本發明屬于細胞工程技術領域，涉及一種用嵌合抗原受體修飾后T細胞的擴增培養與保存方法，具體涉及一種表達CD19和CD20抗體基因崁合抗原受體T細胞的轉化及擴增培養與保存方法。

背景技術：
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淋巴T細胞是構成細胞免疫的主要成分，而利用基因工程使T細胞表達嵌合抗原受體能使T細胞轉化成為具有特異性殺傷腫瘤細胞的效應細胞，是一種有前景的腫瘤免疫治療策略。嵌合性抗原受體應用的關鍵是確定一種腫瘤相關抗原，這種抗原具有在腫瘤細胞表面過表達或高表達，而在正常組織無表達或低表達，CD19在早期B細胞的發育中扮演重要的角色，所有的急性白血病都表達CD19。CD20表達于90％以上的B淋巴瘤細胞和正常B淋巴細胞，而在造血干細胞、原始B淋巴細胞、正常血細胞以及其他組織上不表達。因此，CD19和CD20可作為惡性淋巴細胞白血病免疫治療的一種有效的靶抗原。構建靶向CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體慢病毒，并將其高效率的轉染至T淋巴細胞，對轉染后的淋巴T細胞擴增培養并保存是對惡性B淋巴細胞白血病細胞免疫治療的前提關鍵。因此，本發明提供一種用于人T細胞的慢病毒轉化及擴增培養與保存的方法，對于惡性B淋巴細胞白血病細胞免疫治療具有重要臨床意義。

技術實現要素：
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針對現有技術存在的問題，本發明的目的旨在提供一種表達CD19和CD20抗體基因崁合抗原受體T細胞的轉化及擴增培養與保存方法。

為達到上述目的，本發明采取以下技術方案：

表達CD19和CD20抗體基因崁合抗原受體T細胞的轉化及擴增培養與保存方法，包括如下步驟：

S1：將分離獲得的CD4和CD8陽性T細胞懸浮于含人血清AB和細胞介素-2(IL-2)的培養基中，經T細胞激活試劑在37℃，5％CO₂孵育箱中進行培養激活；

所述含有人血清AB和細胞介素-2的培養基為含2％的人血清AB和200單位/mL的細胞介素-2的T細胞培養基，其是一種無異源成分的無血清培養基，專門用于人T細胞的生長和擴增。

所述T細胞激活試劑采用TransAct CD3/28。

S2：經T細胞激活試劑激活后，將T細胞轉移至離心管中，離心后取上清；

S3：將上述上清傾倒至另一離心管中備用，輕彈有細胞沉淀的離心管底部使細胞分散，將細胞重新懸浮于收集備用的上清中，移出少量細胞懸液計數；

S4：用備用的離心上清調整細胞濃度，然后接種于培養板中；

所述備用的離心上清調整細胞濃度為0.5X10⁶/mL，按0.5X10⁶/1mL/孔的量接種于六孔培養板中。

S5：將慢病毒從-80℃條件下取出，于室溫中融化后，加入到上述含有T細胞的培養板中，混勻，置37℃，5％CO₂孵育箱中進行孵育；

所述加入含有T細胞的培養板中的慢病毒用量根據病毒的感染滴度，按照感染復數(multiplicity ofinfection，MOI)5計算病毒用量。

S6：待孵育結束時，向培養板中加入含人血清AB和細胞介素-2的培養基，混勻，置37℃，5％CO₂孵育箱中進行孵育(如果收集備用的離心上清沒有用完，可與上述培養基混合然后加入孔中)；

所述含有人血清AB和細胞介素-2的培養基為含2％的人血清AB和200單位/mL的細胞介素-2的T細胞培養基，其是一種無異源成分的無血清培養基，專門用于人T細胞的生長和擴增。

S7：孵育后進行T細胞的收集，并取少量細胞計數計算總細胞數和細胞存活率，同時用流式細胞儀檢測CD19和CD20的表達水平；

S8：將收集的T細胞轉移至加有含人血清AB和細胞介素-2的培養基的G-Rex100培養裝置中，置37℃，5％CO₂孵育箱中進行擴增培養，中間無需換液或其他處理，盡量減少對細胞的干擾(根據培養板的細胞采用G-Rex100培養裝置的數量，如一個六孔板的細胞用一個G-Rex100)；

所述含有人血清AB和細胞介素-2的培養基為含2％的人血清AB和200單位/mL的細胞介素-2的T細胞培養基，其是一種無異源成分的無血清培養基，專門用于人T細胞的生長和擴增。

S9：待細胞培養結束后，收獲擴增細胞，并取少量細胞計數計算總細胞數和細胞存活率，同時用流式細胞儀檢測CD19和CD20的表達水平，另取部分細胞進行支原體檢測和內毒素檢測；

S10：將剩余細胞進行離心，并棄上清，再用復方電解質注射液洗滌細胞一次，再次進行離心后，即得細胞沉淀懸浮細胞；

S11：按照不同的治療劑量將細胞沉淀懸浮細胞置于細胞凍存液中，并轉移到細胞凍存袋中，此時移出1mL細胞進行無菌檢測；

所述細胞凍存液包括24％的復方電解質注射液，10％的DMSO，8％的人血清白蛋白。

S12：在將細胞沉淀懸浮細胞于細胞凍存液之前，啟動細胞凍存程序；

所述細胞凍存程序，具體包括如下步驟：

a.啟動細胞凍存程序，使細胞凍存室溫度降至4℃；

b.將含有細胞的凍存袋移至凍存室，繼續運行凍存程序；

c.細胞中溫度降低1℃/min至-11.5℃；

d.凍存室中溫度降低20℃/min至-55℃；

e.凍存室中溫度降低15℃/min至-25℃；

f.凍存室中溫度降低1℃/min至-45℃；

g.凍存室中溫度降低10℃/min至-100℃。

S13：待細胞溫度降到-90℃，細胞凍存完成；

S14：將凍存好的細胞移至液氮中進行長期保存。

本發明表達CD19和CD20抗體基因崁合抗原受體T細胞的轉化及擴增培養與保存方法，通過構建靶向CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體慢病毒，并將其高效率的轉染至T淋巴細胞，對轉染后的淋巴T細胞進行了擴增培養并保存，使CD19和CD20作為惡性淋巴細胞白血病免疫治療的一種有效的靶抗原，對于惡性B淋巴細胞白血病細胞免疫治療具有重要臨床意義。

附圖說明：

圖1是本發明實施例中表達CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體T細胞的擴增結果示意圖；

圖2是實施例中表達CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體T細胞培養于G-Rex100培養裝置中的圖片；

圖3是實施例中冰凍保存的表達CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體T細胞。

具體實施方式：

下面對本發明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發明的保護范圍中。

實施例1

一種表達CD19和CD20抗體基因崁合抗原受體T細胞的轉化及擴增培養與保存方法，包括如下步驟：

S1：將分離獲得的CD4和CD8陽性T細胞懸浮于含2％的人血清AB和200單位/mL的細胞介素-2的T細胞培養基中，經T細胞激活試劑在37℃，5％CO₂孵育箱中進行培養激活；

S2：經T細胞激活試劑激活作用一天后，將T細胞轉移至離心管中，300r離心10min后取上清；

S3：將上清傾倒至另一離心管中備用，輕彈有細胞沉淀的離心管底部使細胞分散，將細胞重新懸浮于收集備用的上清中，移出少量細胞懸液計數；

S4：用備用的離心上清調整細胞濃度為0.5X10⁶/mL，然后按0.5X10⁶/1mL/孔的量接種于六孔培養板中；

S5：將慢病毒從-80℃條件下取出，于室溫中融化后，加入到上述含有T細胞的六孔培養板中，混勻，置37℃，5％CO₂孵育箱中進行孵育6h；

S6：待孵育結束時，向六孔培養板中每孔加入1mL含2％的人血清AB和200單位/mL的細胞介素-2的T細胞培養基，混勻，置37℃，5％CO₂孵育箱中進行孵育4天(如果收集備用的離心上清沒有用完，可與上述培養基混合然后加入孔中)；

S7：孵育4天后進行T細胞的收集，并取少量細胞計數計算總細胞數和細胞存活率，同時用流式細胞儀檢測CD19和CD20的表達水平；

S8：將收集的T細胞轉移至加有含2％的人血清AB和200單位/mL的細胞介素-2的T細胞培養基的G-Rex100培養裝置中，如圖2所示，至培養基體積到450mL，置37℃，5％CO₂孵育箱中進行擴增培養8天，中間無需換液或其他處理，盡量減少對細胞的干擾；

S9：待細胞培養至7天結束后，收獲擴增細胞，并取少量細胞計數計算總細胞數和細胞存活率，同時用流式細胞儀檢測CD19和CD20的表達水平，另取部分細胞進行支原體檢測和內毒素檢測；

S10：將剩余細胞進行300g離心10min，并棄上清，再用復方電解質注射液洗滌細胞一次，再次進行300g離心10min后，即得細胞沉淀懸浮細胞；

S11：如圖3所示，按照不同的治療劑量將細胞沉淀懸浮細胞置于細胞凍存液中，并轉移到細胞凍存袋中，此時移出1mL細胞進行無菌檢測；

S12：在將細胞沉淀懸浮細胞于細胞凍存液之前，啟動細胞凍存程序；

所述細胞凍存程序，具體包括如下步驟：

a.啟動細胞凍存程序，使細胞凍存室溫度降至4℃；

b.將含有細胞的凍存袋移至凍存室，繼續運行凍存程序；

c.細胞中溫度降低1℃/min至-11.5℃；

d.凍存室中溫度降低20℃/min至-55℃；

e.凍存室中溫度降低15℃/min至-25℃；

f.凍存室中溫度降低1℃/min至-45℃；

g.凍存室中溫度降低10℃/min至-100℃。

S13：待細胞溫度降到-90℃，細胞凍存完成；

S14：將凍存好的細胞移至液氮中進行長期保存。

如圖1所示，為表達CD19和CD20抗體基因嵌合抗原受體T細胞的擴增結果可知：T細胞培養第5天至第13天之間細胞擴增的數量增至1750*10⁶到2200*10⁶，然后可計算總細胞數和細胞存活率。