1.一種永生化的牛精原干細胞系,其特征在于,是以牛精原干細胞作為宿主細胞,通過用pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表達載體表達的慢病毒轉導,轉導后的牛精原干細胞表達SV40大T抗原,成為具有多向分化潛能的轉化體。
2.如權利要求1所述的永生化的牛精原干細胞系,其特征在于,其細胞為成纖維樣,呈多角形和短梭狀,有兩個或兩個以上的核仁,細胞間存在接觸抑制。
3.如權利要求1所述的永生化的牛精原干細胞系,其特征在于,牛精原干細胞系在傳代培養35代以后SV40大T抗原還能夠被表達。
4.一種永生化的牛精原干細胞系的構建方法,其特征在于,包括以下步驟:
1)將預處理的睪丸組織剪碎,加入10倍體積的CDD溶液中消化處理;然后等體積中和液中和,室溫離心后棄上清,用DMEM+10%FBS+2mmol/L谷氨酰胺+100μmol/Lβ-巰基乙醇的溶液重新懸浮細胞后接種于培養皿上,37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養,再采用免疫磁珠抗體CD90分選獲取純化的牛精原干細胞;
所述的CDD溶液包含2mg/mL膠原酶、20μg/mL DNase和2mg/mL Dispase;
所述的中和液為DMEM/F12+10%胎牛血清;
2)將pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表達載體與pVSVG和pPAX2的復合物作為轉染液,將其轉染于接種于培養板上的293T細胞;
48h后收取病毒液,過濾除去細胞碎片;將牛精原干細胞按照1×105細/35mm皿接種于培養皿上,12h后將病毒液含有10μg/mL polybrene的溶液加入皿中,24h后換上新鮮的培養液連續培養、傳代3個月以上,得到永生化的牛精原干細胞系。
5.如權利要求4所述的永生化的牛精原干細胞系的構建方法,其特征在于,所述的睪丸組織的處理為:
將3月齡以上的睪丸組織經高濃度雙抗清洗(300U/ml青霉素,300mg/mL鏈霉素)后轉移到細胞培養室,經75%醫用酒精浸泡1-2min;剪開白膜及睪丸組織,取出部分組織浸泡于PBS中,反復清洗3-4次后用剪刀剪碎。
6.如權利要求4所述的永生化的牛精原干細胞系的構建方法,其特征在于,所述精原干細胞的純化是原代差速貼壁法分離收集未貼壁的精原細胞,將收集的未貼壁精原細胞按如下步驟進行細胞分選:
1)未貼壁精原細胞1200rpm室溫離心5min,棄去培養液;
2)離心所得細胞用PBS重懸后計數,按1×107/管分裝,1200rpm室溫離心5min,棄去PBS;
3)離心沉淀所得細胞用20μL的CD90磁珠抗體加80μL的MACS Buffe重懸,4度孵育15min;
4)孵育細胞1200rpm室溫離心5min,收集上層一抗稀釋液;
5)細胞沉淀再用500μL MACS Buffer重懸成細胞懸液,用500μL MACS Buffer潤洗MACS分選柱,待潤洗的MACS Buffer將要流完時,及時緩慢滴加細胞懸液;
6)收集流過分選柱的細胞懸液,獲得CD90陰性精原細胞;
待細胞懸液完全流過MACS分選柱后,再用500μL MACS Buffer緩慢潤洗分選柱,然后取下分選柱,再向分選柱中滴加500μL MACS Buffer,收集用助推活塞推出的MACS Buffer,其中含有CD90陽性精原細胞,收集分選的牛精原干細胞接種到鋪了Laminin上含有低血清的培養基中培養,其培養基組成成分為:DMEM/F12+10%KSR+0.1mmol/Lβ-巰基乙醇,2mmol/L谷氨酰胺,1%非必需氨基酸,1%FBS,100U/mL青霉素,100mg/mL鏈霉素.20ng/mL GDNF,20ng/mL bFGF,10ng/mL LIF。
7.如權利要求4所述的永生化的牛精原干細胞系的構建方法,其特征在于,所述的pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表達載體和慢病毒包裝組成成分質粒pVSVG、pAX共同轉染293T細胞包裝獲得假慢病毒感染顆粒,包括以下操作:
1)多聚賴氨酸溶液包被處理細胞培養皿,吸除多聚賴氨酸晾干培養皿后接種107個293T細胞;
2)待次日細胞生長至70-90%鋪滿培養皿時,換取新鮮溫熱培養液;
3)按照轉染試劑轉染體系,取質粒pLOX-Ttag-iresTKT 14μg;pVSVG 7μg;pAX 7μg,依次將轉染組分別加入一個無菌潔凈的玻璃離心管,混勻室溫靜置15min后逐滴加到293T細胞培養液中,輕輕搖勻;再換取新鮮培養液后48h收取包含病毒顆粒的細胞上清液,0.45μm濾器過濾去除細胞碎片等雜質;
牛精原干細胞按照1×105細胞/35mm皿,上將牛精原干細胞按照1×105細胞/35mm皿上,12h后將含有10μg/ml polybrene的病毒液溶液加入含有低血清培養皿中,24h后換上新鮮的培養液連續培養、傳代3個月以上,直到細胞永生化,永生化后使用含血清的完全培養基;
所述的低血清培養基組成成分為:DMEM/F12+10%KSR+0.1mMβ-巰基乙醇,2mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸,1%FBS,100U/ml青霉素,100mg/ml鏈霉素.20ng/ml GDNF,20ng/ml bFGF,10ng/ml LIF。永生化的細胞使用的含有血清的完全培養基為DMEM/F12加入10%FBS、1mmol/L丙酮酸鈉、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素,100mg/ml鏈霉素。
8.如權利要求4所述的永生化的牛精原干細胞系的構建方法,其特征在于,通過pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表達載體轉導致牛精原干細胞得到連續傳代3個月以上且能夠表達SV40大T抗原。