本發明涉及一種從香青蘭中提取分離得到刺槐素的方法。

背景技術：

經文獻檢索，刺槐素的提取方法已有一些文獻報道：

陳政雄(中藥黃酮類的研究VIII.野菊花成分的研究(第一報)[J].藥學學報，1962(06).)首次報道從野菊花分離得到刺槐素的結構，該工藝采用提取、萃取、重結晶、水解等技術聯合從野菊花菊中分離得到刺槐素，操作復雜、步驟繁瑣且產量低。

刺槐素的結構式為：

陳維佳(野菊花化學成分及總黃酮提取工藝研究[D].山東中醫藥大學，2009.)采用乙醇回流提取、萃取、硅膠柱、SephadexLH-20柱反復柱層析從6kg的野菊花中分離得到11.8mg刺槐素，工藝操作復雜且產量低。

丁智慧(飛機草中的化學成分[J].天然產物研究與開發，2001，13(5)：22-24.)采用甲醇回流提取、萃取、硅膠柱反復柱層析從2.48kg的飛機草中分離得到0.318g刺槐素，該工藝操作步驟繁瑣。

同時，有3篇與刺槐素提取方法有關的中國專利：

王秀敏等的發明專利(從野菊花中分離制備刺槐素單體的方法：CN，CN 103193748 A[P].)采用提取、大孔樹脂柱色譜、水解、高速逆流色譜法等技術從1kg野菊花植物分離得到10mg刺槐素，該工藝采用了5種技術聯合進行分離，操作復雜、成本較高、收率低。

卞毓平等的發明專利(一種從菊花中提取刺槐素的方法：CN，CN 102491964 A[P].)采用萃取、大孔樹脂、聚酰胺柱層析和重結晶等技術從10kg菊花植物中分離得到1.2g的刺槐素，操作復雜、步驟繁瑣。

劉曉秋等的發明專利(一種柳穿魚黃酮及其總黃酮的制備方法和用途CN，CN 101475619 A[P].)采用回流提取、大孔樹脂、聚酰胺柱層析、硅膠柱層析和SephadexLH-20柱層析等技術分離得到刺槐素，該工藝采用5種技術聯合進行分離，操作復雜、步驟繁瑣。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種從香青蘭中提取分離得到刺槐素的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

a、將香青蘭干燥的地上部分粉碎，用5～10倍量的40％～95％乙醇浸泡12～24h；

b、采用滲漉法，香青蘭藥材與40％～95％乙醇比例1∶30～40，流速1～6mL/min，收集滲漉液；

c、滲漉液用孔徑0.1～10mm的網孔過濾1～5次，濾液合并；

d、用減壓蒸餾裝置，在壓力：0.08～0.1Mpa，溫度：30～60℃下，蒸餾除去乙醇得0.8～1.2g/mL的稠浸膏；水浴干燥后得浸膏粉；

e、將浸膏粉采用70％～100％乙醇溶解后干法拌樣，上100～200目聚酰胺進行柱層析，采用20～95％乙醇梯度洗脫，并收集60～75％乙醇梯度的洗脫液，每個梯度洗脫液為4～5倍量柱體積；洗脫液用減壓蒸餾裝置，在壓力：0.08～0.1Mpa，溫度：40～60℃下蒸干得浸膏粉；

f、為了進一步純化所得浸膏粉，濾去雜質，采用95％乙醇對浸膏粉進行重結晶，所得制備液用減壓蒸餾裝置，在壓力：0.08～0.1Mpa，溫度：40～60℃下蒸干得單體刺槐素。

有益技術效果

本專利采用聚酰胺柱層析和重結晶技術聯合的方法，方法簡單，步驟簡短。從1kg香青蘭植物中分離得到0.71g的刺槐素，轉移率較高。

本發明獲得的刺槐素純度高，達到99％。

附圖說明

下面將結合附圖和具體實施方式對本發明的上述和其他目的、特征和優點作出進一步詳細的說明。

圖1為本發明提供方法的工藝流程圖；

圖2為根據本發明一個實施例所制備的刺槐素的紫外光譜(UV)圖；

圖3為根據本發明一個實施例所制備的刺槐素的紅外光譜(IR)圖；

圖4為根據本發明一個實施例所制備的刺槐素的電噴霧質譜(ESI-MS)圖；

圖5為根據本發明一個實施例所制備的刺槐素的核磁共振氫譜(¹H-NMR)圖；

圖6為根據本發明一個實施例所制備的刺槐素的核磁共振碳譜(¹³C-NMR)圖。

具體實施方式

本發明提供的一種刺槐素的制備方法，包括獲得香青蘭的提取物，以及對提取物進一步純化、層析、結晶等步驟。下面結合附圖，詳述本發明所提供的方法。

如圖1所示，首先，將1份重量的香青蘭干燥的地上部分粉碎，用15～25重量倍數的40～95vol％的醇溶液提取，例如可以選用乙醇或甲醇或丙醇或它們的任意混合物滲漉提取1～2次，每次提取6～24h。然后，將提取液濃縮，例如可以采用減壓濃縮的方法，濃縮后提取液呈膏狀。之后再將膏狀物干燥，例如可以采用真空干燥的方法，將膏狀物制成浸膏粉。

將浸膏粉用醇溶液純化，得到溶液。純化用的醇溶液包括，但不限于甲醇、乙醇、丙醇，以及它們的任意組合。優選乙醇，純化的次數一般為1～2次。

將純化后的溶液置于60℃水浴鍋中拌入聚酰胺粉，不斷攪拌直至溶劑揮干，聚酰胺拌入量為浸膏量的1/5。

將拌好樣品，進行聚酰胺柱層析。層析的步驟可以為：加適量水于拌樣聚酰胺中，使其呈混懸狀上樣。上柱完畢后，按梯度比例通入流動相進行洗脫。流動相采用復合洗脫劑，該復合洗脫劑由A組分和B組分構成，復合洗脫劑中A組分為乙醇且B組分為蒸餾水時，A組分與B組分的體積比為0∶100、2∶3、1∶1、3∶2、3∶1、11∶1。例如流動相可以采用乙醇-水或乙酸乙酯-乙醇，優選乙醇-水。此時刺槐素的組分主要在流動相乙醇-蒸餾水體積比為3∶2、3∶1時被洗脫。最后，合并相同組分洗脫液并濃縮，得到得到浸膏粉。

進一步地，為了提高刺槐素的收率，還可利用醇溶液，特別是95vol％的乙醇-水溶液，再對上述浸膏粉進行重結晶，即得到淡黃色粉末狀結晶，為刺槐素成品，其純度可達98％以上。經UV、IR、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR對所得組分的結構進行鑒定，可知其為刺槐素。

圖2、圖3為根據本發明的制備方法制備的刺槐素的UV圖譜和IR圖譜。

圖4為根據本發明的制備方法制備的刺槐素的ESI-MS圖譜，根據刺槐素的ESI-MS的分析可知，ESI-MS特征峰在m/z 285.20[M⁺](正離子)，m/z 250.2[M+2OH^-]，m/z 302.4[M⁺+CH₃]，m/z330.4[M⁺+2OCH₃^-]。再結合圖5、圖6所示的根據本發明的制備方法制備的刺槐素的NMR圖譜分析，可確定其分子量為284.2，分子式為C₁₆H₁₂O₅，其中，¹H-NMR(400MHz，DMSO)圖譜中表現出典型的黃酮苷類化合物的氫譜特征，通過耦合常數及化學位移可確定每個氫的歸屬，δ：12.92(1H，S，5-OH)，8.04(2H，d，J＝8.8Hz，H-2′，6′)，7.11(2H，d，J＝8.8Hz，H-3′，5′)，6.87(1H，d，H-3)，6.50(1H，d，J＝1.7Hz，H-8)，6.20(1H，d，J＝1.7Hz，H-6)，3.86(3H，s，OCH3)；¹³C-NMR(DMSO，400MHz)圖譜中呈現出16個碳信號，為1個CH3，8個CH，7個季碳，δc表明分子中含一個羰基(δ181.78)，δ：163.29(C-2)，103.54(C-3)，181.78(C-4)，164.39(C-7)，162.32(C-4′)，161.46(C-9)，128.34(C-2′，6′)，122.84(C-1′)，114.60(C-3′，5′)，103.71(C-10)，98.95(C-8)，94.07(C-6)，55.57(OCH3)。因此，可確定所得化合物為刺槐素。

下面通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。

實施例1：從香青蘭中提取分離得到刺槐素的方法，按以下步驟進行：

a、將香青蘭干燥的地上部分粉碎，用10倍量的40％乙醇浸泡24h；

b、采用滲漉法，香青蘭藥材3.6kg與75％乙醇比例1∶40，流速6mL/min，收集乙醇滲漉液；

c、滲漉液用孔徑0.5mm的網孔過濾2次，濾液合并；

d、用減壓蒸餾裝置，在壓力：0.08Mpa，溫度：30～60℃下，蒸餾除去乙醇得1.2g/mL的稠浸膏；水浴干燥后得浸膏粉500g；

e、將100g浸膏粉采用70％乙醇溶解后干法拌樣，上100～200目聚酰胺進行柱層析，采用40～95％乙醇梯度洗脫，得到洗脫液共90000mL，并收集60～75％乙醇梯度的洗脫液38000mL，每個梯度洗脫液為4倍量柱體積；洗脫液用減壓蒸餾裝置，在壓力：0.1Mpa，溫度：40℃下蒸干得浸膏粉10.0g；

f、為了進一步純化所得浸膏粉，濾去雜質，采用100倍量的95％乙醇對所述浸膏粉進行重結晶，所得制備液用減壓蒸餾裝置，在壓力：0.08Mpa，溫度：40℃下蒸干得淡黃色結晶0.51g。

一、結構鑒定：取所得樣品分別對UV、IR、MS、NMR進行歸峰解譜，確定實施例1所提純的樣品為刺槐素。

二、純度鑒定：

熔點(mp)測定：263℃～265℃。

薄層色譜檢測：采用兩種展開體系進行檢測，薄層板用聚酰胺薄膜。展開劑A為乙醇-甲酸水(體積比為1∶1)，R_fA為0.33；展開劑B為乙酸乙酯-95％乙醇(體積比為6∶4)，R_fB為0.61，紫外365nm下見黃色斑點，無雜質點。

HPLC檢測：用HPLC外標法測定含量，選定260nm和330nm為檢測波長。選用乙腈-0.1％磷酸水溶液(80∶20，V/V)為流動相，以刺槐素為對照品。精密稱取實施例1制備的淡黃色粉末2.50mg于100mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度線。經Waters分析型高效液相色譜檢測，外標法定量，其純度為99.12％。

得率計算：

刺槐素濃度為24.78μg·mL^-1，香青蘭中刺槐素的量為2.88g/kg。

得率＝(24.78μg·mL^-1×100mL)/(2.50mg×3600g/2.56g×2.88g/kg)×100％＝24.47％

經檢測，實施例1提取得到的刺槐素的純度為99.16％，得率為24.47％。

實施例2：從香青蘭中提取分離得到刺槐素的方法，按以下步驟進行：

a、將香青蘭干燥的地上部分粉碎，用10倍量的75％乙醇浸泡18h；

b、采用滲漉法，香青蘭藥材3.0kg與75％乙醇比例1∶35，流速6mL/min，收集乙醇滲漉液；

c、滲漉液用孔徑0.1mm的網孔過濾1次，濾液合并；

d、用減壓蒸餾裝置，在壓力：0.09Mpa，溫度：60℃下，蒸餾除去乙醇得1.0g/mL的稠浸膏；水浴干燥后得浸膏粉410g；

e、將100g浸膏粉采用70％乙醇溶解后干法拌樣，上100～200目聚酰胺進行柱層析，采用40～75％乙醇梯度洗脫得到洗脫液共75000mL，并收集60～75％乙醇梯度的洗脫液35000mL，每個梯度洗脫液為4倍量柱體積；洗脫液用減壓蒸餾裝置，在壓力：0.1Mpa，溫度：50℃下蒸干得浸膏粉9.50g；

f、為了進一步純化所得浸膏粉，濾去雜質，采用100倍量的95％乙醇對所述浸膏粉進行重結晶，所得制備液用減壓蒸餾裝置，在壓力：0.10Mpa，溫度：40℃下蒸干得淡黃色結晶0.49g。

一、結構鑒定：取所得樣品分別對UV、IR、MS、NMR進行歸峰解譜，確定實施例2所提純的樣品為刺槐素。

二、純度鑒定：

熔點(mp)測定：263℃～265℃。

薄層色譜檢測：采用兩種展開體系進行檢測，薄層板用聚酰胺薄膜。展開劑A為乙醇-甲酸水(體積比為1∶1)，R_fA為0.34；展開劑B為乙酸乙酯-95％乙醇(體積比為6∶4)，R_fB為0.61，紫外365nm下見黃色斑點，無雜質點。

HPLC檢測：用HPLC外標法測定含量，選定260nm和330nm為檢測波長。選用乙腈-0.1％磷酸水溶液(80∶20，V/V)為流動相，以刺槐素為對照品。精密稱取實施例2制備的淡黃色粉末2.50mg于100mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度線。經Waters分析型高效液相色譜檢測，外標法定量，其純度為99.36％，得率為22.85％。

實施例3：從香青蘭中提取分離得到刺槐素的方法，按以下步驟進行：

a、將香青蘭干燥的地上部分粉碎，用10倍量的40％乙醇浸泡18h；

b、采用滲漉法，香青蘭藥材4.0kg與70％乙醇比例1∶35，流速6mL/min，收集乙醇滲漉液；

c、滲漉液用孔徑0.1mm的網孔過濾2次，濾液合并；

d、用減壓蒸餾裝置，在壓力：0.1Mpa，溫度：60℃下，蒸餾除去乙醇得1.2g/mL的稠浸膏；水浴干燥后得浸膏粉550g；

e、將100g浸膏粉采用70％乙醇溶解后干法拌樣，上100～200目聚酰胺進行柱層析，采用30～75％乙醇梯度洗脫得到洗脫液共95000mL，并收集60～75％乙醇梯度的洗脫液40000mL，每個梯度洗脫液為4.5倍量柱體積；洗脫液用減壓蒸餾裝置，在壓力：0.1Mpa，溫度：50℃下蒸干得浸膏粉10.3g；

f、為了進一步純化所得浸膏粉，濾去雜質，采用100倍量的95％乙醇對所述浸膏粉進行重結晶，所得制備液用減壓蒸餾裝置，在壓力：0.10Mpa，溫度：60℃下蒸干得淡黃色結晶0.52g。

一、結構鑒定：取所得樣品分別對UV、IR、MS、NMR進行歸峰解譜，確定實施例3所提純的樣品為刺槐素。

二、純度鑒定：

熔點(mp)測定：263℃～265℃。

薄層色譜檢測：采用兩種展開體系進行檢測，薄層板用聚酰胺薄膜。展開劑A為乙醇-甲酸水(體積比為1∶1)，R_fA為0.34；展開劑B為乙酸乙酯-95％乙醇(體積比為6∶4)，R_fB為0.61，紫外365nm下見黃色斑點，無雜質點。

HPLC檢測：用HPLC外標法測定含量，選定260nm和330nm為檢測波長。選用乙腈-0.1％磷酸水溶液(80∶20，V/V)為流動相，以刺槐素為對照品。精密稱取實施例2制備的淡黃色粉末2.50mg于100mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度線。經Waters分析型高效液相色譜檢測，外標法定量，其純度為97.89％，得率為24.35％。