本發明涉及生物技術領域,尤其涉及一種與小麥千粒重和莖稈可溶性糖含量相關的分子標記TaSnRK2.4A及其應用。
背景技術：
小麥是世界上最主要糧食作物之一，其生產與人類糧食安全密切相關。干旱是影響小麥生產的最主要非生物限制因素。蛋白激酶是逆境信號傳遞網絡的樞紐，在逆境脅迫應答反應中發揮著極其重要的作用。蔗糖非發酵蛋白激酶(sucrose non-fermental protein kinase,SnRK)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其中SnRK2參與多種逆境信號的轉導，在植物抗逆、根系發育以及農作物產量形成等方面起關鍵作用。如何將SnRK2用于抗逆高產農作物新品種培育，不僅是分子生物學家和遺傳學家關注的焦點，也是育種家迫切要解決的問題。從農作物種質資源中發掘SnRK2優異等位基因，然后通過傳統雜交和分子標記輔助選擇相結合加以利用，無疑是最直接、最有效，也是最易被接受的農作物品種改良方法。常規育種通常依賴表型選擇，盡管取得很大成就，但耗時耗力，育種進程緩慢；相比較而言，分子標記輔助選擇育種可以在早世代進行有針對性的選擇，操作簡單易行，且可以高效利用優異基因，能顯著加快育種的進程。
小麥TaSnRK2.4基因參與對多種逆境脅迫的應答，其過量表達能顯著提高植物對多種逆境的抗性(Maoet al.TaSnRK2.4,a SNF1-typeserine/threonine protein kinase of wheat(TriticumaestivumL.),confers enhanced multi-stress tolerances inArabidopsis.J Exp Bot,2010,61:683-96)，因此是小麥抗逆分子育種的優異基因資源，然而迄今為止，尚未開發出TaSnRK2.4基因的分子標記，亦無從知曉分子標記與農藝性狀的關系。
技術實現要素：
本發明的一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測小麥性狀的方法。
本發明提供的方法，包括如下步驟：檢測待測小麥群體基因組的E位點的基因型，根據E位點的基因型確定待測小麥性狀如下：
E位點的基因型為GG的小麥群體千粒重小于E位點的基因型為AA的小麥群體千粒重；
和/或，E位點的基因型為GG的小麥群體莖稈可溶性糖含量小于E位點的基因型為AA的小麥群體莖稈可溶性糖含量；
所述E位點為序列表序列1自5′末端的第30位，位于3A染色體，基因區第2478位。
上述方法中，所述檢測待測小麥群體基因組的E位點的基因型的方法包括如下步驟：對待測小麥的基因組DNA中任意一段包括所述E位點在內的DNA片段進行PCR擴增，并將PCR擴增產物酶切鑒定，得到包括E位點在內的DNA片段酶切產物，根據酶切產物片段大小確定所述待測小麥群體基因組的E位點的基因型。
上述方法中，所述對待測小麥的基因組DNA中任意一段包括所述E位點在內的DNA片段進行PCR擴增的引物對由序列2所示的單鏈DNA分子和序列3所示的單鏈DNA分子組成；
所述包括所述E位點在內的DNA片段的酶切所用的酶為HpaⅡ。
上述方法中，所述根據所述酶切產物X片段大小確定所述待測小麥群體基因組的E位點的基因型為如下：
若所述酶切產物X僅為212bp的DNA片段，則所述待測小麥在E位點的基因型為AA；
若所述酶切產物X為28bp、184bp的DNA片段，則所述待測小麥在E位點的基因型為GG。
本發明另一個目的是提供一種檢測待測小麥群體基因組的E位點的基因型的方法。
本發明提供的方法，包括所述中檢測待測小麥群體基因組的E位點的基因型的方法。
本發明第三個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測小麥性狀的產品。
本發明提供的產品，為檢測待測小麥群體基因組的E位點的基因型的物質。
上述產品中，所述物質包括引物對1和HpaⅡ酶；
所述引物對1由序列2所示的單鏈DNA分子和序列3所示的單鏈DNA分子組成。
上述產品中，所述產品為試劑盒。
上述檢測待測小麥群體基因組的E位點的基因型的物質在鑒定或輔助鑒定待測小麥性狀中的應用也是本發明保護的范圍；
或，上述檢測待測小麥群體基因組的E位點的基因型的物質在制備鑒定或輔助鑒定待測小麥性狀產品中的應用也是本發明保護的范圍。
上述方法在培育千粒重高和/或莖稈可溶性糖含量高的小麥中的應用也是本發明保護的范圍。
本發明第四個目的是提供一種篩選或培育千粒重高和/或莖稈可溶性糖含量高的小麥群體的方法。
本發明提供的方法，包括如下步驟：篩選或培育上述的E位點的基因型為AA的小麥群體。
所述PCR擴增的目標序列為序列表序列1自5′末端第1-212bp。
被確定為基因型A的待測小麥，其千粒重和莖稈可溶性糖含量極顯著(或顯著)低于被確定為基因型B的待測小麥。
本發明通過對小麥多態性群體中TaSnRK2.4A基因的變異分析，發現1處單核苷酸多態性位點,命名為E位點。本發明根據E位點開發dCAPS標記，命名為AM。這個SNP在自然群體中存在兩種單體型：單體型甲(G)和單體型乙(A)。關聯分析表明，這兩種單體型的純合類型中，單體型甲的千粒重和莖稈可溶性糖含量極顯著(或顯著)低于單體型乙。實驗證明，通過檢測所述的SNP，即可找到千粒重和莖稈可溶性糖含量相對較高的小麥。本發明為小麥分子標記輔助選擇育種提供了一個新方法，在培育高產小麥品種或研究中具有重要意義。
附圖說明
圖1為根據本發明的SNP開發分子標記酶切產物電泳檢測結果。
其中，泳道M為100bp DNA ladder。圖中所示為用HpaⅡ對不同小麥的PCR產物進行酶切的帶型。泳道A含有一條212bp的條帶；泳道G含有兩條從上至下依次為184bp和28bp的條帶，由于電泳時間較長，28bp的小片段條較為模糊。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
實施例1、與小麥千粒重和莖稈可溶性糖含量相關的SNP及其標記多態性檢測
1、擴增含小麥SNP位點的基因組DNA片段的特異引物
發明人從表1中32份普通六倍體小麥品種(來自于國家種質資源庫)發現了1個變異位點，選擇這個SNP開發為分子標記，對應于序列表序列1自5′末端的第30位(命名為E位點，存在A和G的多態性)；這個E位點在小麥自然變異群體中存在兩種單體型：
單體型甲：G；
單體型乙：A。
表1、32份普通六倍體小麥品種
根據小麥不同基因組的序列差異，設計基因組特異性引物對PE擴增包含E位點在內的DNA片段，引物對PE由名稱為pe1和pe2的單鏈DNA組成，pe1為序列2(5′-CAAACTCACCTTTCCATCATACTCACGCC-3′)所示的單鏈DNA，pe2為序列3(5′-ATATGCGATTTCGGCTACTCCAAGGTTG-3′)所示的單鏈DNA。
2、序列多態性檢測及基因分型方法的建立
1)提取待測小麥的基因組DNA，用基因組特異引物(F和R)進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；
F:5′-CATGAGTAAAACTTGCATACTATATTTCTC-3′(序列4)；
R:5′-TCCGCGGCTCCGGC-3′(序列5)。
2)以步驟1)的PCR擴增產物稀釋50倍為模板，采用步驟1中的引物對PE進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
PCR擴增的體系為：模板DNA 2μL(10pg-1μg)、2×UtaqPCR MasterMix12.5μL、引物pe1(10μmol/L)和pe2(10μmol/L)各1.0μL，補ddH2O至25.0μL。
PCR擴增條件為:95℃5min,95℃50s,59℃45s,72℃50s,33次循環；72℃10min，4℃保存。
3)將步驟2)的PCR產物用HpaⅡ酶切，獲得酶切產物；酶切產物均進行4％瓊脂糖凝膠電泳檢測，識別記錄酶切產物中各片段大小，并根據如下方法判斷并記錄待測小麥在所述E位點的情況：
若所述酶切產物為212bp(序列1的第1位-212bp)的DNA片段，則所述待測小麥在所述E位點為A純合(表示為A/A)的小麥(圖1中的泳道A)；
若所述酶切產物為184bp(序列1的第29位-212bp)、28bp(序列1的第1位-28bp)的DNA片段，則所述待測小麥在所述E位點為G純合(表示為G/G)的小麥(圖1中的泳道G)。
4)根據步驟3)的結果，將小麥分為在所述E和F位點的情況為如下Ⅰ-Ⅱ種類型：
Ⅰ:G/G(即單體型甲純合)；
Ⅱ:A/A(即單體型乙純合)。
上述“/”前為一條同源染色體上的情況，上述“/”后為另一條同源染色體上的情況。
3、利用該分子標記對自然群體進行分型并與千粒重和莖稈可溶性糖含量性狀進行關聯分析
以262份普通六倍體小麥(來自于國家種質資源庫)組成的自然群體中各小麥分別作為待測小麥按照步驟2的方法進行分型，隨機對部分小麥的擴增產物大小進行測序驗證，結果如表2所示。
表2、小麥自然群體中E和F位點的情況統計
注：“-”表示無PCR產物。
用Tassel2.1軟件中的General linear model(GLM)模型對兩種單倍型和千粒重、莖稈可溶性糖含量性狀進行關聯分析。
結果發現，單體型Ⅰ的千粒重和莖稈可溶性糖含量均極顯著(或顯著)低于單體型Ⅱ。對自然群體的研究表明，單體型Ⅱ是提高千粒重和莖稈可溶性糖含量的優異基因型。
表3、小麥自然群體中兩種基因型相關性狀統計結果
注：**代表不同基因型小麥之間性狀差異極顯著(P<0.01)。
序列表
<110> 中國農業科學院作物科學研究所
<120>一種與小麥千粒重和莖稈可溶性糖含量相關的分子標記TaSnRK2.4A及其應用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
caaactcacc tttccatcat actcacgccr ggatagcacc tctggtgcaa tatatgctgg 60
cgtccccact gctgatttgg gccttgaatg caatactgat gactgatcca gaaatgggaa 120
gaacagtttc tgtgagaatt tacagacatc gataacttga aggttcaata tgtgggttca 180
gggacaacct tggagtagcc gaaatcgcat at 212
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
caaactcacc tttccatcat actcacgcc 29
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
atatgcgatt tcggctactc caaggttg 28
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
catgagtaaa acttgcatac tatatttctc 30
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
tccgcggctc cggc 14