本發明涉及一種皮膚干細胞經過體內發育分化為精子的方法，屬于生物醫學的干細胞與組織工程學技術領域。

背景技術：

近年來，男性不育患者約占我國育齡人口的10%，而40%以上的男性不育是由于精子發生異常造成的。雖然輔助生殖技術給許多患者帶來了曙光，但是單靠輔助生殖和藥物治療還遠遠不夠。利用干細胞向生殖細胞的定向分化可以在體外建立生殖細胞發生的模型并最終獲得功能性配子，這對研究生殖細胞發生的調控機制以及治療男性不育癥等方面具有重要意義。

干細胞(stem cells，SC)是一類具有自我復制能力和多向分化潛能的細胞。根據干細胞所處的發育階段分為胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES細胞)和成體干細胞(somatic stem cell)。成體干細胞是指存在于已分化組織中的未分化細胞，這些細胞多數處于休眠狀態且維持其多能性，一定條件下，它們能夠自我更新并且能夠分化形成特異組織的細胞類型，表現出其多向分化潛能。相對于其它成體干細胞，皮膚干細胞廣泛分布于人體最大的器官且取材更為方便，在臨床應用上沒有免疫排斥和倫理性問題，因此，皮膚來源的干細胞向生殖細胞分化備受關注。

然而，皮膚干細胞體外向精子誘導分化的報導很少，至今仍沒有相關報道。其他成體干細胞體外向精子分化的研究也大多數來至精原干細胞。1994年，Hofmann等在體外建立了精原干細胞系，而且這些細胞系在特定的條件下能夠進入減數分裂，但最終無法獲得單倍體細胞，表明這個細胞系在體外培養的條件下不能突破減數分裂期。2002年，Feng等在體外建立一種細胞系，而這些細胞在干細胞因子的誘導下能夠突破減數分裂并產生頂體樣結構。但是由于后續沒有被其他實驗室重復，所以至今仍未被廣泛利用。

技術實現要素：

為解決現有技術中存在的上述缺陷并發揚優點，本發明旨在提供一種首次采用皮膚干細胞作為原始細胞，對機體傷害小、無倫理問題限制的小鼠皮膚干細胞經過體內發育分化為精子的方法。

為了實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案：一種皮膚干細胞經過體內發育分化為精子的方法，包括將皮膚干細胞誘導分化為原始生殖細胞、將原始生殖細胞植入受體鼠睪丸獲得精子細胞兩個步驟，其中：

1）將皮膚干細胞誘導分化為原始生殖細胞具體為：

①皮膚干細胞準備：分別提取培養了1-2代綠色熒光轉移基因小鼠的皮膚干細胞與野生型小鼠成纖維細胞，并將野生型小鼠成纖維細胞采用絲裂霉素C處理，然后將皮膚干細胞與處理后的成纖維細胞按照質量比1:1的比例混合后待用；

②選用DMEM高糖培養基作為原始生殖細胞誘導培養基，并在該培養基內加入以DMEM高糖總質量計8%~12%質量分數的胎牛血清、以DMEM高糖總體積計40 mIU/ml~60 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml~120 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml~25 ng/ml骨形態發生因子、0.20 mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 8ng/ml~12 ng/ml表皮生長因子, 15ng/ml~25 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子, 30ng/ml~50ng/ml干細胞生長因子；培養溫度35℃-38℃，濕度不低于80%，環境中CO₂濃度4%-6%；

③將步驟①獲得的待用混合細胞植入步驟②準備的原始生殖細胞誘導培養基，然后將培養基放置在培養箱中，按常規方式進行培養8-10天，即獲得誘導分化出的原始生殖細胞；

2）將原始生殖細胞植入受體鼠睪丸獲得精子細胞具體為：

①準備受體鼠；

②將1）中步驟③獲得的原始生殖細胞稀釋至0.8×10⁶個/L ~1.2×10⁶個/L，然后利用常規睪丸注射技術將其注射進行受體睪丸曲細精管內，培育至通過常規方法檢測出現典型精子形態的細胞，則所述具有典型精子形態的細胞為所需精子細胞。

上述皮膚干細胞經過體內發育分化為精子的方法，其中：在步驟1）將皮膚干細胞誘導分化為原始生殖細胞和將原始生殖細胞植入受體鼠睪丸獲得精子細胞之間還增加有原始生殖細胞專向培養步驟，具體為：將1）中步驟③獲得的原始生殖細胞放入專向培養基內進行培養，所述專向培養基具體為：以DMEM高糖培養基作為基礎，其內添加以DMEM高糖總質量計8%~12%質量分數的胎牛血清、以DMEM高糖總體積計15ng/ml~25 ng/ml骨形態發生因子、0.20 mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 15ng/ml~25ng/ml表皮生長因子, 30ng/ml~50 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子, 30ng/ml~50ng/ml干細胞生長因子；培養時間3-5天，溫度35℃-38℃，濕度不低于80%；環境中CO₂濃度4%-6%。

上述皮膚干細胞經過體內發育分化為精子的方法，其中：原始生殖細胞在受體鼠睪丸內的培育周期為25天-40天。

與現有技術相比較，本發明具有以下優點：采用小鼠皮膚干細胞及成纖維細胞作為原細胞進行定向誘導分化，一方面對機體傷害小，另一方面，也無倫理問題限制，具有更廣闊的應用前景和重大的社會及經濟意義；采用的培養基成份配置更為合理、營養更齊全且更專向，用于適用的皮膚干細胞定向培養精子細胞的效率高、再現率高、純度高、質量好；清楚地劃分了初步誘導分化和最終體內培養，一方面使本發明的專向性更強，另一方面也為實際應用的步驟優化提供了更大的空間和應用價值，也大大降低了培養難度，提高了再現性；本發明方法建立了小鼠皮膚干細胞經過體內發育分化為精子的方法，以小鼠皮膚干細胞為材料，先在體外誘導分化為原始生殖細胞，并通過睪丸注射技術利用體內環境將原始生殖細胞分化有典型精子形態的精子，為皮膚干細胞向配子分化及研究應用提供了技術基礎。

附圖說明

圖1 為小鼠皮膚干細胞培養及傳代圖片。

圖2 為小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞圖片。

圖3為正常小鼠和白消安處理小鼠的睪丸圖片。

圖4為小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞注射到受體鼠睪丸圖片。

圖5為受體鼠睪丸組織切片HE染色圖片。

圖6為受體鼠睪丸切片免疫熒光組織化學染色圖片。

具體實施方式

下面通過具體實施例和附圖對本發明方法做進一步闡述。

實施例1

一種皮膚干細胞經過體內發育分化為精子的方法，包括將皮膚干細胞誘導分化為原始生殖細胞、將原始生殖細胞植入受體鼠睪丸獲得精子細胞兩個步驟，其中：

1）將皮膚干細胞誘導分化為原始生殖細胞具體為：

①皮膚干細胞準備：分別提取培養了1代綠色熒光轉移基因小鼠的皮膚干細胞與野生型小鼠成纖維細胞，并將野生型小鼠成纖維細胞采用絲裂霉素C處理，然后將皮膚干細胞與處理后的成纖維細胞按照質量比1:1的比例混合后待用；

②選用DMEM高糖培養基作為原始生殖細胞誘導培養基，并在該培養基內加入以培養基內DMEM高糖總質量計8%質量分數的胎牛血清、以培養基內DMEM高糖總體積計40 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml骨形態發生因子、0.20 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L β-巰基乙醇, 8ng/ml表皮生長因子, 15ng/ml堿性成纖維細胞生長因子, 30ng/ml干細胞生長因子；培養溫度35℃，濕度80%；環境中CO2濃度4%；

③將步驟①獲得的待用混合細胞植入步驟②準備的原始生殖細胞誘導培養基，然后將培養基放置在培養箱中，按常規方式進行培養8-10天，即獲得誘導分化出的原始生殖細胞；

2）將原始生殖細胞植入受體鼠睪丸獲得精子細胞具體為：

①準備受體鼠；

②將1）中步驟③獲得的原始生殖細胞稀釋至0.8×10⁶個/L，然后利用常規睪丸注射技術將其注射進行受體睪丸曲細精管內，40天后，通過常規方法檢測出現典型精子形態的細胞，則所述具有典型精子形態的細胞為所需精子細胞。

實施例2

一種皮膚干細胞經過體內發育分化為精子的方法，包括將皮膚干細胞誘導分化為原始生殖細胞、原始生殖細胞專向培養、將原始生殖細胞植入受體鼠睪丸獲得精子細胞三個步驟，其中：

1）將皮膚干細胞誘導分化為原始生殖細胞具體為：

①皮膚干細胞準備：分別提取培養了2代綠色熒光轉移基因小鼠的皮膚干細胞與野生型小鼠成纖維細胞，并將野生型小鼠成纖維細胞采用絲裂霉素C處理，然后將皮膚干細胞與處理后的成纖維細胞按照質量比1:1的比例混合后待用；

②選用DMEM高糖培養基作為原始生殖細胞誘導培養基，并在該培養基內加入以培養基內DMEM高糖總質量計12%質量分數的胎牛血清、以培養基內DMEM高糖總體積計60 mIU/ml促卵泡素、120IU/ml白血病抑制因子、25ng/ml骨形態發生因子、0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.12 mmol/L非必需氨基酸，2.5 mmol/L L-谷氨酰胺，0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 12ng/ml表皮生長因子, 25ng/ml堿性成纖維細胞生長因子, 50ng/ml干細胞生長因子；培養，溫度38℃，濕度85%；環境中CO2濃度6%；

③將步驟①獲得的待用混合細胞植入步驟②準備的原始生殖細胞誘導培養基，然后將培養基放置在培養箱中，按常規方式進行培養8-10天，即獲得誘導分化出的原始生殖細胞；

2）原始生殖細胞專向培養，具體為：

將1）中步驟③獲得的原始生殖細胞放入專向培養基內進行培養，所述專向培養基具體為：以DMEM高糖培養基作為基礎，其內添加以培養基內DMEM高糖總質量計8%質量分數的胎牛血清、以培養基內DMEM高糖總體積計15ng/ml骨形態發生因子、0.20 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L β-巰基乙醇, 15ng/ml表皮生長因子, 30ng/ml堿性成纖維細胞生長因子, 30ng/ml干細胞生長因子；培養時間3天，溫度35℃，濕度80%；環境中CO₂濃度4%；經過一定時間專向培養后可獲得更加純化、數量更多、形態更佳的原始生殖細胞。

3）將原始生殖細胞植入受體鼠睪丸獲得精子細胞具體為：

①準備受體鼠；

②將2）中獲得的原始生殖細胞稀釋至1.2×10⁶個/L，然后利用常規睪丸注射技術將其注射進行受體睪丸曲細精管內，25天后，通過常規方法檢測出現典型精子形態的細胞，則所述具有典型精子形態的細胞為所需精子細胞。

實施例3

大體與實施例2相同，其差別在于：

2）原始生殖細胞專向培養，具體為：

將1）中步驟③獲得的原始生殖細胞放入專向培養基內進行培養，所述專向培養基具體為：以DMEM高糖培養基作為基礎，其內添加以培養基內DMEM高糖總質量計12%質量分數的胎牛血清、以培養基內DMEM高糖總體積計25 ng/ml骨形態發生因子、0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.12 mmol/L非必需氨基酸，2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 25ng/ml表皮生長因子, 50 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子, 50ng/ml干細胞生長因子；培養時間5天，溫度38℃，濕度85%；環境中CO₂濃度6%；經過一定時間專向培養后可獲得更加純化、數量更多、形態更佳的原始生殖細胞。

實施例4

本實施例為了更詳細地闡述本發明的皮膚干細胞經過體內發育分化為精子的方法，結合圖片、具體操作流程、用到的器具、具體藥品的來源等，將方法的步驟更加詳細地描述如下：

1、小鼠皮膚干細胞的分離

取當天新生的綠色熒光轉基因CD1雄性小鼠，斷頸處死后用75%的酒精擦拭干凈，再用生理鹽水清洗一遍。用剪刀順著小鼠背部外側剪開皮膚，用鑷子將背部皮膚撕下放入DMEM/F12中，用彎鑷子去掉皮膚上的脂肪和血液。將皮膚置于2-3 mL含有1%青鏈霉素（PS）的磷酸鹽緩沖液（PBS）中清洗3次，然后每5-7只小鼠皮膚為一組轉移到6 cm培養皿中。用剪刀將小鼠皮膚剪成< 1 mm2的碎片，之后轉移到15 mL離心管中，加入PBS到10 mL，1200 rpm離心3 min，重復洗滌3次。棄上清，加1 mL的0.25%胰酶后，置于37℃、飽和濕度、5% CO₂培箱中消化20-30 min。取出離心管，每管加入1 mL 0.1% DNase I，室溫孵育1 min。加入9 mL PBS，重懸細胞，1200 rpm離心3 min。棄上清，加入10 mL PBS，重懸細胞，1200 rpm離心3 min。棄上清，加入10 mL DMEM/F12，重懸細胞，1200 rpm離心3 min，重復清洗3遍。棄上清，加入1 mL DMEM/F12，使用移液槍帶上槍頭敲打組織，直至組織懸液可以自由吸入槍頭。加入10 mL的DMEM/F12，重懸細胞，并使用40 um的一次性細胞篩過濾組織，將細胞收集到50 mL離心管中，1500 rpm離心5 min。棄上清，加10 mL干細胞培養基重懸細胞并轉移至10 cm懸浮培養皿中。此時細胞記為P0代。小鼠皮膚干細胞干細胞培養基包含DMEM/F12；2% B27；20ng/ml 表皮生長因子；40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子；1% 青鏈霉素；以培養當天為零代，每4天傳代一次。圖1中(1)是剛培養的皮膚干細胞懸液，培養的第二天會有類似細胞聚集物出現（圖1中（2）），第四天時皮膚干細胞克隆球邊緣清晰，結構緊湊（圖1中（3）。傳代后雜細胞數目減少，皮膚干細胞克隆球數目也越來越多（圖1中（4））。

2、小鼠原始生殖細胞（PGC）的誘導

收集1-2代的皮膚干細胞克隆球，用0.25% Trypsin消化，室溫消化過程中用槍吹打至單細胞，用10%胎牛血清終止消化，收集細胞，1500rpm離心5min；棄上清，加入少量原始生殖細胞誘導培養基懸浮細胞，將細胞稀釋到細胞濃度為5×10⁴個/ml 原始生殖細胞誘導培養基里；

取1-3代成纖維細胞，倒掉培養基，加入4ml含有10μg絲裂霉素C的成纖維細胞培養基，置于培養箱中1.5-2小時，取出用磷酸鹽緩沖液洗5遍，用0.25% Trypsin將貼壁的成纖維細胞消化下來，洗滌后加入原始生殖細胞誘導培養基稀釋至5×10⁴個/ml，將兩種細胞混合液1:1混合，加入到6cm原始生殖細胞誘導培養基中并置于37℃、飽和濕度、5%CO₂中培養，原始生殖細胞誘導培養基包括：DMEM高糖, 10% 胎牛血清, 50 mIU/ml促卵泡素，100 IU/ml 白血病抑制因子，20 ng/ml 骨形態發生因子（BMP-4）， 0.23 mmol/L 丙酮酸鈉, 0.1 mmol/L 非必需氨基酸, 2 mmol/L L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L β-巰基乙醇, 10 ng/ml 表皮生長因子, 20 ng/ml 堿性成纖維細胞生長因子, 40 ng/ml 干細胞生長因子。細胞懸液開始呈懸浮狀態（圖2中（1）），在第二天基本貼壁（圖2中（2）），在培養的8-10天，出現折光度大，“亮晶晶”的細胞（圖2中（3）），此時更換原始生殖細胞專向培養基，成分包括：DMEM高糖, 10% 胎牛血清, 0.23 mmol/L 丙酮酸鈉, 0.1 mmol/L 非必需氨基酸, 2 mmol/L L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L β-巰基乙醇, 20 ng/ml 表皮生長因子, 40 ng/ml 堿性成纖維細胞生長因子，20 ng/ml 骨形態發生因子（BMP-4），40 ng/ml 干細胞生長因子（SCF）（加入原始生殖細胞專向培養基后，培養基中原始生殖細胞數目隨著培養時間的增加，數目越來越多（圖2中（4））。

3、受體鼠睪丸注射

將原始生殖細胞收集并洗滌后加入0.1% 臺盼藍染色后，置于冰上。選取狀態好的受體鼠，受體鼠經過白消安處理，與正常小鼠（圖3中（1））對比，其生精上皮已被摧毀（圖3中（2）），腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉。劑量：240 mg/kg。待小鼠昏迷后，將其仰臥并用膠帶固定四肢于硬紙板上。用酒精濕潤小鼠腹側皮膚，剪去小鼠腹側毛。在受體鼠腹部由下至上縱向依次剪開皮膚、腹膜及腹肌，切口距離生殖器大約0.5cm左右，長度大約1 cm左右。用鑷子將睪丸拉出腹腔：于膀胱旁邊尋找與睪丸相連的脂肪墊，輕輕拖出腹腔，小鼠的睪丸和附睪順勢被拖出腹腔。在體視鏡下找到受體鼠輸出小管，并調整輸出小管角度角度，使小鼠輸出小管的方向大約與注射針方向平行。雙手操作，夾起輸出小管，將其中一段套入玻璃針頭部，并順勢平行將輸出管向玻璃針的方向移動。進針到位后，緩緩推動活塞，將原始生殖細胞液注入受體鼠曲細精管。將睪丸、附睪及其脂肪緩慢送入腹腔并歸置原處，依次縫合腹肌和皮膚?？p合后依次用75%酒精和碘酊消毒，并將小鼠置于溫暖處，待其蘇醒后放回層流架進行無菌培養。睪丸注射一個月后，受體鼠睪丸即可取出進行下一步分析。圖4是小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞注射到受體鼠睪丸曲細精管中。

4、受體鼠睪丸HE切片染色觀察組織結構

將受體鼠睪丸取出，4%多聚甲醛固定過夜，經洗滌--脫水—透明—石蠟包埋—組織切片，將切片經兩次二甲苯每步10min將切片上的石蠟脫凈，經無水酒精及各級酒精下行至水。蘇木精溶液染色約5分鐘。將片子放入自來水染缸中，換染缸至自來水不變色為止。放入0.5%鹽酸的70%酒精溶液（簡稱1.5%鹽酸酒精）分色。分色時，邊分色邊鏡檢，至細胞核染色清楚，一般情況下，在鹽酸酒精中蘸三次即可，每次不超過1s。分色后用自來水洗堿化，直至細胞核變成藍色。這一步驟也可稱為“藍化”。放入蒸餾水洗去堿性成分。若切片中殘留過多的堿性物質則對以后的伊紅染色不利。依次放入50%、70%及80%的酒精。放入1%伊紅酒精染液2分鐘。以95%酒精對伊紅分色，至胞漿、結締組織等呈桃紅色。一般1min即可。再放到95%酒精，無水酒精脫水。每步時間為20s。放入二甲苯透明（15min左右）。取出切片，將組織周圍多余的二甲苯擦去，滴樹膠后加蓋玻片封固。通過HE染色發現，受體鼠睪丸中仍有大部分曲細精管是精子發生缺失的，但有部分曲細精管已經恢復了精子發生（圖5）。

5、受體鼠睪丸免疫熒光組織化學檢測特定基因表達

將受體鼠睪丸取出，4%多聚甲醛固定過夜，經洗滌--脫水—透明—石蠟包埋—組織切片，然后將切好的石蠟切片即白片放入60 ℃烘箱烘2 h。經兩次二甲苯每次15 min將切片上的石蠟脫凈。脫蠟后經無水酒精及各級酒精下行至水，將復水的切片放入檸檬酸抗原修復液中，96 ℃，修復15 min。修復液冷卻至室溫后，將片子取出后，放在水平濕盒內，用鉛筆在組織切片的區域做好標記，之后將片子放入TBS 中洗5 min，再轉入TBST 中洗5 min。加上BDT (3% BSA和10%山羊血清溶于TBS) 封閉，大約的量為每張片子100 μL。之后加封口膜在切片區域。室溫放置30 min。將封口膜揭掉，將片子上多余的封閉液倒在吸水紙上。加適量一抗于切片位置，一般為20 μL。用封口膜封一抗，注意不能有氣泡，尤其在組織切片位置。將載玻片放入濕盒內，用封口袋封住，37 ℃孵育1 h。一抗孵育結束后，取出片子，將片子泡入TBST中。一共洗三次，每次10 min。將片子上的TBST倒在吸水紙上，加上熒光標記的二抗，一般加20 μL的量。用封口膜封住二抗后，放入濕盒內，用封口袋封住，37 ℃孵育15 min。孵育結束后，將片子取出，揭掉封口膜，TBST洗三次，分別為10 min，20 min，20 min。將片子上多余的TBST倒在吸水紙上，滴加適量的Hoechst 33342，一般為10 μL，在切片位置添加封口膜，常溫孵育3 min，染色時間要控制好，切片染色要明顯快于細胞染色。將封口膜揭掉，PBS洗3次，每次5 min。將多余的PBS倒在吸水紙上。加Vectashield封片，加的量視片子上組織的面積而定，一般情況下加5~10 μL即可。注意不要直接滴加在組織上，應滴在組織切片邊上，再用蓋玻片蓋住片子。做好的切片置于干盒中，套上封口袋防止切片凝水，4 ℃保存，鏡檢觀察。注意不能置于濕盒中。染色結果發現，受體睪丸中恢復精子發生的曲細精管內，生精上皮細胞同時表達GFP（圖6中（1-2））和MVH（圖6中（1-3）），說明恢復精子發生的細胞來自小鼠皮膚干細胞分化的原始生殖細胞。

對所公開的實施例的上述說明，僅為了使本領域專業技術人員能夠實現或使用本發明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現。因此，本發明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。