本發明涉及農業生物技術領域，具體地，涉及一種檢測棉花植株對黃萎病抗性的方法、一種引物對、一種檢測棉花植株對黃萎病抗性的試劑盒和一種分子標記。

背景技術：

棉花黃萎病是世界性的重大植物病害，常年給棉花生產造成10-15％的產量損失，嚴重年份超過全國植棉面積的60％，給棉花生產造成沉重打擊。其病原菌隨種子、殘枝敗葉和土壤傳播，菌核在土壤中可存活多年，化學藥物、耕作栽培等手段對其無效，被植物病理界稱為棉花的“癌癥”，成為長期以來懸而未決的世界性難題。培育抗病品種被公認為是解決棉花黃萎病最經濟有效的手段，究其一直未能成功的原因是棉花黃萎病的抗性受多個主效基因共同控制的多基因控制遺傳模式，遺傳機制較為復雜(祁偉彥,張永軍,張天真,陳捷胤,戴小楓.基于人工病圃篩選和分子標記輔助的棉花抗黃萎病育種方法研究與應用.分子植物育種,2012,10(5):607-612；蔣鋒,趙君,周雷,郭旺珍,張天真.陸地棉抗黃萎病基因的分子標記定位.中國科學,2009,39(9):849-861；葛海燕,汪業春,郭旺珍,張天真.陸地棉抗黃萎病性狀的遺傳及分子標記研究.棉花學報,2008,20(1):19-22；Jiang F,Zhao J,Zhou L,Guo WZ,Zhang TZ.Molecular mapping of Verticillium wilt resistance QTL on chromosomes D7and D9 in upland cotton.Science China SerC-Life Science,2009,52(9):872-884；楊昶,郭旺珍,張天真.陸地棉抗黃萎病、纖維品質和產量等農藝性狀的QTL定位.分子植物育種,2007,5(6):797-805)，缺乏有效的可用于穩定篩選和準確跟蹤其抗性基因的分子標記，鑒定十分困難，導致棉花抗黃萎病育種進展緩慢。

早在20世紀40年代我國就開始棉花育種，50年代后開展雜交育種，當時棉田病害輕，基本上根據產量表現選育品種。70年代后棉花枯萎病的發生逐漸加重，開始了抗枯萎病育種，但育種技術基本上采用自然感病試驗田進行抗病性鑒定，由于病原菌不足，田間發病不均勻，年份間差異大，育種親本和雜交后代材料鑒定結果不準確，材料當選或淘汰盲目性較大。90年代后黃萎病發生漸趨嚴重，迫切需要培育抗黃萎病品種，但抗病性鑒定與選育仍然采用與抗枯萎病類似的方法，育種效率低，后代材料選擇不準確，育成品種抗病性差，且抗病品種產量較低。

棉花抗黃萎病分子標記輔助育種技術已經在纖維品種改良、不育系改良等得到應用，但是分子標記在不同的棉花品種之間的分布存在一定的不規律性，因此需要更多的分子標記來進行互相驗證，以便從多個維度對棉花植株的抗黃萎病的能力進行考察，從而有利于提高棉花育種的效率。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種檢測棉花植株對黃萎病菌抗性的方法，從而提高棉花育種的效率。

為了實現上述目的，一方面，本發明提供了一種檢測棉花植株對黃萎病菌抗性的方法，該方法包括：(1)將待測棉花植株的種子用浸種液浸泡；所述浸種液是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，用水浸泡，過濾得到的菌懸液；(2)將浸泡后的種子種植于病圃中；所述病圃是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎摻入土壤之后構建的；(3)選擇能夠在病圃中存活的棉花植株作為初篩棉花植株；(4)分別使用第一引物對和第二引物對初篩棉花植株的基因組DNA進行PCR擴增，得到第一擴增產物和第二擴增產物；所述第一引物對包括如SEQ ID NO:1所示的第一上游引物和如SEQ ID NO:2所示的第一下游引物，所述第二引物對包括如SEQ ID NO:3所示的第二上游引物和如SEQ ID NO:4所示的第二下游引物；如果所述第一擴增產物中具有SEQ ID NO:5所示的核酸且所述第二擴增產物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為抗黃萎病植株。

再一方面，本發明提供了一種引物對，其中，該引物對包括第一引物對和第二引物對，所述第一引物對包括如SEQ ID NO:1所示的第一上游引物和如SEQ ID NO:2所示的第一下游引物，所述第二引物對包括如SEQ ID NO:3所示的第二上游引物和如SEQ ID NO:4所示的第二下游引物。

再一方面，本發明還提供了一種檢測棉花植株對黃萎病菌抗性的試劑盒，其中，該試劑盒含有PCR試劑和如上所述的引物對。

再一方面，本發明還提供了一種分子標記，其中，該分子標記包括抗病分子標記核酸和感病分子標記核酸，所述抗病分子標記核酸包括如SEQ ID NO:5所示的左側抗病位點核酸和SEQ ID NO:6所示的右側抗病位點核酸；所述感病分子標記核酸包括如SEQ ID NO:7所示的左側抗病位點核酸和SEQ ID NO:8所示的右側抗病位點核酸。

通過上述技術方案，本發明能夠實現對棉花植株對黃萎病菌抗性進行方便、快速地檢測，由此提高了棉花育種的效率。

本發明的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

附圖說明

附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中：

圖1是12種棉種材料的第一擴增產物電泳圖。

圖2是12種棉種材料的第二擴增產物電泳圖。

具體實施方式

以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。

一方面，本發明提供了一種檢測棉花植株對黃萎病菌抗性的方法，該方法包括：(1)將待測棉花植株的種子用浸種液浸泡；所述浸種液是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，用水浸泡，過濾得到的菌懸液；(2)將浸泡后的種子種植于病圃中；所述病圃是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎摻入土壤之后構建的；(3)選擇能夠在病圃中存活的棉花植株作為初篩棉花植株；(4)分別使用第一引物對和第二引物對初篩棉花植株的基因組DNA進行PCR擴增，得到第一擴增產物和第二擴增產物；所述第一引物對包括如SEQ ID NO:1所示的第一上游引物和如SEQ ID NO:2所示的第一下游引物，所述第二引物對包括如SEQ ID NO:3所示的第二上游引物和如SEQ ID NO:4所示的第二下游引物；如果所述第一擴增產物中具有SEQ ID NO:5所示的核酸且所述第二擴增產物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為抗黃萎病植株。

其中，進一步地，如果所述第一擴增產物中具有SEQ ID NO:7所示的核酸且所述第二擴增產物中具有SEQ ID NO:8所示的核酸，則指示待測棉花植株為黃萎病易感植株。

其中，所述PCR擴增的條件可以包括：變性溫度為93.5-94.5℃；退火溫度為54.5-55.5℃。

其中，所述PCR擴增的條件還可以包括：PCR循環數為28-32輪。

其中，制備浸種液時，相對于每重量份的死于黃萎病的棉花植株的組織，水的用量可以為4-6重量份。

其中，用浸種液浸泡種子時，相對于每重量份的種子，浸種液的用量可以為1-3重量份。

其中，用浸種液浸泡種子的時間可以為5-8小時。

其中，構建病圃時，相對于每平方米的土壤，死于黃萎病的棉花植株的組織的摻入量可以為1-5kg。

其中，待測棉花植株的基因組DNA可以通過常規的DNA提取方法從待測棉花植株中提取得到。

再一方面，本發明提供了一種引物對，其中，該引物對包括第一引物對和第二引物對，所述第一引物對包括如SEQ ID NO:1所示的第一上游引物和如SEQ ID NO:2所示的第一下游引物，所述第二引物對包括如SEQ ID NO:3所示的第二上游引物和如SEQ ID NO:4所示的第二下游引物。

其中，上述引物對中的各種引物可以通過常規的DNA引物合成方法合成得到，上述引物對中的各種引物可以分開獨立存放。

再一方面，本發明還提供了一種檢測棉花植株對黃萎病菌抗性的試劑盒，其中，該試劑盒含有PCR試劑和如上所述的引物對。

其中，所述PCR試劑可以包括耐高溫DNA聚合酶、dNTP和PCR緩沖溶液。

再一方面，本發明還提供了一種分子標記，其中，該分子標記包括抗病分子標記核酸和感病分子標記核酸，所述抗病分子標記核酸包括如SEQ ID NO:5所示的左側抗病位點核酸和SEQ ID NO:6所示的右側抗病位點核酸；所述感病分子標記核酸包括如SEQ ID NO:7所示的左側抗病位點核酸和SEQ ID NO:8所示的右側抗病位點核酸。

本發明可通過檢測分子標記對棉花植株對黃萎病菌的抗性進行預測和篩選，淘汰病圃篩選過程中雖不發病但仍為感病的植株，減少人力物力的浪費，提高育種效率。

以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。

實施例1

收集12種棉種材料，按照文獻(張興華，棉花抗枯、黃萎病研究進展及其抗性鑒定方法，江西農業學報，2008,20(3):43-49)中的人工苗床病圃法，鑒定它們的抗病性，結果如表1中所列，其中，感病種質5份，在表1的感黃萎病材料一欄表示為“S”；抗病種質7份，在表1的抗黃萎病材料一欄表示為“R”。

按照《分子克隆實驗指南》中的方法，分離每份種質的基因組DNA。以每份種質的基因組DNA為模板，采用正向引物如SEQ ID NO:1所示(5'-ATATAAACGATAACACAACGGTA-3')且反向引物如SEQ ID NO:2所示(5'-ATGGCACACAAAGTGACATGA-3')的第一引物對進行PCR擴增，變性溫度為94℃；退火溫度為55℃：PCR循環數為30輪；分別得到每份材料的第一擴增產物。

以每份種質的基因組DNA為模板，采用正向引物如SEQ ID NO:3所示(5'-GCTATTTACTGCTGTTTTACTGC-3')且反向引物如SEQ ID NO:4所示(5'-ACATTTTTTTCAACAAACTTGTG-3')的第二引物對進行PCR擴增，變性溫度為94℃；退火溫度為55℃：PCR循環數為30輪；分別得到每份材料的第二擴增產物。

按照《分子克隆實驗指南》中的方法，將第一擴增產物和第二擴增產物在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測；圖1是12種棉種材料的第一擴增產物電泳圖；圖2是12種棉種材料的第二擴增產物電泳圖；將12種棉種材料的第一擴增產物和第二擴增產物進行測序，得到的測序結果如表1所示。

表1

表1的結果證明：如果第一擴增產物中具有SEQ ID NO:5所示的核酸且第二擴增產物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為抗黃萎病植株；如果第一擴增產物中具有SEQ ID NO:7所示的核酸或者第二擴增產物中具有SEQ ID NO:8所示的核酸，則指示待測棉花植株為感黃萎病植株。

實施例2

本實施例中，待測的棉花植株為軍棉1號棉花品種和海島棉7124棉花品種的F2代種子。軍棉1號棉花品種和海島棉7124棉花品種的F2代種子對黃萎病的抗性是事先不知道的。

將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，用等重量的水浸泡48小時，過濾得到含有黃萎病致病菌的浸種液。

軍棉1號棉花品種和海島棉7124棉花品種的F2代種子浸泡于上述含有黃萎病致病菌的浸種液中24小時，得到浸泡后的種子，其中，相對于每重量份的種子，浸種液的用量為5重量份。

將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，摻入土壤中，相對于每平方米的土壤，死于黃萎病的棉花植株的組織的摻入量為3kg，構建病圃。將浸泡后的種子種植于病圃中，共長出197株棉苗，但僅有36株存活并最終收獲種子，其余均死于黃萎病，得到36個抗黃萎病的棉花植株，分別記錄為初篩棉花植株1-36。

提取36個初篩棉花植株的DNA，采用正向引物如SEQ ID NO:1所示(5'-ATATAAACGATAACACAACGGTA-3')且反向引物如SEQ ID NO:2所示(5'-ATGGCACACAAAGTGACATGA-3')的第一引物對進行PCR擴增，分別得到每份材料的第一擴增產物，并且采用正向引物如SEQ ID NO:3所示(5'-GCTATTTACTGCTGTTTTACTGC-3')且反向引物如SEQ ID NO:4所示(5'-ACATTTTTTTCAACAAACTTGTG-3')的第二引物對進行PCR擴增，分別得到每份材料的第二擴增產物，將第一擴增產物和第二擴增產物進行DNA測序。DNA測序結果顯示，待測植株1-4、6、8-10、12-17、19-33和36第一擴增產物中具有SEQ ID NO:5所示的核酸且第二擴增產物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，而待測植株5、7、11、18、34和35的第一擴增產物中具有SEQ ID NO:7所示的核酸且第二擴增產物中具有SEQ ID NO:8所示的核酸。

根據上述結果，指示待測植株1-4、6、8-10、12-17、19-33和36為黃萎病抗病植株，而植株5、7、11、18、34和35為黃萎病感病植株。

對比例1

按照文獻(張興華，棉花抗枯、黃萎病研究進展及其抗性鑒定方法，江西農業學報，2008,20(3):43-49)中的人工苗床病圃法，對實施例2的初篩棉花植株1-36的種子種植后進行再次抗病性鑒定，植株1-4、6、8-10、12-17、19-33和36的黃萎病情指數均小于20，為抗黃萎病棉花植株，而植株5、7、11、18、34和35的黃萎病情指數均大于40，為黃萎病感病植株，與實施例2的指示結果相同。

通過實施例2和對比例1比較可見，本發明的方法能夠實現對棉花植株對黃萎病抗性的準確的檢測。

以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國農業科學院農產品加工研究所

<120> 分子標記和引物對以及檢測棉花植株對黃萎病菌抗性的方法和試劑盒

<130> 1014CAAS

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 1

atataaacga taacacaacg gta 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 2

atggcacaca aagtgacatg a 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 3

gctatttact gctgttttac tgc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 4

acattttttt caacaaactt gtg 23

<210> 5

<211> 251

<212> DNA

<213> Gossypium sp.

<400> 5

atataaacga taacacaacg gtaacatcta gaatatagaa tttatcaacg gttattagct 60

ttccatgtaa atgtttgaat agccttatgt taccatacat atatatatat atatatatat 120

ataatgatgc taaatttata ataataataa aatatctcac caaaacaact cataaacacc 180

attagtatta acaataataa agtttaacta atgaaaaaaa gttataataa tcatgtcact 240

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<210> 6

<211> 217

<212> DNA

<213> Gossypium sp.

<400> 6

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<210> 7

<211> 241

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<213> Gossypium sp.

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<210> 8

<211> 194

<212> DNA

<213> Gossypium sp.

<400> 8

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ctcttatttt attgttaatt ttgctactat tttagagtca tttgttttct aaattacaac 120

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