本發明屬于基因工程領域，具體涉及適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達盒PhT7，還涉及含有該表達盒表達載體及該載體的應用。

背景技術：

鏈霉菌是一類重要的次級代謝產物生產菌，有重要價值的抗生素等次級代謝產物約80％由鏈霉菌產生。很多鏈霉菌產生的次級代謝產物都具有很高的應用價值，構建相應的高產菌株可以有效降低成本，提高生產效率。目前常用的構建次級代謝產物高產菌株的方法包括提升限速步驟酶活、增強基因簇內正調控基因的表達、敲除負調控基因、改造與倍增次級代謝產物生物合成基因簇等。在這些方法中，提升限速步驟酶活與增強基因簇內正調控基因的表達這兩種方法最為簡單易行，僅需要通過整合型載體導入對應的基因表達盒即可，也得到了廣泛的應用。已有部分高效表達系統用于鏈霉菌次級代謝產物的產量提升等研究，但是這些系統不同程度的存在轉錄量不夠高或者在不同種的鏈霉菌間通用性不好等問題。

T7RNA聚合酶來源于大腸桿菌T7噬菌體，T7RNA聚合酶-T7啟動子系統由于其特異性與高效性，是目前在大腸桿菌中應用最廣泛的蛋白表達系統之一。理論上，只要在鏈霉菌中穩定表達T7RNA聚合酶，在該菌株中即可利用T7啟動子大量表達目的基因。但是與大腸桿菌相比，鏈霉菌的基因組GC含量更高，T7RNA聚合酶中有大量的密碼子在鏈霉菌中的使用頻率很低，這會使得T7RNA聚合酶的鏈霉菌中的表達受到影響。想要使T7RNA聚合酶-T7啟動子系統在鏈霉菌中高效運行，對T7RNA聚合酶所有序列根據鏈霉菌的密碼子使用偏好性進行優化是必需的。因此，有必要提供一套適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶-T7啟動子高效表達系統用于次級代謝產物的超量表達。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達盒PhT7；本發明的目的之二在于提供含有所述適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達盒PhT7的高效表達載體；本發明的目的之三在于提供適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達盒PhT7的應用；本發明的目的之四在于提供高效表達載體的應用。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達盒PhT7，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、含有所述適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達盒PhT7的高效表達載體。

優選的，所述高效表達載體由以下方法構建：將SEQ ID NO.1所示序列經SpeI和EcoRI酶切后連入經XbaI和EcoRI酶切的pSET152質粒，獲得pPAT載體，然后再將SEQ ID NO.2所示序列經EcoRI酶切后連入經同樣酶切的pPAT載體，得到高效表達載體pPhT7-PAT。

3、所述適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達盒PhT7在提高鏈酶菌次級代謝產物產量中的應用。

4、所述高效表達載體在提高鏈酶菌次級代謝產物產量或表達重組蛋白中的應用。

本發明的有益效果在于：本發明公開了適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達盒PhT7，該表達盒根據鏈霉菌的密碼子偏好優化設計，能夠在鏈霉菌中高效表達，可用于提高鏈霉菌次級代謝產物的產量和高效表達重組蛋白，并縮短發酵時間，具有很好的應用前景。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：

圖1為高效表達激活子的重組菌株與野生型菌株的放線紫紅素產量對比，WT：野生型菌株Streptomyces coelicolor M145，S1：高效表達放線紫紅素的重組菌株Streptomyces coelicolor M145/pPhT7-PA2O4T。

圖2為高效表達激活子的重組菌株與野生型菌株的生長量(干重)，WT：野生型菌株Streptomyces coelicolor M145，S1：高效表達放線紫紅素的重組菌株Streptomyces coelicolor M145/pPhT7-PA2O4T。

具體實施方式

下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。

本發明中放線紫紅素(actinorhodin，ACT)產量的測定采用比色法，具體方法如下：取1ml發酵液，加入1ml 2M氫氧化鉀混合均勻，5000g離心5min后，取1ml上清測定其OD₆₄₀值。

實施例1、構建適用于鏈霉菌的高效表達載體pPhT7-PAT

擴增目的基因表達盒PAT：以pNgrR為模板，引物對PT7F與T7TER進行PCR擴增，其中PT7F與T7TER序列如下：

PT7F：aattactagtctcgatcccgcgaaattaata(下劃線表示SpeI酶切位點)(SEQ ID NO.1)；

T7TER：aattgaattcatccggatatagttcctcctttc(下劃線表示EcoRI酶切位點)(SEQ ID NO.2)；

PCR擴增程序如下：95℃5min變性；95℃30s，60℃30s，72℃30s擴增30個循環； 72℃10min；

擴增獲得目的基因表達盒PAT，具體如SEQ ID NO.3所示。將擴增產物用SpeI和EcoRI酶切處理后與經XbaI和EcoRI酶切的pSET152質粒相連，得到載體pPAT。

再根據模式菌株天藍色鏈霉菌的密碼子使用頻率對大腸桿菌T7噬菌體T7RNA聚合酶進行優化，然后合成T7RNA聚合酶表達盒pPhT7，具體序列如SEQ ID NO.4所示，該序列上游包含了鏈霉菌組成型表達啟動子P_hrdB，下游含有密碼子優化后的T7RNA聚合酶序列，然后將SEQ ID NO.4所示序列用EcoRI酶切后連入經同樣酶切的pPAT質粒，得到鏈霉菌高效表達載體pPhT7-PAT。

實施例2、表達載體pPhT7-PA2O4T的構建

根據actII-ORF4序列(NCBI登錄號AF335989.1)設計擴增放線紫紅素生物合成的激活子actII-ORF4的引物，具體序列如下：

A2O4F:5’-aattcatatgagattcaacttattgggac-3’(SEQ ID NO.5)(下劃線表示NdeI酶切位點)；

A2O4R:5’-aattagatctctacacgagcaccttctcaccg-3’(SEQ ID NO.6)(下劃線表示BglII酶切位點)；

然后以天藍色鏈霉菌Streptomyces coelicolor M145基因組DNA為模板，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6為引物，進行PCR擴增，PCR擴增條件為：95℃5min變性；95℃30s，65℃30s，72℃30s擴增30個循環；72℃10min。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并回收目的條帶，然后將回收產物用NdeI與BglII進行雙酶切，然后將酶切產物連接經NdeI與BamHI酶切的pPhT7-PAT載體，得到表達載體pPhT7-PA2O4T。

實施例3、放線紫紅素的高效表達

將表達載體pPhT7-PA2O4T利用大腸桿菌-鏈霉菌種間接合轉移的方法導入Streptomyces coelicolor M145菌株(WT)中，獲得重組菌株，命名為Streptomyces coelicolor M145/pPhT7-PA2O4T(S1)。將重組菌株在種子培養液YEME中以200rpm，28℃培養48h，以1％接種量接種至R5培養基中以200rpm，28℃培養192h，每隔24h取一次樣檢測放線紫紅素和菌株濃度。同時將野生型Streptomyces coelicolor M145菌株按照相同方式培養與取樣，作為對照。

放線紫紅素檢測結果如圖1所示。結果顯示與野生型菌株相比，重組菌株在48h時即開始大量表達放線紫紅素，且在144h時就能達到最高產量(約為對照菌株最高產量的15.7倍)，而對照菌株在72h后才開始大量表達放線紫紅素，且在192h時才達到最高產量。菌株濃度檢 測結果如圖2所示，結果顯示重組菌株的生長狀況與野生型菌株相比則沒有明顯差別。該結果說明本方法可以應用于鏈霉菌，大幅提升次級代謝產物的產量，并有效縮短發酵時間。

雖然本發明已經以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可以作各種改動與修飾，包括但不限定于替換T7RNA聚合酶啟動子、替換表達的目的基因、替換作用的宿主鏈霉菌等。因此，本發明的保護范圍應當以權利要求書界定的為準。

最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。

<110> 西南大學；

<120> 適用于鏈霉菌的T7 RNA聚合酶表達盒PhT7及其表達載體和應用

<160> 6

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物PT7F

<400> 1

aattactagt ctcgatcccg cgaaattaat a 31

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物PT7F

<400> 2

aattgaattc atccggatat agttcctcct ttc 33

<210> 3

<211> 262

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 目的基因表達盒PAT

<400> 3

ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact atagggagaa ggagacggag aatctcgacg 60

ggggcgcagc atatgaacct tggatccggt accagtactc accaccacca ccaccactga 120

gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa 180

taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga 240

ggaactatat ccggatgaat tc 262

<210> 4

<211> 3080

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7 RNA聚合酶表達盒pPhT7

<400> 4

ccgccttccg ccggaacggc ggggtccggg cacgccaaac ccctcctgtg gctgtggccg 60

gccaccgccg tcaccttcgg accccgtgga gccgctcccg gttccacggg gtccgaaggt 120

gtgatgagca ggctgcgcct tcctcgcgcg gccgcaaggt acgagttgat gaccttgttt 180

atccgcatct gaccaatttt gatcgcttac ggggtgtgac tcgggccacg cggattgggc 240

gtaacgctct tgggaacaac acgatgacct aagaggtgac agccgcggag ggaatacgga 300

cgccgttcac ggcgctgtgc atctccccgg cccgcccgca ccgtcggccc attcccaagc 360

cggtggtcgg cccctgtccg ccgtggacgg ggccggaagc cgtttttcaa cgttccgaga 420

ggttgttcat gaataccatc aacattgcga aaaacgactt ctccgatatc gagctggccg 480

cgatcccctt caataccctc gcggaccact atggcgaacg gctggcccgg gaacaactgg 540

cgctggagca cgagtcctac gagatgggcg aggcccggtt ccggaaaatg ttcgaacggc 600

agctgaaggc cggcgaagtc gccgacaacg cggccgcgaa gcccctgatc acgaccctgc 660

tgcccaagat gattgcccgc atcaacgact ggttcgaaga ggtcaaggcg aagcgcggca 720

agcgccccac ggccttccag ttcctccagg agatcaaacc cgaagccgtc gcgtacatca 780

ccatcaagac gaccctggcc tgcctcacct ccgccgacaa tacgacggtc caggcggtgg 840

cgtccgccat cggccgcgcg atcgaggacg aagcccggtt tggccgcatc cgcgatctcg 900

aggccaagca cttcaaaaag aacgtcgaag agcaactgaa caagcgcgtc ggccacgtgt 960

acaagaaggc cttcatgcag gtggtcgagg cggacatgct gtccaagggc ctgctgggcg 1020

gcgaggcgtg gtcctcctgg cacaaggagg actcgatcca cgtgggggtg cgctgcattg 1080

agatgctgat cgagtccacg gggatggtct ccctgcaccg gcagaacgcg ggggtggtcg 1140

ggcaggattc cgagaccatc gaactggccc ccgagtatgc cgaagccatc gcgacccgcg 1200

cgggcgcgct cgccggcatc tcgccgatgt tccagccctg cgtggtgccg cccaaaccgt 1260

ggaccggcat caccgggggc ggctattggg ccaacgggcg ccggcccctg gccctcgtcc 1320

ggacccactc gaagaaggcc ctgatgcgct atgaggacgt ctatatgccg gaggtctaca 1380

aggcgatcaa catcgcccaa aataccgcgt ggaagatcaa caagaaggtc ctggccgtgg 1440

ccaatgtcat cacgaaatgg aagcactgcc ccgtggagga catcccggcc atcgagcgcg 1500

aggaactccc catgaagccc gaggacatcg acatgaaccc cgaagccctc accgcgtgga 1560

aacgcgccgc ggcggcggtc taccgcaagg acaaagcgcg gaaatcccgc cgcatctccc 1620

tggagttcat gctggagcag gcgaacaagt ttgccaacca caaggcgatc tggttcccgt 1680

acaacatgga ctggcgcggg cgcgtgtatg cggtgtccat gttcaacccg cagggcaacg 1740

atatgaccaa gggcctcctc accctcgcga agggcaagcc gatcgggaag gagggctact 1800

actggctgaa gatccatggg gcgaactgcg ccggcgtcga caaagtcccg ttcccggagc 1860

ggatcaaatt catcgaggag aaccacgaga acatcatggc gtgcgccaag tcgcccctgg 1920

aaaacacctg gtgggccgag caggattcgc ccttctgctt tctggccttc tgcttcgaat 1980

acgccggggt gcaacaccat ggcctctcct acaattgctc gctgcccctg gcctttgacg 2040

gctcctgctc cggcatccag cacttctccg ccatgctgcg ggacgaagtg ggcgggcggg 2100

ccgtcaatct gctcccgtcc gagacggtcc aggacatcta cgggatcgtg gccaagaagg 2160

tcaacgaaat tctgcaggcc gacgccatca atggcacgga caacgaggtg gtgaccgtca 2220

cggacgagaa caccggcgag atttccgaga aggtcaaact gggcaccaag gccctcgccg 2280

ggcaatggct ggcgtatggc gtcacgcggt ccgtgaccaa gcggtccgtc atgacgctgg 2340

cgtacggctc gaaggagttc ggcttccggc aacaggtcct cgaagacacg atccaaccgg 2400

ccatcgactc cgggaagggc ctgatgttca cccagccgaa ccaggccgcc ggctacatgg 2460

ccaagctgat ctgggaatcg gtctcggtga ccgtcgtcgc ggccgtcgag gccatgaact 2520

ggctgaagtc cgcggccaaa ctgctggcgg cggaagtcaa agacaagaag accggggaga 2580

tcctgcgcaa gcgctgtgcc gtccactggg tcacccccga tggcttcccg gtgtggcagg 2640

agtacaaaaa gcccatccaa acgcgcctga acctgatgtt tctgggccag ttccggctcc 2700

agccgacgat caacacgaac aaggactccg agatcgacgc gcacaagcag gagtccggca 2760

tcgcccccaa ttttgtccac tcgcaagacg gctcccacct gcgcaaaacc gtggtctggg 2820

cccacgagaa gtacggcatc gagtcgtttg ccctgatcca cgactccttc ggcacgattc 2880

cggccgacgc cgccaacctc ttcaaagccg tgcgcgaaac catggtcgac acgtatgagt 2940

cctgcgacgt cctggcggac ttctatgatc aattcgcgga ccagctgcac gagtcgcagc 3000

tggacaaaat gccggcgctc cccgccaagg ggaatctgaa tctccgggac atcctcgagt 3060

ccgacttcgc gtttgcgtga 3080

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物A2O4F

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aattcatatg agattcaact tattgggac 29

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物A2O4R

<400> 6

aattagatct ctacacgagc accttctcac cg 32