本發(fā)明涉及一種輔助鑒定大豆百粒重性狀的分子標(biāo)記HNUSOY05及其應(yīng)用，屬于作物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

大豆是世界上重要的經(jīng)濟(jì)與糧食作物，是食用油和植物蛋白的主要來源之一，因此，大豆的遺傳改良工作一直受到遺傳學(xué)和育種學(xué)工作者的重點(diǎn)關(guān)注。其中，產(chǎn)量性狀具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，成為人們改良的熱點(diǎn)問題。大豆籽粒百粒重是其產(chǎn)量性狀構(gòu)成的重要因素，與產(chǎn)量呈現(xiàn)正相關(guān)，是高產(chǎn)大豆選育過程中重要的選育對(duì)象。但是，大豆籽粒百粒重性狀是一個(gè)遺傳力較高的數(shù)量性狀，受多基因控制，表型選育方式效率較低，且易受環(huán)境影響，不穩(wěn)定。隨著大豆公共遺傳連鎖圖譜的不斷完善，已有很多遺傳學(xué)和育種學(xué)工作者通過QTL定位等方式發(fā)現(xiàn)了230多個(gè)籽粒百粒重性狀相關(guān)的QTL。然后，這些已經(jīng)公布的QTL多采用SSR類分子標(biāo)記定位，在大豆選育過程中，實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，時(shí)間和人力成本較高。同時(shí)，由于大豆是嚴(yán)格自花授粉作物、且花期分散，導(dǎo)致不同大豆種質(zhì)間遺傳背景差異較大。通過QTL定位方式發(fā)掘的籽粒百粒重性狀的分子標(biāo)記對(duì)遺傳背景依賴程度高，對(duì)相同遺傳材料(即具有相同遺傳背景的大豆群體)，或相近遺傳材料，具有良好的鑒定和選擇作用，而對(duì)遺傳背景差異較大的育種材料檢出效率較差，推廣范圍有限，實(shí)際應(yīng)用程度不高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種輔助鑒定大豆百粒重性狀的分子標(biāo)記HNUSOY05，采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種輔助鑒定大豆百粒重性狀的分子標(biāo)記HNUSOY05，所述分子標(biāo)記表現(xiàn)為SEQ ID NO.1所示核苷酸序列在大豆11號(hào)染色體的1001963至1002153區(qū)間內(nèi)插入/缺失長度多態(tài)性；具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的大豆表現(xiàn)為高百粒重；缺失SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的大豆表現(xiàn)為低百粒重。

該分子標(biāo)記HNUSOY05的片段長度為191bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

本發(fā)明還提供了一種所述分子標(biāo)記HNUSOY05在大豆遺傳育種、大豆百粒重性狀輔助鑒定、大豆百粒重性狀篩選中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是提供一種所述分子標(biāo)記HNUSOY05的引物對(duì)，所述引物對(duì)的上游引物HNUSOY05F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物HNUSOY05R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明還提供了一種所述分子標(biāo)記HNUSOY05的引物對(duì)在大豆遺傳育種、大豆百粒重性狀輔助鑒定、大豆百粒重性狀篩選中的應(yīng)用。

本發(fā)明的再一目的是提供一種利用分子標(biāo)記HNUSOY05鑒定大豆百粒重性狀的方法，該方法是以待測大豆基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求3所述分子標(biāo)記HNUSOY05的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測；若檢測得到長度為637bp的單一片段，則待測大豆品種具有高百粒重性狀；若檢測得到長度為446bp的單一片段，則待測大豆品種具有低百粒重性狀。

本發(fā)明中所述高百粒重是指籽粒的百粒重≥20.0克；所述低百粒重是指籽粒百粒重≤12.0克。

優(yōu)選地，所述方法，具體步驟如下：

1)提取待檢測大豆樣品中的基因組DNA；

2)以步驟1)所得的待檢測大豆樣品基因組DNA為模板，利用分子標(biāo)記HNUSOY05的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物；每25μL所述PCR反應(yīng)體系包含2.5mmol/L MgCl₂、1U rTaq酶、800μmol/L dNTP、0.2μmol/L上游引物HNUSOY05F和下游引物HNUSOY05R、50ng模板基因組DNA；

3)利用步驟2)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；若檢測得到長度為637bp的單一片段，則待測大豆品種具有高百粒重性狀；若檢測得到長度為446bp的單一片段，則待測大豆品種具有低百粒重性狀。

優(yōu)選地，步驟2)所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)為降落PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

更優(yōu)選地，所述降落PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)?4℃預(yù)變性7min；94℃變性20s，60℃退火20s，每個(gè)循環(huán)降0.5℃，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；94℃變性20s，45℃退火20s，72℃延伸30s，10個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min。

在高百粒重的大豆中核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)物長度為637bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在低百粒重的大豆中核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)物長度為446bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本發(fā)明有益效果：

利用本發(fā)明提供的分子標(biāo)記HNUSOY05來鑒定大豆百粒重性狀表現(xiàn)(高百粒重性狀或低百粒重性狀)操作簡單、費(fèi)用低、精確度高，可實(shí)現(xiàn)快速檢測；在大豆育種過程中，可以利用本發(fā)明提供的分子標(biāo)記HNUSOY05對(duì)大豆親本或中間育種材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，選擇擴(kuò)增產(chǎn)物長度為637bp的親本或者育種材料，篩選出具有高百粒重性狀的大豆種質(zhì)材料，將極大地提高了大豆百粒重性狀的選育效率，在高產(chǎn)大豆品種的培育過程中具有重要應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明無需酶切過程即可鑒定出大豆百粒重性狀，鑒定時(shí)間短，效率高。

附圖說明

圖1為分子標(biāo)記HNUSOY05在不同大豆品種中擴(kuò)增后的電泳圖；

(Marker DL2000；1，綏農(nóng)14；2，科豐-1號(hào)；3，南農(nóng)1138-2；4，固新野生大豆；5，Acher；6，Evans；7，Peking；8，PI209332；9，合豐25)。

圖2為分子標(biāo)記HNUSOY05在84個(gè)大豆品種中擴(kuò)增后的電泳圖；

(M，Marker DL15000；1，ZDD03458；2，ZDD03515；3，ZDD08254；4，ZDD10058；5，ZDD01818；6，ZDD10039；7，ZDD10024；8，ZDD01892；9，ZDD18591；10，ZDD01291；11，ZDD07482；12，ZDD23177；13，ZDD01417；14，ZDD23601；15，ZDD01884；16，ZDD18365；17，ZDD00638；18，ZDD18525；19，ZDD19070；20，ZDD01124；21，ZDD17731；22，ZDD18887；23，ZDD17700；24，ZDD23175；25，ZDD17920；26，ZDD01909；27，ZDD18348；28，ZDD02450；29，ZDD03684；30，ZDD08487；31，ZDD08505；32，ZDD01855；33，ZDD02447；34，ZDD00745；35，ZDD11323；36，ZDD18087；37，ZDD02529；38，ZDD08459；39，ZDD20207；40，ZDD23090；41，ZDD18617；42，ZDD03056；43，ZDD06834；44，ZDD08257；45，ZDD01890；46，ZDD11092；47，ZDD08511；48，ZDD09224；49，ZDD18610；50，WDD00475；51，ZDD19861；52，ZDD22643；53，ZDD09417；54，ZDD22671；55，ZDD00738；56，ZDD09462；57，WDD00410；58，ZDD00712；59，ZDD08250；60，ZDD08502；61，ZDD18518；62，ZDD17873；63，ZDD20449；64，ZDD00072；65，ZDD09301；66，ZDD00159；67，ZDD06067；68，ZDD01889；69，WDD00472；70，ZDD09226；71，ZDD01521；72，ZDD07948；73，ZDD18790；74，ZDD02258；75，ZDD00707；76，ZDD07864；77，ZDD03209；78，ZDD03279；79，ZDD19699；80，ZDD10100；81，WDD00477；82，ZDD22763；83，ZDD23174；84，ZDD22712)

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。

以下實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例提供一種輔助鑒定大豆百粒重性狀的分子標(biāo)記HNUSOY05，所述分子標(biāo)記表現(xiàn)為SEQ ID NO.1所示核苷酸序列在大豆11號(hào)染色體的1001963至1002153區(qū)間內(nèi)插入/缺失長度多態(tài)性；具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的表現(xiàn)為高百粒重；缺失SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的表現(xiàn)為低百粒重。

插入或缺失突變的核苷酸片段位于大豆11號(hào)染色體的1001963至1002153區(qū)間，片段長度為191bp，具體核苷酸序列(SEQ ID NO.1)為：

ATATGGTCTATTCTGTTGAGGGCGAGCCCTGGTGCAGCGGTAAAGTTGTGCCTTGGTGACTTGTTGGTCATGGGTTCGAATCCGGAAACAGCGTCTTTGCATATGCAAGGGTAAGGCTGCGTACAACATCCCTCCCCCATACCTTCGCATAGCGAAGAGCCTCCGGGCAATGGGGTACGAAGTAAAAGTAA

根據(jù)大豆基因組序列，利用軟件Primer3，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增分子標(biāo)記HNUSOY05的引物對(duì)，得到分子標(biāo)記HNUSOY05的PCR檢測引物對(duì)，該引物對(duì)包括如下兩條核苷酸序列：

HNUSOY05F(SEQ ID NO.2)：5’-GGGTTTGGTTTGAGGTTTCTCG-3’；

HNUSOY05R(SEQ ID NO.3)：5’-ATCAATAACCTGAGCATGGCAC-3’。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種大豆的分子標(biāo)記的檢測方法，包括以下步驟：提取待檢測大豆樣品中的基因組DNA，以待測大豆基因組DNA為模板，將上述引物對(duì)上述DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：其中，25μL PCR反應(yīng)體系含2.5mmol L^-1MgCl₂、1U rTaq酶、800μmol L^-1dNTP、0.2μmol L^-1引物F和R、模板基因組DNA 50ng；采用降落PCR(touchdown PCR，TD-PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)?4℃預(yù)變性7min；94℃變性20s，60℃退火20s，每個(gè)循環(huán)降0.5℃，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；94℃變性20s，45℃退火20s，72℃延伸30s，10個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min。PCR產(chǎn)物采用1.5％瓊脂糖電泳。

利用實(shí)施例1中的引物對(duì)在不同大豆品種中進(jìn)行擴(kuò)增，然后電泳，如圖1所示，圖中M為Marker DL2000；1，綏農(nóng)14；2，科豐-1號(hào)；3，南農(nóng)1138-2；4，固新野生大豆；5，Acher；6，Evans；7，Peking；8，PI209332；9，合豐25。

電泳結(jié)果參照附圖1，產(chǎn)物大小如泳道7所示，通過送交上海生物工程有限公司進(jìn)行DNA測序分析，鑒定PCR產(chǎn)物長度為637bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具體為：

GGGTTTGGTTTGAGGTTTCTCGACCTGAAAGAGAAACTATCCTGTAAAAATTATTAGCACTCTTAAACATTGGCCTTGTCTAATCCTGTTGTTTTGAGTTCCCATTTCTATGGATTATTTCAGATAAGCTTCTCAACAAACACTTGTAGTTGTAGGAGAAGGAAATAAGGAGGGAGAACAAATCAGACTTTTCTCATAAGTTGAAATCAACTTATTCAGAAACTCTCATCTATTTTCCAAAAGTTGAAGTGAATAACTTGATTATAACTTATTGGAGAAGTTTGATTTTACCTCCCTATTTCTTCTTTTACAAATGTTTGTTGAGAAGTTTATCCTAACTGAGCCTATGTTTGTGGGGAATACCACTATTTTTGCACACCGAGTTTTAATATTTTATATGGTCTATTCTGTTGAGGGCGAGCCCTGGTGCAGCGGTAAAGTTGTGCCTTGGTGACTTGTTGGTCATGGGTTCGAATCCGGAAACAGCGTCTTTGCATATGCAAGGGTAAGGCTGCGTACAACATCCCTCCCCCATACCTTCGCATAGCGAAGAGCCTCCGGGCAATGGGGTACGAAGTAAAAGTAAATATGGTCTATTCTGTTGTGTAGATCAATGTGCCATGCTCAGGTTATTGAT。

產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測如泳道3所示，通過送交上海生物工程有限公司進(jìn)行DNA測序分析，鑒定PCR產(chǎn)物長度為446bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具體為：

GGGTTTGGTTTGAGGTTTCTCGACCTGAAAGAGAAACTATCCTGTAAAAATTATTAGCACTCTTAAACATTGGCCTTGTCTAATCCTGTTGTTTTGAGTTCCCATTTCTATGGATTATTTCAGATAAGCTTCTCAACAAACACTTGTAGTTGTAGGAGAAGGAAATAAGGAGGGAGAACAAATCAGACTTTTCTCATAAGTTGAAATCAACTTATTCAGAAACTCTCATCTATTTTCCAAAAGTTGAAGTGAATAACTTGATTATAACTTATTGGAGAAGTTTGATTTTACCTCCCTATTTCTTCTTTTACAAATGTTTGTTGAGAAGTTTATCCTAACTGAGCCTATGTTTGTGGGGAATACCACTATTTTTGCACACCGAGTTTTAATATTTTATATGGTCTATTCTGTTGTGTAGATCAATGTGCCATGCTCAGGTTATTGAT。

實(shí)施例3

根據(jù)大豆百粒重性狀數(shù)據(jù)，將供試大豆品種分成兩組：高百粒重組(百粒重≥20.0克，32個(gè))和低百粒重組(百粒重≤12.0克，52個(gè))。在供試大豆品種中，檢測到長度為637bp的單一片段的大豆品種的平均百粒重為23.38克(平均百粒重是具有長度為637bp的單一片段的所有大豆品種百粒重性狀的算術(shù)平均數(shù))；檢測到446bp的DNA片段的大豆品種的平均百粒重為8.87克(平均百粒重是具有長度為446bp的單一片段的所有大豆品種百粒重性狀的算術(shù)平均數(shù))；在本發(fā)明所研究的大豆品種中，具有長度為637bp的單一片段的百粒重性狀平均值比具有長度為446bp的單一片段的百粒重性狀平均值高14.55克。在32個(gè)具有高百粒重性狀的大豆品種中，均檢測出長度為637bp的單一片段；而在52個(gè)具有低百粒重性狀的大豆品種中，全部檢測出長度為446bp的單一片段；因此，本發(fā)明的分子標(biāo)記及其檢測方法可以用于大豆百粒重性狀的鑒定，輔助選育具有高百粒重性狀的大豆品種。

通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，利用本發(fā)明提供的分子標(biāo)記及其引物來鑒定大豆百粒重性狀的準(zhǔn)確率高達(dá)100％。

表1高百粒重組與低百粒重組大豆材料的百粒重性狀和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

以上檢測大豆品種可以憑借登錄號(hào)信息通過國家作物種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(http://www.cgris.net/)免費(fèi)獲得，百粒重性狀數(shù)據(jù)也可以通過國家作物種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫檢索獲得；PCR產(chǎn)物大小可以根據(jù)瓊脂糖電泳檢測結(jié)果進(jìn)行判斷，如附圖2所示，圖中M為Marker DL15000；1，ZDD03458；2，ZDD03515；3，ZDD08254；4，ZDD10058；5，ZDD01818；6，ZDD10039；7，ZDD10024；8，ZDD01892；9，ZDD18591；10，ZDD01291；11，ZDD07482；12，ZDD23177；13，ZDD01417；14，ZDD23601；15，ZDD01884；16，ZDD18365；17，ZDD00638；18，ZDD18525；19，ZDD19070；20，ZDD01124；21，ZDD17731；22，ZDD18887；23，ZDD17700；24，ZDD23175；25，ZDD17920；26，ZDD01909；27，ZDD18348；28，ZDD02450；29，ZDD03684；30，ZDD08487；31，ZDD08505；32，ZDD01855；33，ZDD02447；34，ZDD00745；35，ZDD11323；36，ZDD18087；37，ZDD02529；38，ZDD08459；39，ZDD20207；40，ZDD23090；41，ZDD18617；42，ZDD03056；43，ZDD06834；44，ZDD08257；45，ZDD01890；46，ZDD11092；47，ZDD08511；48，ZDD09224；49，ZDD18610；50，WDD00475；51，ZDD19861；52，ZDD22643；53，ZDD09417；54，ZDD22671；55，ZDD00738；56，ZDD09462；57，WDD00410；58，ZDD00712；59，ZDD08250；60，ZDD08502；61，ZDD18518；62，ZDD17873；63，ZDD20449；64，ZDD00072；65，ZDD09301；66，ZDD00159；67，ZDD06067；68，ZDD01889；69，WDD00472；70，ZDD09226；71，ZDD01521；72，ZDD07948；73，ZDD18790；74，ZDD02258；75，ZDD00707；76，ZDD07864；77，ZDD03209；78，ZDD03279；79，ZDD19699；80，ZDD10100；81，WDD00477；82，ZDD22763；83，ZDD23174；84，ZDD22712。

表1中產(chǎn)物大小是通過前期DNA測序結(jié)果進(jìn)行輔助判定。

上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明內(nèi)容并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110> 哈爾濱師范大學(xué)

<120> 一種輔助鑒定大豆百粒重性狀的分子標(biāo)記HNUSOY05及其應(yīng)用

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 191

<212> DNA

<213> 插入或缺失突變的核苷酸片段

<400> 1

atatggtcta ttctgttgag ggcgagccct ggtgcagcgg taaagttgtg ccttggtgac 60

ttgttggtca tgggttcgaa tccggaaaca gcgtctttgc atatgcaagg gtaaggctgc 120

gtacaacatc cctcccccat accttcgcat agcgaagagc ctccgggcaa tggggtacga 180

agtaaaagta a 191

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> HNUSOY05F

<400> 2

gggtttggtt tgaggtttct cg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> HNUSOY05R

<400> 3

atcaataacc tgagcatggc ac 22

<210> 4

<211> 637

<212> DNA

<213> 高百粒重的大豆中PCR產(chǎn)物

<400> 4

gggtttggtt tgaggtttct cgacctgaaa gagaaactat cctgtaaaaa ttattagcac 60

tcttaaacat tggccttgtc taatcctgtt gttttgagtt cccatttcta tggattattt 120

cagataagct tctcaacaaa cacttgtagt tgtaggagaa ggaaataagg agggagaaca 180

aatcagactt ttctcataag ttgaaatcaa cttattcaga aactctcatc tattttccaa 240

aagttgaagt gaataacttg attataactt attggagaag tttgatttta cctccctatt 300

tcttctttta caaatgtttg ttgagaagtt tatcctaact gagcctatgt ttgtggggaa 360

taccactatt tttgcacacc gagttttaat attttatatg gtctattctg ttgagggcga 420

gccctggtgc agcggtaaag ttgtgccttg gtgacttgtt ggtcatgggt tcgaatccgg 480

aaacagcgtc tttgcatatg caagggtaag gctgcgtaca acatccctcc cccatacctt 540

cgcatagcga agagcctccg ggcaatgggg tacgaagtaa aagtaaatat ggtctattct 600

gttgtgtaga tcaatgtgcc atgctcaggt tattgat 637

<210> 5

<211> 446

<212> DNA

<213> 低百粒重的大豆中核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)物

<400> 5

gggtttggtt tgaggtttct cgacctgaaa gagaaactat cctgtaaaaa ttattagcac 60

tcttaaacat tggccttgtc taatcctgtt gttttgagtt cccatttcta tggattattt 120

cagataagct tctcaacaaa cacttgtagt tgtaggagaa ggaaataagg agggagaaca 180

aatcagactt ttctcataag ttgaaatcaa cttattcaga aactctcatc tattttccaa 240

aagttgaagt gaataacttg attataactt attggagaag tttgatttta cctccctatt 300

tcttctttta caaatgtttg ttgagaagtt tatcctaact gagcctatgt ttgtggggaa 360

taccactatt tttgcacacc gagttttaat attttatatg gtctattctg ttgtgtagat 420

caatgtgcca tgctcaggtt attgat 446