷按質量比為2:0.3:1:3的生物破乳劑。

所述步驟4)加入抗氧化劑3％維生素C作為抗氧化劑。

實施例3

改變酶前處理條件見1-5，其他條件同實施例2，測定酶處理對提取結果的影響見表7。

酶前處理工藝1：酶置于超聲功率190W、超聲頻率15kHz、超聲時間與間歇時間比為1：1、超聲處理3min后，再于35℃、110MPa、處理5min。

酶前處理工藝2：酶置于超聲功率225W、超聲頻率25kHz、超聲時間與間歇時間比為1：1、超聲處理7min。

酶前處理工藝3：酶置于38℃、170MPa、處理8min。

酶前處理工藝4：酶置于超聲功率220W、超聲頻率23kHz、超聲時間與間歇時間比為1：1、超聲處理6min后，再于38℃、160MPa、處理9min。

酶前處理工藝5：酶置于超聲功率213W、超聲頻率18kHz、超聲時間與間歇時間比為1：1、超聲處理6min后，再于36℃、170MPa、處理12min。

表7酶前處理工藝對脂肪酸主要組成的影響

由表7可知：酶前處理工藝對脂肪酸主要組成的有一定的影響，經酶前處理工藝紅花籽油中的不飽和脂肪酸中提高，同時超聲、高壓結合處理，對酶活提高效率較高，純化不飽和脂肪酸。

實施例4(破乳條件對提取效率的影響)

改變破乳條件見1-4，其他條件同實施例2，測定破乳工藝對提取結果的影響見表8。

破乳工藝1：所述步驟3)破乳處理方法為首先將乳化層進行冷凍處理，然后經過冷凍處理的乳化液經超聲波、微波協同處理，再加破乳劑處理后離心得到上層游離油。所述冷凍處理條件為-25℃條件冷凍25h；所述超聲波、微波協同處理條件為超聲波功率300w、超聲頻率20kHz、微波200w協同至乳化液解凍升至25℃；所述破乳劑處理條件為添加乳狀液質量0.06％的破乳劑破乳15min。所述破乳劑為甘露聚糖：黃原膠：鼠李糖：烷基糖苷按質量比為2:0.3:1:3的生物破乳劑。

破乳工藝2(未經冷凍處理)：所述步驟3)破乳處理方法為首先將乳化層經超聲波、微波協同處理，再加破乳劑處理后離心得到上層游離油。所述超聲波、微波協同處理條件為超聲波功率300w、超聲頻率20kHz、微波200w協同至乳化液至25℃；所述破乳劑處理條件為添加乳狀液質量0.05％-0.08％的破乳劑破乳10-25min。所述破乳劑處理條件為添加乳狀液質量0.06％的破乳劑破乳15min。所述破乳劑為甘露聚糖：黃原膠：鼠李糖：烷基糖苷按質量比為2:0.3:1:3的生物破乳劑。

破乳工藝3(未經超聲、微波處理)：所述步驟3)破乳處理方法為首先將乳化層進行冷凍處理，再加破乳劑處理后離心得到上層游離油。所述冷凍處理條件為-25℃條件冷凍25h；所述破乳劑處理條件為添加乳狀液質量0.06％的破乳劑破乳15min。所述破乳劑為甘露聚糖：黃原膠：鼠李糖：烷基糖苷按質量比為2:0.3:1:3的生物破乳劑。

破乳工藝4(未加破乳劑處理)：所述步驟3)破乳處理方法為首先將乳化層進行冷凍處理，然后經過冷凍處理的乳化液經超聲波、微波協同處理，離心得到上層游離油。所述冷凍處理條件為-25℃條件冷凍25h；所述超聲波、微波協同處理條件為超聲波功率300w、超聲頻率20kHz、微波200w協同至乳化液解凍升至25℃。

表8破乳工藝對脂肪酸主要組成的影響

由表8可知，破乳工藝對脂肪酸主要組成的有一定的影響，經破乳工藝并經冷凍、超聲、微波、破乳劑協同處理的紅花籽油中脂肪酸在不飽和脂肪酸中提高。

實施例4(破乳劑選擇對提取效率的影響)

改變破乳劑種類及配比見1-6，其他條件同實施例2，測定破乳劑對提取結果的影響見表9。

破乳劑1：所述破乳劑為甘露聚糖：黃原膠：鼠李糖：烷基糖苷按質量比為2:0.3:1:3的生物破乳劑。

破乳劑2：所述破乳劑為甘露聚糖：黃原膠：鼠李糖：烷基糖苷按質量比為4:0.3:2:3的生物破乳劑。

破乳劑3：所述破乳劑為黃原膠：鼠李糖：烷基糖苷按質量比為0.3:1:3的生物破乳劑。

破乳劑4：所述破乳劑為甘露聚糖：黃原膠：鼠李糖按質量比為2:0.3:1的生物破乳劑。

破乳劑5：所述破乳劑為甘露聚糖：黃原膠按質量比為2:0.3的生物破乳劑。

破乳劑6：所述破乳劑為鼠李糖：烷基糖苷按質量比為1:3的生物破乳劑。

破乳劑7：所述破乳劑為甘露聚糖：鼠李糖：烷基糖苷按質量比為2:1:3的生物破乳劑。

表9破乳劑對脂肪酸主要組成的影響

由表8可知，破乳劑對脂肪酸主要組成的有一定的影響，經破乳工藝并篩選合適的破乳劑組合的可提高紅花籽油的不飽和脂肪酸。

上述的實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，而不應視為對于本發(fā)明的限制，本申請中的實施例及實施例中的特征在不沖突的情況下，可以相互任意組合。本發(fā)明的保護范圍應以權利要求記載的技術方案，包括權利要求記載的技術方案中技術特征的等同替換方案為保護范圍。即在此范圍內的等同替換改進，也在本發(fā)明的保護范圍之內。