本發(fā)明公開了一種副溶血性弧菌的檢測(cè)方法，屬于微生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種呈絲狀，弧狀或桿狀的革蘭氏陰性菌，無芽孢形成。該病原體是重要的食源性疾病病原體，是廣泛存在于河口、沿海及海洋環(huán)境中的嗜鹽菌。副溶血性弧菌常分離自海產(chǎn)品及臨床標(biāo)本，引起海產(chǎn)品源性的腸熱癥，臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉。據(jù)WHO數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，副溶血性弧菌被認(rèn)為是引起海產(chǎn)品源性疾病最主要的因素。副溶血性弧菌食物中毒，是進(jìn)食含有該菌的食物所致，主要來自海產(chǎn)品，如墨魚、海魚、海蝦、海蟹、海蜇，以及含鹽分較高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力強(qiáng)，在抹布和砧板上能生存1個(gè)月以上，海水中可存活47天。全球每年有7萬病人死于海產(chǎn)品源性腹瀉，而絕大多數(shù)海產(chǎn)品源性的腹瀉病例是副溶血性弧菌導(dǎo)致，從而受到世界各國的高度關(guān)注，成為各國的重大公共衛(wèi)生問題。因此，為了給予臨床病人準(zhǔn)確快速的治療，開展海產(chǎn)品監(jiān)測(cè)以及副溶血性弧菌的流行病學(xué)調(diào)查，研發(fā)一個(gè)省時(shí)、省力和特異性較高的檢測(cè)方法，能夠同時(shí)檢測(cè)和鑒定副溶血性弧菌成為必要。

目前對(duì)于副溶血性弧菌的檢測(cè)主要依賴于傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)和生化鑒定。該方法耗時(shí)大約5到7天，包括增菌、選擇培養(yǎng)及后續(xù)的生化鑒定，其劣勢(shì)是耗時(shí)耗力，生化結(jié)果的判讀依賴于人的主觀判斷，導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差，易錯(cuò)判。隨著核酸診斷技術(shù)的快速發(fā)展，一些以PCR為基礎(chǔ)的診斷技術(shù)(如普通PCR技術(shù)，熒光PCR技術(shù))被用于副溶血性弧菌的快速檢測(cè)，然而這些方法依賴于昂貴的儀器設(shè)備，需要后續(xù)的電泳操作，昂貴的探針合成，以及熟練的操作人員。對(duì)于一些落后的實(shí)驗(yàn)室無法進(jìn)行，限制了這些技術(shù)的運(yùn)用。目前運(yùn)用這些檢測(cè)技術(shù) 診斷副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的PCR方法和Real-time PCR方法，檢測(cè)靈敏度差，檢測(cè)過程耗時(shí)較長，不利于快速檢測(cè)和應(yīng)急檢測(cè)。

為了克服PCR擴(kuò)增技術(shù)的劣勢(shì)，近年來發(fā)展了許多恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)較PCR技術(shù)而言，不依賴于熱循環(huán)擴(kuò)增設(shè)備，反應(yīng)速度快，敏感性好。因此，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有利于實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增，便捷檢測(cè)及現(xiàn)場診斷。到目前為止，已發(fā)展的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有10余種，應(yīng)用較為廣泛的有滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、解旋酶依賴的恒溫?cái)U(kuò)增(HDA)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、交叉擴(kuò)增(CPA)等。然而，這些恒溫技術(shù)實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增需要多種酶同時(shí)工作，依賴于昂貴的試劑，復(fù)雜的操作步驟。因此這些方法的實(shí)用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速診斷領(lǐng)域及欠發(fā)達(dá)地區(qū)。為了克服PCR技術(shù)及現(xiàn)有恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的劣勢(shì)，實(shí)現(xiàn)便捷、快速、敏感及特異的擴(kuò)增核酸序列，在生物、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，發(fā)明人近期已經(jīng)建立了一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，命名為多交叉置換擴(kuò)增(Multiple Cross Displacement Amplification，MCDA)，相關(guān)內(nèi)容公開于CN104946744A，該專利文件作為現(xiàn)有技術(shù)文件構(gòu)成本申請(qǐng)說明書的一個(gè)部分。

MCDA在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增，僅使用一種恒溫置換酶、擴(kuò)增速度快、反應(yīng)靈敏、特異性高。為了使該技術(shù)在生物、醫(yī)藥及衛(wèi)生領(lǐng)域應(yīng)用更廣泛、更經(jīng)濟(jì)。近期，發(fā)明人以MCDA為基礎(chǔ)，將MCDA技術(shù)與納米生物檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了依賴MCDA技術(shù)，實(shí)現(xiàn)快速、敏感檢測(cè)的納米生物傳感技術(shù)，該技術(shù)被命名為多交叉恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)合金納米生物傳感的核酸診斷技術(shù)(Multiple Cross Displacement Amplification label-based gold Nanoparticles Lateral Flow Biosensor,MCDA-LFB)，相關(guān)內(nèi)容已申請(qǐng)于CN201610872509.4、CN201610942289.8、CN201610982015.1。

本發(fā)明將MCDA-LFB技術(shù)用于副溶血性弧菌的檢測(cè)，針對(duì)副溶血性弧菌的特異基因toxR設(shè)計(jì)一套MCDA擴(kuò)增引物，旨在驗(yàn)證、評(píng)價(jià)MCDA-LFB技術(shù)及建立針對(duì)副溶血性弧菌的快速、敏感和特異的MCDA-LFB檢測(cè)體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于上述發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供了一種應(yīng)用多交叉擴(kuò)增結(jié)合金納米生物傳感檢測(cè)目的基因的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)提取待檢測(cè)樣品的基因組；

(2)提供置換引物F1和F2，提供交叉引物CP1和CP2，同時(shí)提供在交叉引物CP1或CP2的5’端標(biāo)記有生物素的交叉引物CP1*或CP2*；提供擴(kuò)增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，同時(shí)提供在所述擴(kuò)增引物C1或C2的5’端標(biāo)記半抗原的擴(kuò)增引物C1*或C2*；

(4)在鏈移位型聚合酶(Bst)、解鏈溫度調(diào)節(jié)劑、引物存在下，使用待檢測(cè)樣品的基因組片段作為模板恒溫?cái)U(kuò)增DNA；

(5)使用金納米生物傳感器檢測(cè)步驟(4)的擴(kuò)增產(chǎn)物。

在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，在所述擴(kuò)增引物C1*或C2*的5’端所標(biāo)記的半抗原為熒光素(FITC)。

更為優(yōu)選地，在交叉引物CP1*的5’端標(biāo)記生物素，在所述擴(kuò)增引物C1*的5’端標(biāo)記熒光素。

在一個(gè)更為優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述金納米生物傳感器包括一背板，在所述背板上依次設(shè)置裝有樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜及吸水墊，在所述硝酸纖維素膜上依次設(shè)置檢測(cè)線及控制線，在金標(biāo)墊、檢測(cè)線及控制線區(qū)域依次包被有金納米粒子偶聯(lián)的鏈霉素親和素、抗熒光素抗體及生物素偶聯(lián)的牛血清蛋白。

在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述恒溫?cái)U(kuò)增是在61-64℃的環(huán)境中進(jìn)行的。

在一個(gè)更為優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述恒溫?cái)U(kuò)增是在62℃的環(huán)境中進(jìn)行的。

在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述目的基因?yàn)楦比苎曰【膖oxR。

優(yōu)選地，所述置換引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置換引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示；所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:3所示，在所述交叉引物CP1的5’端標(biāo)記有生物素的所述交叉引物CP1*的序列如SEQ ID NO:4所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:5所示，引物C1的序列如SEQ ID NO:6所示，在所述引物C1的5’端標(biāo)記有熒光素的引物C1*的序列如SEQ ID NO:7所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:8所示，引物D1的序列如SEQ ID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:10所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:11所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:12所示。

本發(fā)明在另一方面還提供了一組用于多交叉擴(kuò)增副溶血性弧菌toxR基因的引物序列，所述序列包括：如SEQ ID NO:1所示的置換引物F1，如SEQ ID NO:2所示的置換引物F2，如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:6所示的擴(kuò)增引物C1，如SEQ ID NO:8所示的擴(kuò)增引物C2，如SEQ ID NO:9所示的擴(kuò)增引物D1，如SEQ ID NO:10所示的擴(kuò)增引物D2，如SEQ ID NO:11所示的擴(kuò)增引物R1，如SEQ ID NO:12所示的擴(kuò)增引物R2，同時(shí)提供在交叉引物CP1或CP2的5’端標(biāo)記有生物素的交叉引物CP1*或CP2*，以及在所述擴(kuò)增引物C1或C2的5’端標(biāo)記半抗原的擴(kuò)增引物C1*或C2*。

在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，在交叉引物CP1*的5’端標(biāo)記生物素，在擴(kuò)增引物C1*的5’端標(biāo)記有熒光素。

本發(fā)明提供的多交叉擴(kuò)增結(jié)合金納米生物傳感檢測(cè)的目的基因?yàn)楦比苎曰【膖oxR，該方法具有優(yōu)異的檢測(cè)靈敏度，其檢測(cè)范圍為10ng～10fg，而且也具有較快的檢測(cè)速度，僅需30分鐘，即可獲得能供可視化LFB檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物。

以常見的致病菌及條件致病菌DNA(副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特菌、沙門菌、志賀菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌、蠟樣芽胞桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌等)為模板評(píng)價(jià)V.parahaemolyticus-MCDA-LFB技術(shù)的特異性。結(jié)果表明，V.parahaemolyticus-MCDA-LFB技術(shù)能準(zhǔn)確的鑒別副溶血性弧菌，說明MCDA-LFB方法的特異性良好，也證明本發(fā)明提供的用于MCDA的引物序列具有優(yōu)異的特異性和擴(kuò)增效果。

附圖說明

圖1A.MCDA-LFB擴(kuò)增原理示意圖；

圖1B.金納米生物傳感器結(jié)構(gòu)示意圖；

圖1C.LFB結(jié)果判讀示意圖；

圖2.MCDA-LFB引物設(shè)計(jì)的位置和方向示意圖；

圖3A.MCDA擴(kuò)增可視顏色變化法檢測(cè)結(jié)果圖譜；

圖3B.MCDA擴(kuò)增電泳法檢測(cè)結(jié)果圖譜；

圖3C.MCDA擴(kuò)增LFB檢測(cè)結(jié)果圖譜；

圖4.標(biāo)準(zhǔn)MCDA-LFB最佳反應(yīng)溫度測(cè)試結(jié)果圖譜；

圖5A.MCDA擴(kuò)增LFB檢測(cè)靈敏度評(píng)價(jià)圖譜；

圖5B.MCDA擴(kuò)增電泳法檢測(cè)靈敏度評(píng)價(jià)圖譜；

圖5C.MCDA擴(kuò)增可視顏色變化法檢測(cè)靈敏度評(píng)價(jià)圖譜；

圖5D.MCDA擴(kuò)增實(shí)時(shí)濁度法檢測(cè)靈敏度評(píng)價(jià)圖譜；

圖6A.MCDA擴(kuò)增10分鐘LFB檢測(cè)結(jié)果圖譜；

圖6B.MCDA擴(kuò)增20分鐘LFB檢測(cè)結(jié)果圖譜；

圖6C.MCDA擴(kuò)增30分鐘LFB檢測(cè)結(jié)果圖譜；

圖6D.MCDA擴(kuò)增40分鐘LFB檢測(cè)結(jié)果圖譜；

圖7.MCDA-LFB技術(shù)的特異性檢測(cè)評(píng)價(jià)圖譜

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。

1.MCDA-LFB擴(kuò)增原理

(1)通過MCDA擴(kuò)增構(gòu)建可檢測(cè)產(chǎn)物

MCDA反應(yīng)體系包括10條引物，識(shí)別靶序列的10個(gè)區(qū)域，包括2條交叉內(nèi)引物，即CP1和CP2(Cross Primer，CP)，2條置換引物，即F1和F2，6條擴(kuò)增引物，即D1，C1，R1，D2，C2和R2。為了構(gòu)建可檢測(cè)產(chǎn)物，交叉引物CP1或CP2在5’端標(biāo)記生物素(Biotin),擴(kuò)增引物C1或C2在5’端標(biāo)記熒光素(FITC)，新標(biāo)記的引物被命名為CP1*，CP2*，C1*和C2*。CP1*包含Cl(C1s區(qū)域的互補(bǔ)序列)和P1，即5′-Cl-P1；CP2包含C2(C2s區(qū)域的互補(bǔ)序列)和P2，即5′-C2-P2。兩條交叉引物CP1和CP2是介導(dǎo)MCDA擴(kuò)增的主要引物；置換引物F1和F2在MCDA反應(yīng)中發(fā)揮置換作用，置換交叉引物CP1和CP2；六條擴(kuò)增引物D1，C1，R1，D2，C2和R2能夠加速M(fèi)CDA反應(yīng)及增加MCDA產(chǎn)物量，擴(kuò)增原理參見圖1A。

為了便于理解，CP2*和C2*引物在擴(kuò)增示意圖中被略去。在既定的恒溫條件下，雙鏈DNA在處于半解離和半結(jié)合的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈。首先在Bst DNA聚合酶的作用下，以CP1*引物P1區(qū)段的3′末端為起點(diǎn)，與對(duì)應(yīng)的DNA互補(bǔ)序列配對(duì)，啟動(dòng)鏈置換DNA合成。F1引物與P1s前端F1s序列互補(bǔ)，以3′末端為起點(diǎn)，通過鏈置換活性DNA聚合酶的作用，首先置換出CP1引物合成的DNA鏈，同時(shí)合成自身DNA。最終F1引物合成而得的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈。然而由交叉引物CP1*先合成的DNA鏈被F1引物進(jìn)行鏈置換產(chǎn)生一單鏈，該單鏈的D1s，C1s，R1s，P2s，F(xiàn)2s區(qū)域能夠依次與擴(kuò)增引物D1，C1*，R1，交叉引物CP2及置換引物F2結(jié)合，并發(fā)揮鏈置換擴(kuò)增作用(步驟1，2)。C1*引物擴(kuò)增并置換D1的擴(kuò)增鏈，生成短片段C1s-D1產(chǎn)物，該產(chǎn)物能夠與C1*和CP1*引物結(jié)合，啟動(dòng)鏈置換擴(kuò)增，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增1(步驟3和循環(huán)1)。R1引物擴(kuò)增并置換C1*的擴(kuò)增鏈，生成短片段C1s-C1*產(chǎn)物，該產(chǎn)物能夠與C1*和CP1*引物結(jié)合，啟動(dòng)鏈置換擴(kuò)增，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增2(步驟4和循環(huán)2)。在循環(huán)擴(kuò)增2中，隨著MCDA擴(kuò)增的進(jìn)行，大量的雙標(biāo)產(chǎn)物被形成，CP1*端標(biāo)記生物素，C1*端標(biāo)記熒光素(圖1A)。該雙標(biāo)的產(chǎn)物能被金納米生物傳感器檢測(cè)，從而進(jìn)行可視檢測(cè)。后續(xù)的MCDA擴(kuò)增，包括步驟5和6，詳見發(fā)明人的前期專利CN104946744A。此外，由于CP2*和C2*的擴(kuò)增過程與CP1*和C1*的擴(kuò)增過程相似，在MCDA擴(kuò)增體系中，同樣能夠形成大量的雙標(biāo)的可檢測(cè)產(chǎn)物。CP2*端標(biāo)記生物素，C2*端標(biāo)記熒光素。該雙標(biāo)的產(chǎn)物也能被金納米生物傳感器(LFB)檢測(cè)，從而進(jìn)行可視檢測(cè)。因此，在利用MCDA-LFB技術(shù)進(jìn)行靶序列檢測(cè)時(shí)，可利用CP1*和C1*引物構(gòu)建可檢測(cè)產(chǎn)物，也可利用CP2*和C2*引物構(gòu)建可檢測(cè)產(chǎn)物。

(2)生物傳檢測(cè)器(LFB)的設(shè)計(jì)及對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

生物檢測(cè)器(LFB)的設(shè)計(jì)見圖1B。LFB包含五個(gè)部分，樣品墊1、金標(biāo)墊2、纖維膜3、吸水墊4及背板5，首先將樣品墊、金標(biāo)墊、纖維膜及吸水墊依次組裝在背板上，然后將SA-G(30nm，金納米粒子偶聯(lián)的鏈霉素親和素)，anti-FITC(抗熒光素抗體)及Biotin-BSA(生物素偶聯(lián)的牛血清蛋白)分別包被在金標(biāo)墊、檢測(cè)線(TL)6、及控制線(CL)7，待干燥后備用。

LFB的檢測(cè)原理：將V.parahaemolyticus-MCDA產(chǎn)物直接滴加到LFB的樣品墊區(qū)域，然后將120μl的檢測(cè)緩沖液加到樣品墊區(qū)域，MCDA產(chǎn)物在虹吸作用下，從下往上運(yùn)動(dòng)(從樣品墊向吸水墊方向運(yùn)動(dòng))。當(dāng)MCDA產(chǎn)物達(dá)到金標(biāo)墊后，雙標(biāo)產(chǎn)物的一端(即生物素標(biāo)記端)與SA-G(金納米粒子偶聯(lián)的鏈霉素親和素)反應(yīng)。當(dāng)產(chǎn)物繼續(xù)運(yùn)動(dòng)，雙標(biāo)產(chǎn)物的另一端(即熒光素標(biāo)記端)與檢測(cè)線區(qū)域的抗體結(jié)合，將雙標(biāo)產(chǎn)物固定在檢測(cè)線區(qū)域。隨著產(chǎn)物在檢測(cè)線區(qū)域的積累，通過另一端的SA-G(金納米粒子偶聯(lián)的鏈霉素親和素)進(jìn)行顯色反應(yīng)，從而對(duì)MCDA產(chǎn)物進(jìn)行可視化檢測(cè)。此外，過剩的SA-G(金納米粒子偶聯(lián)的鏈霉素親和素)可與CL(質(zhì)控線)區(qū)域的B-BSA(金納米粒子偶聯(lián)的鏈霉素親和素)結(jié)合，進(jìn)行直接顯色反應(yīng)，判斷LFB的功能是否正常。

LFB結(jié)果的判讀(圖1C)：僅僅CL區(qū)域出現(xiàn)紅色條帶，表示陰性對(duì)照，沒有陽性產(chǎn)物(圖1C II)；CL及檢測(cè)線區(qū)域出現(xiàn)紅色條帶，表示針對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)為陽性結(jié)果(圖1C I)；當(dāng)LFB不出現(xiàn)紅線條帶時(shí)，表示LFB失效；僅當(dāng)測(cè)試線出現(xiàn)紅色條帶時(shí)，CL無紅色條帶,代表結(jié)果不可行，需要重新檢測(cè)。

2.本發(fā)明中實(shí)施例所涉及的試劑和儀器：

本發(fā)明中實(shí)施例所涉及的試劑：抗熒光素抗體(anti-FITC)，金納米粒子偶聯(lián)的鏈霉素親和素(SA-G)及生物素偶聯(lián)的牛血清蛋白(B-BSA)購于Resenbio公司。背板、樣品墊、金標(biāo)墊、纖維膜及吸水墊購于Jie-Yi公司。Loopamp Kit(Eiken Chemical Co.Ltd.,Tokyo,Japan)購于日本榮研公司。DNA提取試劑盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)購于德國Qiagen公司。DL100DNA Marker購于寶生物工程(大連)有限公司。其余試劑均為市售分析純產(chǎn)品。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器：恒溫實(shí)時(shí)濁度儀LA-320C(Eiken Chemical Co.,Ltd,Japan)購于日本榮研公司。電泳設(shè)備為北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad Gel Dox XR,美國Bio-Rad產(chǎn)品。

3.本發(fā)明中實(shí)施例所涉及的方法

基因組提取：副溶血性弧菌及其他細(xì)菌的基因組DNA的提取使用Qiagen公司的DNA提取試劑盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)，按照說明書進(jìn)行操作。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定基因組DNA的濃度和純度，副溶血性弧菌的DNA用GE緩沖液連續(xù)稀釋(從10ng、10pg、10fg、1fg到0.1fg/微升)。各種基因組DNA均少量分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

連續(xù)稀釋的副溶血性弧菌DNA用于MCDA擴(kuò)增的最佳溫度的探索及擴(kuò)增體系的建立。以常見的致病菌及條件致病菌DNA為模板評(píng)價(jià)V.parahaemolyticus-MCDA-LFB技術(shù)的特異性。菌株信息見表2。

4.本發(fā)明實(shí)施例所涉及的引物設(shè)計(jì)

本發(fā)明建立針對(duì)副溶血性弧菌的快速、敏感和特異的MCDA-LFB檢測(cè)體系，以驗(yàn)證、評(píng)價(jià)MCDA-LFB技術(shù)。在本發(fā)明中，針對(duì)副溶血性弧菌的特異基因toxR設(shè)計(jì)一套MCDA擴(kuò)增引物，旨在驗(yàn)證MCDA-LFB技術(shù)的可行性、敏感性、特異性及可靠性。引物設(shè)計(jì)示意圖見圖2。引物序列及修飾見表1。

表1針對(duì)toxR基因設(shè)計(jì)的引物序列及修飾

^aCP1*，該引物用于MCDA-LFB檢測(cè)體系，在5’端標(biāo)記生物素；C1*，該引物用于MCDA-LFB檢測(cè)體系，在5’端標(biāo)記熒光素；^bmer，monomeric unit(單體單元)；nt，nucleotide(核苷酸)。

實(shí)施例1.MCDA-LFB擴(kuò)增的可行性

標(biāo)準(zhǔn)的MCDA反應(yīng)體系：交叉引物CP1*和CP1的濃度為30pmol,交叉引物CP2的濃度為60pmol，置換引物F1和F2的濃度為10pmol,擴(kuò)增引物R1、R2、D1和D2的濃度為30pmol，擴(kuò)增引物C1*和C2的濃度為20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶緩沖液，10U的鏈置換DNA聚合酶，1μL的模板，補(bǔ)加去離子水至25μL。整個(gè)反應(yīng)恒溫在65℃1小時(shí)，85℃5min終止反應(yīng)。

MCDA擴(kuò)增之后，三種檢測(cè)方法用于MCDA擴(kuò)增判別，首先，在反應(yīng)混合物中加入可視染料(如HNB試劑、萘羥基酚藍(lán)可視試劑)，陽性反應(yīng)管的顏色從紫色變?yōu)樗{(lán)色，陰性反應(yīng)管則保持原來的紫色。 其次，MCDA產(chǎn)物可以通過瓊脂糖電泳后檢測(cè)擴(kuò)增子，由于產(chǎn)物中包含了不同大小的擴(kuò)增片段，因此陽性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖呈特異性階梯狀，陰性反應(yīng)不出現(xiàn)任何條帶。更為直接簡單的方法為通過LFB對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

可視顏色變化法：MCDA在合成DNA的同時(shí)產(chǎn)生大量的陽離子，陽離子能夠改變反應(yīng)管中的PH，從而使HNB顏色發(fā)生改變。因此，可以通過反應(yīng)管顏色變化判讀結(jié)果，陽性反應(yīng)管從紫色變?yōu)樗{(lán)色，陰性反應(yīng)保持紫色不變，見圖3A。A1表示陽性擴(kuò)增(反應(yīng)管中加入10pg的副溶血性弧菌模板，作為陽性對(duì)照)，A2表示陰性擴(kuò)增(反應(yīng)管中加入10pg的Gram⁺糞腸球菌模板，作為陰性對(duì)照)，A3表示陰性擴(kuò)增(反應(yīng)管中加入10pg的Gram^-志賀菌模板，作為陰性對(duì)照)，A4表示空白對(duì)照反應(yīng)(1微升的雙蒸水代替10pg的模板，作為空白對(duì)照)。只有陽性對(duì)照出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，說明針對(duì)toxR設(shè)計(jì)的檢測(cè)副溶血性弧菌的MCDA引物可用。

電泳檢測(cè)法：將圖3A的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，由于MCDA的擴(kuò)增產(chǎn)物包含了許多大小不一的短片段及一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)不同大小區(qū)帶組成的階梯式圖譜，見圖3B。通過電泳檢測(cè)法判讀MCDA擴(kuò)增結(jié)果，陽性反應(yīng)出現(xiàn)了預(yù)期的結(jié)果，而陰性反應(yīng)和空白對(duì)照未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究所設(shè)計(jì)的MCDA引物可行，能夠用于靶序列擴(kuò)增檢測(cè)。

LFB檢測(cè)：將圖3A的產(chǎn)物進(jìn)行LFB檢測(cè)。由于針對(duì)副溶血性弧菌檢測(cè)的MCDA引物標(biāo)記的半抗原為FITC(熒光素)，因此，當(dāng)TL和CL出現(xiàn)紅色條帶時(shí)表示為副溶血性弧菌檢測(cè)陽性。通過LFB檢測(cè)法判讀MCDA擴(kuò)增結(jié)果，陽性反應(yīng)出現(xiàn)了預(yù)期的結(jié)果，而陰性反應(yīng)和空白對(duì)照僅出現(xiàn)CL紅色條帶，驗(yàn)證了本研究所設(shè)計(jì)的LFB，MCDA-LFB技術(shù)及MCDA引物可行，能夠用于目的靶序列的檢測(cè)(見圖3C)。

實(shí)施例2.測(cè)定MCDA技術(shù)的最佳反應(yīng)溫度

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系條件下，加入針對(duì)副溶血性弧菌DNA模板及所設(shè)計(jì)的對(duì)應(yīng)的MCDA引物，其模板濃度為10pg/μl。反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行(60-67℃)，結(jié)果運(yùn)用實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行檢測(cè)，在不同的溫度下得到不同的動(dòng)態(tài)曲線圖，見圖4。61-64℃(圖4B-E)被推薦作為MCDA引物的最佳反應(yīng)溫度。本發(fā)明中的后續(xù)驗(yàn)證選擇62℃作為恒溫條件進(jìn)行MCDA擴(kuò)增。圖4表示針對(duì)toxR基因序列設(shè)計(jì)的檢測(cè)副溶血性弧菌的MCDA引物溫度動(dòng)態(tài)曲線圖。

實(shí)施例3.MCDA-LFB檢測(cè)單一靶標(biāo)的靈敏度

運(yùn)用連續(xù)稀釋好的副溶血性弧菌基因組DNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的MCDA擴(kuò)增反應(yīng)后，運(yùn)用LFB檢測(cè)顯示：MCDA-LFB的檢測(cè)范圍為10ng～10fg，LFB在TL和CL區(qū)域出現(xiàn)紅色線(圖5A)。當(dāng)反應(yīng)體系中基因組模板量降低至10fg以下時(shí)，LFB僅在CL區(qū)域出現(xiàn)紅色線，表示陰性結(jié)果(圖5A4-A5)。圖5A運(yùn)用LFB可視化讀取MCDA擴(kuò)增結(jié)果；圖5A1到A5表示副溶血性弧菌的模板量為10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，A6、A7、A8分別表示糞腸球菌(10pg)、志賀菌模板(10pg)、空白對(duì)照(1微升雙蒸水)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證MCDA-LFB檢測(cè)副溶血性弧菌的敏感性，另外3種檢測(cè)方法用于MCDA擴(kuò)增結(jié)果判別，進(jìn)一步確認(rèn)MCDA-LFB的檢測(cè)靈敏度。首先，MCDA產(chǎn)物可以通過瓊脂糖電泳后檢測(cè)擴(kuò)增子，由于產(chǎn)物中包含了不同大小的擴(kuò)增片段，因此陽性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖呈特異性階梯狀，陰性反應(yīng)不出現(xiàn)任何條帶。檢測(cè)顯示：V.parahaemolyticus-MCDA的檢測(cè)范圍為10ng～10fg，陽性反應(yīng)出現(xiàn)階梯條帶(圖5B1-B3)。當(dāng)反應(yīng)體系中基因組模板量降低至10fg以下時(shí)，不出現(xiàn)特異的階梯條帶，表示陰性結(jié)果(圖5B4-B5)。圖5B運(yùn)用電泳法讀取MCDA擴(kuò)增結(jié)果；圖5C1到C5表示副溶血性弧菌的模板量為10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，C6、C7、C8分別表示糞腸球菌(10pg)、志賀菌模板(10pg)，空白對(duì)照(1微升雙蒸水)。其次，在反應(yīng)混合物中預(yù)先加入可視染料(如HNB試劑，萘羥基酚藍(lán))，陽性反應(yīng)管的顏色從紫色變?yōu)樗{(lán)色，陰性反應(yīng)管則保持原來的紫色。檢測(cè)顯示：V.parahaemolyticus-MCDA的檢測(cè)范圍為10ng～10fg，陽性擴(kuò)增管變?yōu)樗{(lán)色(圖5C1-5C3)。當(dāng)反應(yīng)體系中基因組模板量降低至10fg以下時(shí)，反應(yīng)不出現(xiàn)藍(lán)色，仍然為紫色，表示陰性結(jié)果(圖5C4-C5)。圖5C運(yùn)用可視法讀取MCDA擴(kuò)增結(jié)果；圖5C1到C5表示副溶血性弧菌的模板量為10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，4C6、4C7、4C8分別表示糞腸球菌(10pg)、志賀菌模板(10pg)、空白對(duì)照(1微升雙蒸水)。其三，實(shí)時(shí)濁度儀用于分析MCDA擴(kuò)增(圖5D)。運(yùn)用連續(xù)稀釋好的副溶血性弧菌基因組DNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的MCDA擴(kuò)增反應(yīng)后，運(yùn)用實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行結(jié)果判定，檢測(cè)顯示：V.parahaemolyticus-MCDA的檢測(cè)范圍為10ng～10fg，陽性擴(kuò)增濁度曲線被觀察到(圖5D)。當(dāng)反應(yīng)體系中基因組模板量降低至10fg以下時(shí)，不出現(xiàn)陽性擴(kuò)增濁度曲線，表示陰性結(jié)果(圖5D4-D5)。圖5D運(yùn)用實(shí)時(shí)濁度儀可視化讀取MCDA擴(kuò)增結(jié)果；圖5D1到D5表示副溶血性弧菌的模板量為10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，D6、D7、D8分別表示糞腸球菌(10pg)、志賀菌模板(10pg)、空白對(duì)照(1微升雙蒸水)。

實(shí)施例4.測(cè)定MCDA-LFB技術(shù)的最佳反應(yīng)時(shí)間

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系條件下，加入副溶血性弧菌DNA模板(連續(xù)稀釋)及針對(duì)toxR基因所設(shè)計(jì)的對(duì)應(yīng)的MCDA引物。運(yùn)用連續(xù)稀釋好的副溶血性弧菌基因組DNA作為模板。反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行(62℃)，恒溫時(shí)間分別10分鐘、20分鐘、30分鐘和40分鐘。運(yùn)用LFB檢測(cè)顯示：MCDA-LFB技術(shù)在檢測(cè)副溶血性弧菌時(shí)，最佳反應(yīng)時(shí)間為30分鐘(圖6)。當(dāng)MCDA體系在擴(kuò)增步驟恒溫30分鐘時(shí)，檢測(cè)限水平的模板能夠被檢出(圖6C)。圖6C中，LFB的檢測(cè)范圍為10ng～10fg，LFB在TL和CL區(qū)域出現(xiàn)紅色線(LFB1-LFB3)。當(dāng)反應(yīng)體系中基因組模板量降低至10fg以下時(shí)，LFB僅在CL區(qū)域出現(xiàn)紅色線，表示陰性結(jié)果(LFB4-LFB5)。圖6運(yùn)用LFB可視化讀取MCDA體系從10分鐘到40分鐘的擴(kuò)增結(jié)果；LFB1到LFB5表示副溶血性弧菌的模板量為10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，LFB6、LFB7、LFB8分別表示糞腸球菌模板(10pg)、志賀菌模板(10pg)、空白對(duì)照(1微升雙蒸水)。

實(shí)施例5.測(cè)定MCDA-LFB技術(shù)的特異性

以常見的致病菌及條件致病菌DNA(副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特菌、沙門菌、志賀菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌、蠟樣芽胞桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌等)為模板評(píng)價(jià)V.parahaemolyticus-MCDA-LFB技術(shù)的特異性(菌株信息詳見表2)。V.parahaemolyticus-MCDA-LFB技術(shù)能準(zhǔn)確的鑒別副溶血性弧菌，說明MCDA-LFB方法的特異性良好，見圖7。圖7中，LFB1-20：副溶血性弧菌模板；LFB21-59，非副溶血性弧菌模板；LFB60,空白對(duì)照。結(jié)果表明，MCDA-LFB能夠正確檢測(cè)靶序列。

表2.菌株信息

^aU，unidentified serotype(未鑒別的血清型)；ATCC，American Type Culture Collection(美國模式培養(yǎng)物保藏所)；ICDC，National Institute for Communicable Disease Control Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention(中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所).

序 列 表

<110> 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所

<120> 多交叉擴(kuò)增結(jié)合金納米生物傳感檢測(cè)副溶血性弧菌的方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 1

gaatctcagt tccgtcagat 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 2

tcatacgagt ggttgctg 18

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 3

ccagttgttg atttgcgggt gtggtgagta tcagaacgta c 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 4

ccagttgttg atttgcgggt gtggtgagta tcagaacgta c 41

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 5

accatgcaga agactcgtta cccatgaatg tagttcaaaa tcagct 46

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 6

ccagttgttg atttgcgggt g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 7

ccagttgttg atttgcgggt g 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 8

accatgcaga agactcgtta cc 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 9

atttacaggt gtcatcactg 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 10

gtggaagtga ttgccact 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 11

actgctcaat agaaggcaa 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 12

gcattgaacg ctacgttaag 20