本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種沙門氏菌毒力島基因的雙重PCR檢測方法以及腸炎沙門氏菌的鑒定方法。

背景技術(shù)：

沙門氏菌是一種常見的革蘭氏陰性桿菌(參考文獻[1])，屬腸桿菌科，血清型種類繁多，現(xiàn)已知的血清型將近2500種(參考文獻[2])。沙門氏菌病在公共衛(wèi)生學上是擁有非常重要意義的人畜共患病之一。因此，建立一種簡單快捷、特異性高、敏感性強的快速檢測方法，對于醫(yī)療衛(wèi)生監(jiān)控和動物疫病防控都具有積極意義。

沙門氏菌的致病性與其毒力基因有關(guān)(參考文獻[3])，已知的沙門氏菌毒力島基因(SPI)主要有5個，即SPI-1，SPI-2，SPI-3，SPI-4，SPI-5。SPI-1編碼III型分泌系統(tǒng)，通過編碼的效應(yīng)蛋白進入宿主細胞(參考文獻[4])。SPI-2編碼另一種III型分泌系統(tǒng)(參考文獻[5])，以及多種效應(yīng)蛋白，能通過效應(yīng)蛋白通過細胞膜轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)，并為沙門氏菌創(chuàng)造合適的生存環(huán)境(參考文獻[6])。SPI-2中4個操縱子(ssa、ssc、sse、ssr)中的一個(參考文獻[7])編碼T3SS2效應(yīng)蛋白sseL，調(diào)控沙門氏菌在上皮細胞與吞噬細胞內(nèi)復制(參考文獻[8])，使其躲避巨噬細胞輔酶II依賴的殺傷作用。SPI-3能夠介導沙門氏菌在巨噬細胞和低Mg²⁺環(huán)境中生活(參考文獻[9])，編碼巨噬細胞生存蛋白mgtC。SPI-4編碼I型分泌系統(tǒng)，并介入調(diào)控沙門氏菌在巨噬細胞內(nèi)環(huán)境中的生活(參考文獻[10])。SPI-5編碼控制腸黏膜液體分泌和炎癥反應(yīng)的相關(guān)蛋白(參考文獻[11])。近年來，大量研究人員對沙門氏菌毒力島基因展開大量研究，張成龍(參考文獻[12])發(fā)現(xiàn)多重耐藥的沙門氏菌菌株幾乎都含有mgtC、sseL基因；鄒蘭(參考文獻[13])發(fā)現(xiàn)沙門氏菌毒力島標志基因mgtC、sseL擁有高度同源性；陳飛(參考文獻[14])等人發(fā)現(xiàn)mgtC、sseL的核苷酸序列擁有高度同源保守性，能夠當作檢測沙門氏菌的標志。綜上，沙門氏菌毒力島mgtC、sseL基因的核苷酸序列具有高度同源保守性，并與沙門氏菌致病性有緊密聯(lián)系。

參考文獻

參考文獻1：游勇來.沙門氏菌的分離鑒定及PCR快速分型的研究[D].華南理工大學,2013

參考文獻[2]陳惠娟.北京地區(qū)肉雞場沙門氏菌的流行性、耐藥性及分子分型研究[D].揚州大學,2011

參考文獻[3]劉芳萍,王德寧,李昌文,等.雞源沙門氏菌耐藥性的分析及毒力基因的檢測[J].中國獸醫(yī)科學,2013(12):1236-1239

參考文獻[4]薛穎,郭榮顯,錢珊珊,安樹敏,焦新安,耿士忠.沙門菌毒力島的研究進展[J].微生物與感染,2015,(06):381-389

參考文獻[5]王雪琴,周道國,劉倩.沙門菌侵襲研究進展[J].微生物與感染,2009,4(2):124-128

參考文獻[6]方艷紅,孫裴,魏建忠,等.沙門菌毒力基因研究進展[C].中國畜牧獸醫(yī)學會食品衛(wèi)生學分會第十一次學術(shù)研討會.2010

參考文獻[7]殷俊磊,程瞾,夏靜,等.雞白痢門菌中三型分泌系統(tǒng)-2效應(yīng)蛋白基因分布研究[J].中國家禽,2015,37(19):14-19

參考文獻[8]廖申權(quán),袁建豐,覃宗華,等.沙門氏菌與宿主細胞相互作用的分子機制[C].中國畜牧獸醫(yī)學會2009學術(shù)年會論文集(下冊).2009

參考文獻[9]曹恬雪,蔣文燦,何文成,紀鳳仙,魏志剛.沙門氏菌毒力因子的研究進展[J].中國預防獸醫(yī)學報,2014,(04):331-334

參考文獻[10]陳俊,蔣文燦,譚天,等.沙門氏菌毒力島及III型分泌系統(tǒng)研究進展[J].中國人獸共患病學報,2015,31(4):371-376

參考文獻[11]郭偉軍,崔照瓊,李華春.沙門氏菌毒力島及其III型分泌系統(tǒng)[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2006(5):49-51

參考文獻[12]張成龍.非傷寒沙門氏菌臨床株毒力基因初步分析[D].天津醫(yī)科大學,2015

參考文獻[13]鄒蘭.致病性大腸桿菌、沙門氏菌毒力島雙重PCR方法建立與應(yīng)用[D].安徽農(nóng)業(yè)大學,2012

參考文獻[14]陳飛,成大榮,王麗芳,孫懷昌,張鑫宇.禽沙門氏菌毒力島標志基因研究與mgtC基因序列分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2010,(06):53-56

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的包括：

以沙門氏菌毒力島標志基因mgtC、sseL為目的基因，建立的雙重PCR檢測方法：

提供一種同時檢測沙門氏菌毒力島標志基因mgtC、sseL的方法；

提供一種鑒定沙門氏菌的方法；

提供一種區(qū)分傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的鑒定方法等。

本發(fā)明具體提供了兩對用于沙門氏菌毒力島基因mgtC、sseL的雙重PCR檢測方法的引物，其中毒力島基因mgtC的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，毒力島基因mgtC的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示?；诒景l(fā)明公開的引物，通過多次單一PCR方法，或使用雙重PCR方法，可用于鑒定沙門氏菌的鑒定。

本發(fā)明公開了一種檢測沙門氏菌毒力島基因mgtC、sseL的雙重PCR檢測方法，其中毒力島基因mgtC的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，毒力島基因mgtC的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；包括以下步驟：

(1)雙重PCR反應(yīng)；雙重PCR反應(yīng)體系：樣品細菌模板溶液3uL，(mgtC引物對0.15uL，sseL引物對0.85uL)，2×Taq Master MIX 8.5uL，雙蒸水11.5uL；

雙重PCR擴增參數(shù)：94℃變性5min，之后開始擴增循環(huán)，每個循環(huán)的程序為：94℃變性45s，57℃退火45s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min；降溫至15℃，PCR反應(yīng)結(jié)束；

(2)PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析判定：取步驟(1)PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳；

進一步的，凝膠電泳結(jié)果在449bp和184bp位置同時出現(xiàn)擴增條帶，則說明樣品中含沙門氏菌；如果電泳結(jié)果在184bp位置出現(xiàn)單一條帶，說明樣品中含傷寒沙門氏菌；如果電泳結(jié)果在449bp和184bp位置均未出現(xiàn)擴增條帶，則說明樣品中不含沙門氏菌。

其次，本發(fā)明還公開了上述鑒定方法用于鑒定沙門氏菌毒力島基因mgtC和sseL的用途，以及用于鑒定沙門氏菌的用途；

本發(fā)明還公開了上述方法用于鑒定區(qū)分傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的用途。

優(yōu)選的，上述方法中步驟(1)樣品細菌含有的沙門氏菌≥3×10³cfu·mL^-1。

本發(fā)明提供的雙重PCR方法，可針對沙門氏菌(乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌)特異性的擴增出清晰的目標基因mgtC、sseL條帶，而大腸桿菌、金黃色葡萄球菌則不能擴增出條帶。

本發(fā)明提供的雙重PCR方法，在將沙門氏菌菌液濃度稀釋到僅為3×10³cfu·mL^-1時，該方法仍能擴增出兩條清晰的目標條帶，具有良好的敏感性。

傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌是沙門氏菌屬中較常見的兩種。但傷寒沙門氏菌毒力島內(nèi)只表達mgtC基因，沒有sseL基因表達，這與腸炎沙門氏菌有明顯區(qū)別，所以，本次試驗所建立的沙門氏菌毒力島mgtC、sseL基因雙重PCR檢測方法對于沙門氏菌屬傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌兩個菌種的鑒別鑒定可提供一定的依據(jù)。

有益效果

沙門氏菌病作為常見的人畜共患病之一，能夠感染哺乳動物，爬行動物，鳥、昆蟲，以及人；在家禽家畜和野生動物中傳播，可造成肉蛋等畜禽產(chǎn)品的污染。因此，及時的發(fā)現(xiàn)沙門氏菌，控制傳染源，對該病的治療和防控有積極的作用。傳統(tǒng)的沙門氏菌鑒定，需要增菌純化培養(yǎng)、生化試驗和血清學試驗等方法，所以，傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定工作量大、難度大、易出錯和漏檢、靈敏度較低。

本研究針對沙門氏菌毒力島特異性mgtC、sseL基因所建立的雙重PCR檢測方法，具有操作簡單，快速、準確、敏感性高、特異性強等特點，能夠為檢測省力、省時、節(jié)約成本。所以，該檢測方法有非常廣泛的應(yīng)用前景，可以應(yīng)用于沙門氏菌的流行病學調(diào)查、臨床檢測；還可以應(yīng)用于養(yǎng)殖各環(huán)節(jié)中沙門氏菌的檢測和食品流通環(huán)節(jié)中沙門氏菌的監(jiān)測；還可以應(yīng)用于沙門氏菌致病機理及免疫機理的相關(guān)性研究。

本發(fā)明提供的沙門氏菌毒力島mgtC、sseL基因雙重PCR檢測方法具有簡單快捷，準確率高，敏感性高，特異性強的特點。本次試驗所建立的沙門氏菌毒力島mgtC、sseL基因雙重PCR檢測方法對于沙門氏菌屬傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌兩個菌種的鑒別鑒定可提供一定的依據(jù)。

附圖說明

圖1 mgtC基因溫度梯度結(jié)果

其中，M:MakerD2000；1:52.8℃；2:53.9℃；3:54.9℃；4:56℃；5:57.1℃；6:58.2℃。

圖2 sseL基因溫度梯度結(jié)果

其中，M:MakerD2000；1:49℃；2:50.5℃；3:52.4℃；4:54.5℃；5:56.7℃；6:58.5℃。

圖3雙重PCR特異性試驗結(jié)果

其中，M:MakerD2000；1乙型副傷寒沙門氏菌；2腸炎沙門氏菌；3傷寒沙門氏菌；4大腸埃希氏菌；5金黃色葡萄球菌；6空白對照。

圖4雙重PCR敏感性試驗結(jié)果

其中，MakerD2000；1原菌液；2 3×10⁸cfu·mL^-1；3 3×10⁷cfu·mL^-1；4 3×10⁶cfu·mL^-1；5 3×10⁵cfu·mL^-1；6 3×10⁴cfu·mL^-1；7 3×10³cfu·mL^-1；8 3×10²cfu·mL^-1；9 3×10¹cfu·MmL^-1。

具體實施方式

以下為實施例的實驗菌株、試劑與儀器、細菌的增殖、細菌DNA模板制備的方法。

實驗菌株

乙型副傷寒沙門氏菌CMCC50094，腸炎沙門氏菌CMCC(B)50335，傷寒沙門氏菌CMCC(B)50071，大腸埃希氏菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC6538，菌株購自中國獸藥監(jiān)察所。

試劑與儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒、GeneGreen核酸染料、2×Taq Master MIX、ddH2O等，購自天根生化科技有限公司。

PCR擴增儀、SDS-PAGE凝膠成像系統(tǒng)、切膠儀、電泳儀等。

細菌的增殖

將乙型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌分別接種到營養(yǎng)肉湯(LB)培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床37℃、180r/min培養(yǎng)14h后，保存?zhèn)溆谩?/p>

細菌DNA模板制備

分別抽取各菌菌液1ml，按細菌DNA提取試劑盒操作說明提取細菌DNA，-20℃保存，備用。

實施例一、沙門氏菌毒力島基因mgtC、sseL雙重PCR檢測方法的建立

(1)引物設(shè)計及合成

參照GenBank中已發(fā)布的沙門氏菌毒力島mgtC和sseL基因序列，用Primer5.0軟件設(shè)計2對特異性引物，并引物進行分析，確保在引物之間無二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。分析合格后的引物由上海杰李生物科技有限公司合成.

mgtC基因引物序列為：

mgtC-F:5′>TGACGACATCGCCAGACA<3′

mgtC-R:5′>GCCCTAAGCCGCATAACA<3′

sseL基因引物序列為：

sseL-F：5′>GCGAATGTGGTCGTCAGA<3′

sseL-R：5′>TGGTAGCAGGATCGTTTT<3′

mgtC擴增產(chǎn)物測序結(jié)果和GenBank中發(fā)表的沙門氏菌mgtC基因比對，同源性達到100％。sseL擴增產(chǎn)物測序結(jié)果和GenBank中發(fā)表的沙門氏菌sseL基因比對，同源性達到99％。

(2)單一引物PCR實驗

以乙型副傷寒沙門氏菌為PCR擴增DNA模板，做單一引物溫度梯度PCR擴增，確定mgtC、sseL基因PCR擴增最佳退火溫度。

PCR反應(yīng)體系(25uL)：DNA模板3uL，上游引物0.5uL，下游引物0.5uL，2×Taq Master MIX 8.5uL，ddH₂O 12.5uL。

單一PCR檢測擴增參數(shù)具體為：94℃變性5min；之后開始擴增循環(huán)，每個循環(huán)的程序為：94℃變性45s→56±5℃退火45s→72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min；降溫至15℃，結(jié)束。

分別取上述PCR擴增產(chǎn)物15uL點樣于1.5％瓊脂糖凝膠，105V恒壓，電泳40min。電泳完成后放入SDS-PAGE凝膠成像儀，觀察條帶并將清晰的條帶切膠送往上海杰李生物科技有限公司進行序列測定。

測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的沙門氏菌相應(yīng)基因序列，運用BLAST程序進行同源性比對。單一mgtC基因、sseL基因的溫度梯度PCR擴增結(jié)果如圖1、圖2所示。擴增結(jié)果圖譜顯示，乙型副傷寒沙門氏菌的mgtC、sseL基因均能擴增出特異性目標條帶，條帶大小分別是184bp、449bp；引物mgtC在溫度57.1℃電泳成像條帶較亮，引物sseL在溫度56.7℃電泳成像條帶較亮。

(3)雙重PCR檢測的建立

雙重PCR體系為25uL：mgtC引物對0.15uL，sseL引物對0.85uL，細菌DNA模板3uL，2×Taq Master MIX 8.5uL，ddH2O 11.5uL。

PCR檢測擴增參數(shù)具體為：94℃變性5min，之后開始擴增循環(huán)，每個循環(huán)的程序為：94℃變性45s，57℃退火45s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min；降溫至15℃，結(jié)束。

實施例二、基于沙門氏菌毒力島基因mgtC、sseL雙重PCR檢測方法特異性試驗

分別將乙型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌DNA作為細菌DNA模板，空白對照組以ddH2O為模板，按實施例一步驟(3)試驗條件進行雙重PCR，檢測該方法特異性。

雙重PCR特異性結(jié)果如圖3。乙型副傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌均能擴增出2條清晰的目的條帶，傷寒沙門氏菌能擴增出1條清晰條帶；大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和空白對照不能擴增出條帶。

傷寒沙門氏菌缺失sseL基因，所以沒有擴增出449bp長度的條帶。因此，本試驗設(shè)計的沙門氏菌毒力島mgtC-sseL雙重PCR檢測方法特異性強。

實施例三、基于沙門氏菌毒力島基因mgtC、sseL雙重PCR檢測方法敏感性試驗

將增菌后的乙型副傷寒沙門氏菌菌液稀釋菌液濃度為3×10⁸cfu/L。進一步用無菌營養(yǎng)肉湯對其做10倍梯度稀釋，使菌液終濃度為10⁶-10⁰cfu/L，并編號。分別取各濃度菌液1ml提取細菌DNA，按實施例一步驟(3)試驗條件進行雙重PCR，檢測該方法敏感性。

敏感性結(jié)果顯示，菌液濃度從3×10⁸cfu·mL^-1稀釋至3×10³cfu·mL^-1時，9個濃度均能擴增出兩條清晰的目標條帶如圖4。

試驗設(shè)計的沙門氏菌毒力島mgtC-sseL雙重PCR檢測方法在菌液濃度為3×10³cfu·mL^-1時仍能檢測出沙門氏菌，敏感性高。

序列表

<110> 西昌學院

<120> 一種沙門氏菌毒力島基因mgtC、sseL雙重PCR檢測方法及用途

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> mgtC F引物

<222> (1)..(18)

<400> 1

tgacgacatc gccagaca 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> mgtC R引物

<222> (1)..(18)

<400> 2

gccctaagcc gcataaca 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> sseL F引物

<222> (1)..(18)

<400> 3

gcgaatgtgg tcgtcaga 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> sseL R引物

<222> (1)..(18)

<400> 4

tggtagcagg atcgtttt 18