本發明屬于分子遺傳學領域，涉及以綿羊的功能基因的單核苷酸多態性(SNP)作為分子遺傳標記，特別涉及綿羊FTH-1基因的單核苷酸多態性及其檢測方法。
背景技術：
：在動物育種中，人們期望通過對生長、繁殖等性狀密切相關，并且與數量性狀緊密連鎖的DNA標記的選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進展。分子育種，即分子標記輔助選擇育種(MolecularMark-AssistSelection,MAS)，該技術是借助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種改良，它是利用現代分子生物學和傳統遺傳育種相結合的方法，進行新品種選育?；蚨鄳B性是指不同物種或者同一物種內的不同個體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數的變化。單核苷酸多態性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)是由美國麻省理工學院的人類基因組研究中心的學者Lander(1996)提出的一類遺傳標記系統，就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性。SNP作為新的遺傳標記已廣泛應用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態性的90％以上。SNP與罕見的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于1％的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于1％時才被稱為單核苷酸多態性。它的變異形式有：顛換、轉換、插入和缺失等，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起。具有轉換型的堿基變異的SNPs約占2/3。根據基因組中單核苷酸多態性產生的位置，可分為以下3類：基因編碼區單核苷酸多態性(Coding-regionSNPs,cSNPs)、基因周邊單核苷酸多態性(PerigenicSNPs,pSNPs)以及基因間單核苷酸多態性(IntergenicSNPs,iSNPs)。研究表明，位于編碼區內的cSNP比較少?；蚓幋a區內的cSNP又可分為2種：一種是編碼區內的同義cSNP(SynonymouscSNP)，即SNP所致編碼序列的改變并不會影響其所翻譯的蛋白質中氨基酸序列的改變；另一種是編碼區內的非同義cSNP(Non-SynonymouscSNP)，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而導致蛋白質中氨基酸序列的改變，可能最終影響到蛋白質的功能。由于SNPs是二等位基因分子標記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個、3個或4個等位基因構成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標記。目前，主要采用幾種不同的路線來發現SNPs：即DNA序列測定方法、聚合酶鏈反應—單鏈構象多態(PolymeraseChainReaction-SingleStrandConformationPolymorphism，PCR-SSCP)與DNA測序結合法、等位特異性PCR(AlleleSpecificPCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應等。在這些SNP檢測技術中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術人員和經驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用于生產實際的理想SNP檢測方法；當然，利用PCR-SSCP與DNA測序結合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應技術檢測SNP位點，需要平板讀數儀、基因芯片、微球陣列技術和質譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。限制性片段長度多態性-聚合酶鏈反應(RestrictionFragmentLengthPolymorphism-PolymeraseChainReaction，RFLP-PCR)方法是一種檢測SNP的有效技術，在發現SNP位點后設計上下游引物用限制性內切酶進行切割，然后進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。FTH1(FerritinHeavyPolypeptide1)即鐵蛋白重鏈多肽1，它是動植物體內廣泛存在的一種可溶性組織蛋白，負責體內鐵的存儲和維持細胞內鐵的平衡，也參與細胞增殖和免疫反應。FTH1是鐵蛋白活性的主要調節子，細胞內過量表達重鏈鐵蛋白會改變細胞的表型。FTH1還具有抗細胞凋亡的作用。先前的研究通過轉染干擾質粒干擾FTH-1的表達，實時定量檢測到16SrRNA的相對表達量降低，細胞中凋亡抑制因子表達量隨之降低，故細胞的凋亡速度就會相應的增快，布魯氏菌造成的抑制巨噬細胞凋亡的程度會相對減弱。此外，FTH-1會對動物的生長和繁殖產生影響。研究表明，FTH-1在高產蛋性能雞卵巢中的表達量明顯高于低產蛋性能雞；FTH-1在人類和牛的囊胚期上調表達；對產卵前和產卵的鵝下丘腦、垂體前葉和卵巢鐵蛋白重鏈mRNA的表達水平做定量分析，發現mRNA在排卵后卵泡和閉鎖卵泡的表達量比發育中的卵泡和卵巢基質表達量更高；通過構建抑制消減雜交cDNA文庫得出FTH-1在發情期綿羊卵巢組織中的表達量顯著高于乏情期；通過對多胎的濟寧青山羊和單胎的遼寧絨山羊下丘腦、垂體和卵巢的mRNA構建抑制消減雜交cDNA文庫，篩選出FTH-1基因與濟寧青山羊的多胎性有關。綜上，FTH-1在動物繁殖中起著十分重要的作用。關于動物FTH-1基因遺傳變異的研究國內外多見于人、鼠、豬等動物，而未有綿羊FTH-1基因遺傳變異或SNP研究的報道。由于目前中國綿羊FTH-1基因遺傳變異領域的研究匱乏，使該基因位點的功能研究及該基因遺傳變異與繁殖性狀關聯的研究成為空白。技術實現要素：本發明的目的在于提供在于一種利用PCR-RFLP檢測綿羊FTH-1基因單核苷酸多態性的方法及其應用，可針對其基因位點上的突變進行檢測，提前淘汰劣勢個體，加快高繁種羊群體的建立。本發明通過以下技術方案來實現：綿羊FTH-1基因第1046位為A或G的單核苷酸多態性的檢測方法為：以包含FTH-1基因的待測綿羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增綿羊FTH-1基因；用限制性內切酶XspI消化PCR擴增產物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據電泳結果鑒定綿羊FTH-1基因第1046位的單核苷酸多態性；所述的引物對P為：上游引物：5’-TCCATAGTAGAGACGGTTCC-3’20nt；下游引物：5’-GCACAAAAGACTAAAGCCC-3’19nt。所述的PCR擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，34個循環；72℃延伸10min。所述的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度為1.5-3.0％的瓊脂糖凝膠電泳。根據瓊脂糖凝膠電泳結果FTH-1基因第1046位堿基多態性為：AA型表現：152bp和326bp；AG型表現：478bp、326bp和152bp；GG型表現：478bp。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：本發明利用RFLP-PCR方法對綿羊FTH-1基因第1046位點上的單核苷酸多態性進行檢測，該位點位于FTH-1基因的第三內含子，該核苷酸多態性能夠作為一個分子遺傳標記，利用標記位點信息和數量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。本發明通過設計特定的PCR引物擴增片段，能夠用RFLP-PCR方法簡單、快速、成本低、精確的檢測上述FTH-1基因的單核苷酸的多態性。本發明對FTH-1基因的SNP進行了基因分型和基因頻率分析，以及與綿羊繁殖性狀之間進行了關聯分析；結果顯示FTH-1基因的核苷酸多態位點能夠成為分子遺傳輔助育種的標記。本發明提供的檢測方法為FTH-1基因的SNP與生長性狀關系的建立奠定了基礎，以便用于中國綿羊生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優良的綿羊種群。附圖說明圖1為綿羊血樣基因組DNA電泳檢測圖；圖2為綿羊FTH-1基因PCR擴增的478bp片段的電泳圖；M為Marker；圖3為綿羊FTH-1基因478bp片段PCR產物的XspI酶切電泳檢測FTH-1基因多態性的電泳結果圖；泳道2，9：AG基因型個體(478bp，326bp，152bp)；泳道3，5，7，8：GG基因型個體(478bp)；泳道4，6：AA基因型個體(326bp，152bp)；泳道1：MarkerDL2000(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；圖4為綿羊FTH-1基因1046位SNP的不同基因型測序峰圖，其中A對應AA基因型，B對應AG基因型，C對應GG基因型。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，所述實施例是對本發明的解釋，而不是限定。本發明以FTH1基因保守序列設計引物擴增FTH1基因第3內含子478bp片段，以綿羊基因組為模板，進行PCR擴增，擴增產物經測序后尋找該擴增片段的單核苷酸多態；針對發現的單核苷酸多態進行性狀關聯性分析，并提供其檢測方法，使得FTH1基因的核苷酸多態性成為一種能夠快速、方便檢測的分子遺傳標記，為加快建立具有高繁綿羊種群提供依據。a、綿羊FTH-1基因多態性的檢測1、綿羊血樣的采集及處理取綿羊血樣10mL，加入0.5mol/L的EDTA500μL抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80℃保存備用。本發明采用綿羊品種，具體如表1所示。表1綿羊樣品來源表2、血樣基因組DNA的提取(1)將冷凍血樣室溫解凍，轉移500μL至1.5mLEppendorf管，加入等體積PBS緩沖液，充分混勻，12000r/min離心10min(4℃)，棄去上清液，重復上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色。(2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500μL，搖動，使血細胞沉淀脫離離心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提緩沖液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超純水500mL，滅菌、調pH至8.0，4℃保存備用。(3)加蛋白酶K3μL(20mg/mL)并混勻，55℃過夜至澄清，尚未澄清者，可補加1μL蛋白酶K混勻繼續消化至澄清。(4)將反應液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500μL，溫和搖動離心管20min，使其充分混勻；4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉入另一1.5mL離心管中，重復一次。(5)加氯仿500μL，充分混勻20min，4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉入另一1.5mL離心管中。(6)加0.1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉動離心管直至白色的絮狀沉淀析出，-20℃保存30～60min。(7)4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。(8)4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發干凈。(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的超純水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，-20℃保存。3、DNA池的構建(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測選部分DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇DNA樣品條帶均一、無拖尾、無降解的樣品進行DNA池的構建。(2)OD值測定用紫外光光度計測定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，說明樣品中含有較多的蛋白質或酚，則應進行純化；若比值大于1.8，則應該考慮去除RNA純化。DNA濃度(ng/μL)＝50×OD260值×稀釋倍數(3)品種DNA池的構建DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μL，然后從綿羊20個濃度為50ng/μLDNA樣品中取10μL混合構建成品種DNA池；綿羊血樣基因組DNA的檢測結果見圖1，從圖中可以看出綿羊基因組DNA的質量非常高。4、PCR擴增PCR反應體系采用混合加樣法，即根據每一個反應體系所需的各種組分的數量和1次反應所需的PCR反應的個數，算出各種反應組分的總量，加入到1個1.5mL或者2.0mL離心管中，充分混勻后瞬時離心，再分裝到每個0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時離心后進行PCR擴增；PCR反應體系見表2。表2PCR反應體系體系成分體積(μL)2*ReactionMix12.5上游引物(10pmol/L)1.0下游引物(10pmol/L)1.0TaqDNA聚合酶(0.5U/μL)0.3DNA模板(50ng/μL)1.0滅菌超純水(H2O)9.2總體積25.0引物對P：上游引物：5’-TCCATAGTAGAGACGGTTCC-3’20nt；下游引物：5’-GCACAAAAGACTAAAGCCC-3’19nt。表3PCR反應程序94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，34個循環；72℃延伸10min5、PCR產物純化和測序PCR擴增完成之后進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖2所示，可以清楚看到478bp的條帶；然后進行PCR產物的切膠回收及純化：在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mL離心管中，然后用PCR產物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟如下：(1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。(3)向膠塊中加入等體積溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。(4)將上一步所得溶液加入一個吸附柱中，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min離心1min，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min離心1min，倒掉廢液，將離心吸附柱放入收集管中，12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50℃溫箱數分鐘，徹底晾干。(7)將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘。12000r/min離心1min收集DNA溶液。(8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復步驟7。把以綿羊DNA池為模板的PCR純化產物送上海生物工程有限公司進行雙向測序。綿羊FTH1基因目的片段478bp的測序結果如圖4所示。對測序峰圖進行分析，其中在同一位點有兩個不同峰的是發生了單核苷酸突變；位于綿羊FTH-1基因的第1046位出現了A、G兩種檢測結果，即為篩查到的綿羊FTH-1基因的SNP多態性，該位點是為A或G的堿基多態性。b、綿羊FTH-1基因A>G突變多態性的RFLP-PCR檢測由于篩查到的堿基多態性為自然酶切位點，能被常用的內切酶進行PCR-RFLP來鑒定。當綿羊的FTH1基因第1046位未發生A>G突變時，即為突變前A，利用引物對P擴增的FTH-1基因序列C^TAG，為XspI的限制性內切酶識別位點；可直接通過XspI對目的片段的酶切進行基因分型。1、RFLP-PCR反應條件PCR產物擴增體系和反應條件分別如表2和表3所述，PCR擴增產物的1.5％瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2所示，可以看到設計的引物對P能夠擴增478bp的片段。2、PCR擴增產物的XspI酶切(1)10μLXspI酶切反應體系：5μLPCR產物，10×buffer(緩沖液)2.0μL，XspI(10U/μL)為0.3μL，2.7μL滅菌純水(H2O)；(2)酶切消化條件：37℃恒溫培養箱中消化12～16h。(3)XspI消化PCR產物后瓊脂糖凝膠電泳分析用3.0％的瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳1小時，核酸染料染色檢測酶切結果，用UVP凝膠成像系統(GelDoc-ItTSImagingSystem)照相分析，并判型、記錄其基因型；由于PCR-RFLP擴增的478bp片段中不包含其它的XspI酶切識別位點，當FTH-1基因第1046位未發生A>G突變時，PCR擴增的FTH-1基因產物被限制性內切酶XspI識別后，在C^TAG對擴增片段酶切，將擴增片段切為2段；而當FTH-1基因第1046位發生突變，不能形成新的限制性內切酶XspI酶切識別位點，擴增片段不能被酶切；由于綿羊為2倍體動物，所以當發生A>G的突變時，可形成3種不同的基因型，分別為AA、AG、GG，其PCR-RFLP檢測的凝膠結果如圖3所示：其中，AA基因型為野生型，它的兩條DNA鏈的SNP位點均能被XspI酶切，表現為326bp和152bp條帶；發生突變后的GG的兩條鏈的SNP位點均不能被酶切，表現為478bp條帶；雜合子AG的兩條鏈中的一條的SNP位點能夠被識別而另一條不能被識別，表現為478bp，326bp和152bp條帶；根據條帶的個數和條帶的大小，能夠很清楚的判定是否發生了點突變，將三種基因型區分開，從而檢測其SNP多態性。(4)不同基因型個體PCR產物的測序驗證利用ABI3730測序儀對不同基因型個體PCR產物分別進行正反雙向測序；同時，進行SNP位置分析，結果表明包含478bp、326bp和252bp條帶的雜合子AG基因型個體其第1046位的測序圖的確表示為A或G，如圖4B所示，自左向右第8個峰為兩個峰；而AA基因型、GG基因型分別為A、G，分別如圖4A，圖4C所示。c、不同綿羊群體中FTH-1基因第1046位的SNP作為分子標記的應用1、群體單核苷酸多態性的檢測利用上述的SNP多態性檢測方法對424份小尾寒羊和432份湖羊DNA樣品進行SNP多態性的鑒定；統計其SNP位點的頻率分布情況。2、SNP位點的頻率統計分析基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數占總個體數的比率。PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位點的AA基因型頻率；NAA表示群體中具有AA基因型的個體數；N為檢測群體的總數量。基因頻率是指一個群體中某一基因數對其等位基因總數的相對比率。計算的公式可以寫成：PA＝(2NAA+NAa1+NAa2+……+NAan)/2N。式中，PA表示等位基因A頻率，NAA表示群體中具有AA基因型的個體數量，NAai表示群體中具有Aai基因型個體數量，a1-an為等位基因A的n個不同的復等位基因；統計結果見表4。表4綿羊FTH-1基因第1046位SNP基因頻率分布表3、基因效應的關聯分析基因型數據：XspI識別的基因型(AA、AG和GG)生長性狀數據：湖羊和小尾寒羊第一胎產羔數利用SAS(9.2)軟件分析基因位點與繁殖性狀(產羔數)的相關性。先對數據進行描述性統計分析，確定是否存在離群值，根據數據特征，利用t分析、方差分析或是多元線性模型分析基因型效應。在數據處理中，根據影響產羔數因素不同，考慮到環境效應、年齡、基因型效應及相關的互作效應，采用固定模型進行分析，同時，根據實際情況進行取舍。完整的模型如下：Yijk＝μ+Gj+Eijk其中：Yijk為個體表型記錄；μ為群體均值；Gj為各位點的基因型效應；Eijk為隨機誤差。結果表明(見表5和表6)：對于XspI可識別的第1046位的SNP位點，GG基因型為優勢基因型；性狀關聯分析表明，在湖羊群體中，GG基因型個體的產羔數顯著的高于AA基因型，而在小尾寒羊群體中各基因型個體差異不顯著。結果說明GG基因型可以成為一個提高湖羊產羔性狀育種速度的分子遺傳標記。根據這個研究結果，可以通過選擇，建立基因型為GG純合型湖羊群體，提高其產羔率。表5FTH1基因單核苷酸多態性與湖羊繁殖性狀之間的關聯分析表6FTH1基因單核苷酸多態性與小尾寒羊繁殖性狀之間的方差分析注：具有相同字母肩標的平均值間差異不顯著(P>0.05)，具有不同字母肩標的平均值間差異顯著(P<0.05)。核苷酸序列表<110>蘭州大學<120>利用PCR-RFLP檢測綿羊FTH-1基因單核苷酸多態性的方法及其應用<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1tccatagtagagacggttcc20<210>2<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>2gcacaaaagactaaagccc19當前第1頁1 2 3