本發明屬于有害藻類檢測技術領域，具體涉及一種有害藻類中肋骨條藻Skeletonema costatum的檢測方法。

背景技術：

中肋骨條藻(Skeletonema costatum)是在我國普遍出現的近岸性硅藻，是我國常見的赤潮種，由中肋骨條藻引起的赤潮在我國曾發生過多次，在我國東海近海中肋骨條藻一般從初春到夏末均能形成生長高峰和爆發赤潮。檢測中肋骨條藻的傳統分子手段消耗大量的人力物力，難以快速的進行中肋骨條藻的鑒定?，F階段，用于檢測中肋骨條藻的方法主要通過顯微鏡觀察其形態學特征。但由于中肋骨條藻個體微小，很難進行樣品處理及觀察，這需要實驗人員具備豐富的經驗。因此，需要找到一種更快，更方便，更適合中肋骨條藻的檢測方法。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種快速檢測有害藻類中肋骨條藻的檢測方法，以實現對中肋骨條藻進行安全、特異、快速、靈敏、簡單的現場快速檢測，從而彌補現有傳統檢測技術的不足。

本發明首先提供一種檢測中肋骨條藻的環介導等溫擴增引物組，包含有以下的引物：

F3引物SC-F3:5′-TGGGGGAAACGTTTAGTGG-3′(SEQ ID NO:1)、

B3引物SC-B3:5′-CCCGAAGGTTCCTACCACT-3′(SEQ ID NO:2)、

FIP引物SC-FIP:

5′-CGAGCACAGAGTGACTGACCTCTTCGGAGTGAGTGCCCAC-3′(SEQ ID NO:3)、

BIP引物SC-BIP:

5′-TACCCCGTCTTGAAACACGGACACGCATATCAGTTTGCCACT-3′(SEQ ID NO:4)、

LF引物SC-LF:5′-GCCCGATCCAGGATATGAAGA-3′(SEQ ID NO:5)

LB引物SC-LB:5′-GGAGTCTAACATATGTGCAAGTACG-3′(SEQ ID NO:6)；

作為優選，FIP引物SC-FIP的序列如下:

5′-CGAGCACAGAGTGACTGACCTCTTCGGAGTGAGTGCCCAC-3′(SEQ ID NO:7)、

BIP引物SC-BIP的序列如下:

5′-TACCCCGTCTTGAAACACGGACACGCATATCAGTTTGCCACT-3′(SEQ ID NO:8)。

作為實施例的優選，SC-FIP的5′端進行生物素標記，LF引物SC-LF的5′端進行異硫氰酸熒光素FITC標記；

本發明還提供一種檢測有害藻中肋骨條藻的方法，包括如下的步驟

1)配制LAMP反應體系：

各引物的終濃度為：內引物SC-FIP和SC-BIP各1.6μmol/L，外引物SC-F3和SC-B3各0.2μmol/L，環引物SC-LF和SC-LB各0.8μmol/L；緩沖液組成及濃度為：Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L、KCl 10mmol/L，MgSO₄8mmol/L，(NH₄)₂SO₄ 10mmol/L，0.1％的Tween20，Betaine 0.8mol/L，dNTPs1.4mmol/L；8U Bst DNA聚合酶和2μL樣品DNA模板，加雙蒸水使反應體系總體積為25μL；

2)LAMP反應體系擴增：將上述反應體系進行核酸擴增反應，擴增反應所需溫度為61℃-65℃，擴增反應所需時間為30min-60min；

3)LFD檢測：取8μL核酸擴增產物將產物加入到100μL Buffer中混勻，然后將LFD試紙條垂直浸入混合溶液中顯色檢測，通過試紙條判斷擴增結果。

其中步驟2中所述的最適反應溫度為63℃，最適反應時間為45min。

本發明所提供的中肋骨條藻的LAMP-LFD檢測方法具有如下優點：

一、高靈敏度，對中肋骨條藻的檢測最低線可至64pg/μL，其檢測靈敏度比傳統PCR的檢測靈敏度高10倍。

二、強特異性，所用的特異性引物根據中肋骨條藻的ITS基因中的六個不同區域設計，其中LF同時做為DNA特異性探針，該檢測特異性比常規PCR強很多。

三、檢測時間較短，50分鐘左右可獲得檢測結果，比常規PCR檢測時間節省2-4h。

四、儀器設備要求低，不需要PCR儀、電泳儀和凝膠成像系統，只需一個恒溫加熱器即可完成檢測。

五、操作簡便、結果呈現明顯，整個檢測過程不涉及復雜昂貴儀器和設備，稍具有分子生物學基礎的人員即可完成整個操作；檢測結果清晰明顯，直接通過肉眼觀察即可判別。

六、對實驗人員和環境更安全，檢測過程不需要進行凝膠電泳故不使用EB等有毒試劑。

綜上所述，本發明具有比現有傳統技術PCR檢測中肋骨條藻的方法更高的特異性、靈敏度、實用性及便捷性，可以在實際野外現場應用，有利于檢測和控制中肋骨條藻的爆發，提前做好預防。運用本發明的方法對有害藻類中肋骨條藻的檢測，能有效的預防有害藻類中肋骨條藻發生大規模赤潮，這對保護我國海洋及水產養殖具有重要意義。

附圖說明

圖1：中肋骨條藻ITS基因的LAMP-LFD引物和探針設計示意圖，引物和探針由方框圈出、

圖2：PCR-AGE檢測中肋骨條藻的靈敏度圖、

圖3：LAMP檢測中肋骨條藻的靈敏度圖、

圖4：LAMP-LFD檢測中肋骨條藻靈敏度圖、

在圖2和圖4中，泳道M為DL2000DNA marker,NC為陰性對照，1泳道為10⁰(模板濃度64ng/μL),2-8泳道依次為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍稀釋的基因組DNA。

圖5：PCR-AGE檢測中肋骨條藻的特異性圖、

圖6：LAMP檢測中肋骨條藻的特異性圖、

圖7：LAMP-LFD檢測中肋骨條藻的特異性圖；

在圖5和圖6中，泳道M為DL2000DNA marker,NC為陰性對照，1-8泳道依次為：塔瑪亞歷山大藻、微小原甲藻、東海原甲藻、海洋原甲藻、中肋骨條藻、米氏凱倫藻、赤潮異彎藻、劇毒卡羅藻。

具體實施方式

LAMP-LFD技術是環介導橫溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification)與橫向流動試紙條(Lateral flow dipstick)相結合的一種新穎的檢測技術，該技術將核酸橫溫擴增和可視化試紙條檢測有機的結合。環介導等溫擴增技術(LAMP)，只需要在恒溫(60℃–65℃)條件下保溫幾十分鐘，即可將所需目的基因擴增到10⁹水平。橫向流動試紙條(LFD)，融合了免疫層析技術和分子生物學手段，能在紙條上形成有顏色的檢測線從而可以特異性地檢測出該目標產物。環介導橫溫擴增技術(LAMP)與橫向流動試紙條(LFD)相互結合的技術，使LAMP擴增產物現場檢測可視化，檢測結果明顯直觀，通過肉眼即可辨認，LAMP-LFD結合方法安全、快捷、高效、高靈敏度且無設備及技術限制，具有其他技術所無法替代的優勢。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案包括以下三個部分：1、提供3對用于中肋骨條藻的LAMP引物序列，即長度分別為20bp、18bp、32bp、42bp、22bp和21bp的寡核苷酸序列，依次命名為SC-F3、SC-B3、SC-FIP、SC-BIP、SC-LF和SC-LB；2、配制LAMP反應體系，通過LAMP反應程序對樣品模板進行擴增，確定最佳的反應體系和反應條件；3、將SC-LF設計為DNA探針，結合LFD技術對LAMP擴增結果進行分析。

本發明所使用的8種藻：中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)、東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、赤潮異灣藻(Heterosigma akashiwo)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)以上微藻藻種均由寧波大學海洋生物實驗室藻種室提供,培養海水(鹽度25‰)經0.45μm醋酸纖維濾膜過濾后煮沸冷卻,培養液采用浙江水產學院三號液配方(NMB 3#)。藻種在2500mL錐形瓶中于日光燈光照下培養,光照強度45～55μmo l/(m 2·s),光暗周期12∶12,培養溫度為(20±2)℃。

以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。

實施例1:LAMP-LFD技術檢測有害中肋骨條藻的方法建立

Takara MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.50購置寶生物工程(大連)有限公司脫氧核糖核酸擴增試劑盒，榮研生物科技(中國)有限公司，LFD檢測試紙條購自Milenia Biotec GmbH公司(Milenia GenLine HybriDetect MGHD1，Germany)。

1、LAMP引物的設計

申請人對NCBI中公開的中肋骨條藻的IST基因進行同源性分析后，并比較了與中肋骨條藻近似種的IST基因的序列，從而設計和篩選出下面3對引物，引物序列如下所示：

SC-F3:5′-AAGCATGCCTTCTTCAGTGT-3′

SC-B3:5′-CTGGAGCAGGCTACGAGT-3′

SC-FIP:

5′-TGACACACAAACACGCACCCATTGATTTTCATGCCCCTGACG-3′

SC-BIP:5′-TGGCCTTTGACGCATTCAGTGTACACAACGAAAGAGACACCG-3′

SC-LB:5′-TAGCGTCTCCAACGAGCAACT-3′

SC-LF:5′-GACAGCACCAAGAGAAGACTTG-3′

其中SC-FIP為5′端生物素標記引物，SC-LF為5′端異硫氰酸熒光素FITC標記探針；中肋骨條藻的ITS基因LAMP擴增引物序列位置如圖1所示。按照上述引物序列，在大連寶生物公司進行LAMP引物合成。

2、LAMP擴增條件優化

以中肋骨條藻的基因組DNA作為模板進行擴增條件優化。LAMP法DNA擴增反應試劑盒購自博奧生物科技有限公司。首先配制具有最佳擴增效率和檢測特異性的反應體系，本發明中的LAMP反應體系為：各引物濃度為：FIP-bio和BIP各1.6μmol/L，F3和B3各0.2μmol/L，LF-fitc和LB各0.8μmol/L；緩沖液組成及濃度為：Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L、KCl 10mmol/L，MgSO4 8mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，Tween20 0.1％，Betaine 0.8mol/L，dNTPs 1.4mmol/L；8U Bst DNA聚合酶；基因組DNA模板2μl。按照上述體系要求配制反應混合物，混勻后分裝到無菌PCR管中，反應總體積為25μl。LAMP-LFD反應體系見表1。

表1：LAMP-LFD反應體系

在反應過程中，擴增溫度過高或過低都不利于LAMP反應。應用本發明提供的引物和采用本發明確定的反應體系，分別比較不同溫度(61℃、63℃、65℃)條件下對LAMP反應的影響，通過實時濁度儀對擴增反應進行實時監控最終確定最佳反應時間和反應所需溫度。通過實驗結果分析最終選擇63℃，45min作為后續LAMP擴增的最佳反應條件。

3、LFD檢測

LAMP擴增結束后，取8μL擴增產物加入到100μL Buffer溶液中混勻，將LFD試紙條垂直浸入混合液中，觀察試紙條檢測帶是否顯色。如果檢測帶顯色表示該樣品中中肋骨條藻的檢測結果為陽性，如果不顯色則表示該樣品中肋骨條藻的檢測結果為陰性。

實施例2

用本發明的LAMP-LFD技術對有害藻類中肋骨條藻靈敏度進行測定

1、參照DNA提取試劑盒說明書提取的中肋骨條藻基因組DNA，將所提取的中肋骨條藻的基因組DNA模板原始濃度(74ng/μL)按10倍梯度稀釋，分別做為反應模板。

2、用LAMP、LAMP-LFD和PCR法對中肋骨條藻進行檢測比較靈敏度。

2.1將上述梯度稀釋的基因組DNA用作PCR反應模板，利用上述特異引物F3和B3進行擴增，反應體系為：20μmol/L F3和20μmol/L B3各1μL，Premix Taq酶(TaKaRa)25μL，中肋骨條藻模板3μL，雙蒸水定容至50μL體系。優化后的PCR反應條件：預變性95℃5min；95℃40s，51℃40s，72℃90s，30個循環；72℃延伸10min。擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(圖2)。

2.2將上述梯度稀釋的基因組DNA用作LAMP的模板進行核酸擴增試驗，結果見圖3。

2.3按照本發明提供的LAMP的6條引物結合LFD技術將上述梯度稀釋后的基因組DNA作為LAMP反應的模板進行擴增，用本發明提供的LFD方法分析LAMP反應，結果見圖4。

中肋骨條藻基因組DNA模板10倍梯度稀釋實驗證明，LAMP-LFD和LAMP檢測的最低稀釋濃度為10^-4，模板濃度為7.4pg/μL。PCR擴增最低濃度為74pg/μL。LAMP-LFD檢測的靈敏度比和常規PCR方法高1個數量級，上述結果表明本發明的引物組能夠保證檢測時的靈敏性。

實施例3

用本發明的LAMP-LFD技術對有害藻類中肋骨條藻特異性進行測定

選取中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)、東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、赤潮異灣藻(Heterosigma akashiwo)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)8種常見海洋有害藻類作為LAMP-LFD特異性試驗藻，其中雙蒸水為陰性對照。提取藻類的基因組DNA，擴增產物分別用LFD試紙條和1％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果。檢測結果見圖5-7，說明本發明提供的中肋骨條藻的LAMP-LFD檢測方法能保證對有害藻類中肋骨條藻的特異性檢測，不與其他相關藻類發生交叉反應。

實施例4

為進一步提高LAMP擴增的靈敏度，依據先前設計的引物，針對SC-FIP和SC-BIP我們對其引物中的堿基進行了改造，改造后的引物序列如下：

SC-FIP-1:

5′-TGACACACAAACACGCACCCATTGATTATCATGCCTCTGACG-3′

SC-BIP-1:5′-TGGCCTATGACGCATTCAGAGTACACTACGAATGAGACACCG-3′

利用改造后的引物進行LAMP擴增的特異性和靈敏度檢測。擴增反應體系除將實施例1中兩條引物SC-FIP和SC-BIP分別更換為SC-FIP-1和SC-BIP-1外其他均不變，擴增和LFD檢測過程也保持一致。與為進行引物改造前的LAMP-LFD相比，引物改造后的LAMP-LFD在特異性檢測實驗中與改造前的結果一致。但在靈敏度檢測方面，與未改造的引物相比較，靈敏度又上升了1個數量級，比常規的PCR方法靈敏度提高了2個數量級。上述結果表明經改造后的本發明的引物組能夠在保證特異性檢測不變的情況下，進一步提高檢測時的靈敏性。

實施例5

LAMP-LFD對各海域中有害藻類的檢測應用

用實施例1中的試劑盒法提取各樣品的DNA模板。并用已經設計好的LAMP-LFD方法檢測海水樣品中是否存在有害赤潮藻中肋骨條藻；同時用實施案例2中的PCR法進行檢測。每個樣品分別作3個平行，檢測結果如表2所示。

表2：LAMP-LFD與PCR法對各海域中有害藻類中肋骨條藻的檢測結果

注：+.陽性；—.陰性

上述結果表明本發明的引物組及檢測方法所獲得的結果與PCR的結果一致，證明了本發明的可靠性。

SEQUENCE LISTING

<110> 寧波大學

<120> 一種中肋骨條藻的檢測方法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

tgggggaaac gtttagtgg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

cccgaaggtt cctaccact 19

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

cgagcacaga gtgactgacc tcttcggagt gagtgcccac 40

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

taccccgtct tgaaacacgg acacgcatat cagtttgcca ct 42

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 5

<400> 5

gcccgatcca ggatatgaag a 21

<210> 6

<211> 25

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<213> 6

<400> 6

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<210> 7

<211> 40

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<213> 7

<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 8

<400> 8

taccccgtct tgaaacacgg acacgcatat cagtttgcca ct 42