本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及一種培養牙髓干細胞的培養基及其制備方法。
背景技術：
由于各種原因導致的牙體缺損和牙齒缺失，已成為危害口腔乃至人體健康的主要疾病，其發病率逐年增加。目前，主要是借助于各種牙科材料充填來應對牙齒缺損疾病，雖然在一定程度上能阻止病變的繼續發展，但卻不能解決根本問題。對于牙齒缺失盡管解決途徑很多，但最有效和最根本的辦法還是牙齒生物性再生。
隨著組織再生醫學的快速發展，為牙體缺損和牙齒缺失的有效治療帶來了希望。目前已有許多研究利用牙源性上皮和牙源性間充質的相互作用再生出了牙齒組織。常用的牙源性間充質包括牙乳頭細胞和牙髓組織細胞。由于牙乳頭細胞在臨床上難以獲得，因此，目前用于牙體及牙齒再生的種子細胞首選是牙髓組織來源的細胞，其中最重要的是牙髓干細胞。
中國專利申請CN104711219A公開了一種牙髓干細胞培養基，基礎培養基為IMDM，1L培養基中含有SITE100*，抗壞血酸200-400mM，SITE為細胞生長必需的組份，抗壞血酸和纖連蛋白有助于牙髓干細胞形成細胞外基質，利于牙髓干細胞生長，含有PDGF1-10ug，氫化可的松1-10ug，EGF1-5ng，b-FGF1-5ng，PTH50-200ng，地塞米松1-20mM。
臨床使用牙髓干細胞的前提是對牙髓干細胞進行大量的擴增，現有的擴增方法最常規的是使用添加10％胎牛血清的培養基，臨床使用含動物源的培養基不僅會引起免疫排斥反應，異源病毒感染，而且采用這種培養基培養的牙髓干細胞，生長比較緩慢，在傳代超過5次之后其分化功能細胞的潛能會大大降低。雖然，已經研發出不含血清的培養牙髓干細胞的培養基，但是價格昂貴。
技術實現要素：
針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種培養牙髓干細胞的培養基及其制備方法。本發明提供的培養牙髓干細胞的培養基成分明確且價格較低，不含有胎牛血清及不含任何動物來源成份，安全性高，能夠顯著提高牙髓細胞的擴增速度，且不影響牙髓干細胞的多向分化能力。
本發明的技術方案是：
一種培養牙髓干細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：表皮生長因子3-5μg/L，羧甲基殼聚糖2-4g/L，過氧化氫酶5-8mg/L，硫辛酸0.14-0.18mg/L，輔酶Q10 0.3-0.6μM，層粘連蛋白15-25μg/L，亞麻酸2-5μM，煙酰胺8-14μM，牛磺酸2-4mg/L，血小板衍生生長因子2-6μg/L，氯化膽堿70-80μM，薯蕷皂苷元0.5-2mg/L。
一種培養牙髓干細胞的培養基，優選的方案是，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：表皮生長因子4μg/L，羧甲基殼聚糖3g/L，過氧化氫酶6mg/L，硫辛酸0.16mg/L，輔酶Q10 0.4μM，層粘連蛋白18μg/L，亞麻酸4μM，煙酰胺12μM，牛磺酸3mg/L，血小板衍生生長因子5μg/L，氯化膽堿76μM，薯蕷皂苷元1.4mg/L。
所述基礎培養基為DMEM或F12培養基。
另外，本發明還提供了培養牙髓干細胞的培養基的制備方法，步驟如下：
S1向基礎培養基中加入表皮生長因子、硫辛酸、層粘連蛋白、亞麻酸、煙酰胺、牛磺酸、血小板衍生生長因子和氯化膽堿，攪拌20-40分鐘，加入羧甲基殼聚糖和薯蕷皂苷元，繼續攪拌30-40分鐘，靜置1-3小時，加入過氧化氫酶和輔酶Q10，攪拌30分鐘，得混合物；
S2調節步驟S1所得混合物的pH至6.8-7.1，用0.2-0.25微米濾膜過濾除菌，即得。
優選地，所述步驟S1攪拌30分鐘。
優選地，所述步驟S1繼續攪拌35分鐘。
優選地，所述步驟S1靜置2小時。
優選地，所述步驟S1調節步驟S2所得混合物的pH至7.0。
優選地，所述步驟S2用0.23微米濾膜過濾除菌。
本發明培養牙髓干細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，添加的添加劑包括表皮生長因子、羧甲基殼聚糖、氯化膽堿和薯蕷皂苷元等。本發明培養牙髓干細胞的培養基中各成分協同作用，能夠顯著提高牙髓干細胞的擴增速度，且不影響牙髓干細胞的多向分化能力。
與現有技術相比，本發明提供的培養牙髓干細胞的培養基具有以下優勢：
(1)本發明提供的培養牙髓干細胞的培養基成分明確且價格較低。
(2)本發明提供的培養牙髓干細胞的培養基不含有胎牛血清及不含任何動物來源成份，安全性高。
(3)本發明提供的培養牙髓干細胞的培養基能夠顯著提高牙髓細胞的擴增速度，且不影響牙髓干細胞的多向分化能力。
具體實施方式
以下通過具體實施方式的描述對本發明作進一步說明，但這并非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。
本發明所用羧甲基殼聚糖可購自浙江澳興生物科技有限公司，DMEM培養基可購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，F12培養基可購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，薯蕷皂苷元可購自西安通澤生物科技有限公司。
實施例1、一種培養牙髓干細胞的培養基
所述培養牙髓干細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：表皮生長因子3μg/L，羧甲基殼聚糖2g/L，過氧化氫酶5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，輔酶Q10 0.3μM，層粘連蛋白15μg/L，亞麻酸2μM，煙酰胺8μM，牛磺酸2mg/L，血小板衍生生長因子2μg/L，氯化膽堿70μM，薯蕷皂苷元0.5mg/L。
所述基礎培養基為F12培養基。
制備方法：
S1向基礎培養基中加入表皮生長因子、硫辛酸、層粘連蛋白、亞麻酸、煙酰胺、牛磺酸、血小板衍生生長因子和氯化膽堿，攪拌20分鐘，加入羧甲基殼聚糖和薯蕷皂苷元，繼續攪拌30分鐘，靜置1小時，加入過氧化氫酶和輔酶Q10，攪拌30分鐘，得混合物；
S2調節步驟S1所得混合物的pH至6.8，用0.2微米濾膜過濾除菌，即得。
實施例2、一種培養牙髓干細胞的培養基
所述培養牙髓干細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：表皮生長因子5μg/L，羧甲基殼聚糖4g/L，過氧化氫酶8mg/L，硫辛酸0.18mg/L，輔酶Q10 0.6μM，層粘連蛋白25μg/L，亞麻酸5μM，煙酰胺14μM，牛磺酸4mg/L，血小板衍生生長因子6μg/L，氯化膽堿80μM，薯蕷皂苷元2mg/L。
所述基礎培養基為DMEM培養基。
制備方法：
S1向基礎培養基中加入表皮生長因子、硫辛酸、層粘連蛋白、亞麻酸、煙酰胺、牛磺酸、血小板衍生生長因子和氯化膽堿，攪拌40分鐘，加入羧甲基殼聚糖和薯蕷皂苷元，繼續攪拌40分鐘，靜置3小時，加入過氧化氫酶和輔酶Q10，攪拌30分鐘，得混合物；
S2調節步驟S1所得混合物的pH至7.1，用0.25微米濾膜過濾除菌，即得。
實施例3、一種培養牙髓干細胞的培養基
所述培養牙髓干細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：表皮生長因子4μg/L，羧甲基殼聚糖3g/L，過氧化氫酶6mg/L，硫辛酸0.16mg/L，輔酶Q10 0.4μM，層粘連蛋白18μg/L，亞麻酸4μM，煙酰胺12μM，牛磺酸3mg/L，血小板衍生生長因子5μg/L，氯化膽堿76μM，薯蕷皂苷元1.4mg/L。
所述基礎培養基為F12培養基。
制備方法：
S1向基礎培養基中加入表皮生長因子、硫辛酸、層粘連蛋白、亞麻酸、煙酰胺、牛磺酸、血小板衍生生長因子和氯化膽堿，攪拌30分鐘，加入羧甲基殼聚糖和薯蕷皂苷元，繼續攪拌35分鐘，靜置2小時，加入過氧化氫酶和輔酶Q10，攪拌30分鐘，得混合物；
S2調節步驟S1所得混合物的pH至7.0，用0.23微米濾膜過濾除菌，即得。
對比例1、一種培養牙髓干細胞的培養基
所述培養牙髓干細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：表皮生長因子4μg/L，水溶性殼聚糖3g/L，過氧化氫酶6mg/L，硫辛酸0.16mg/L，輔酶Q10 0.4μM，層粘連蛋白18μg/L，亞麻酸4μM，煙酰胺12μM，牛磺酸3mg/L，血小板衍生生長因子5μg/L，氯化膽堿76μM，薯蕷皂苷元1.4mg/L。
所述基礎培養基為F12培養基。
制備方法與實施例3類似。
與實施例3的區別在于，將羧甲基殼聚糖替換為水溶性殼聚糖。
對比例2、一種培養牙髓干細胞的培養基
所述培養牙髓干細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：表皮生長因子4μg/L，羧甲基殼聚糖3g/L，過氧化氫酶6mg/L，硫辛酸0.16mg/L，輔酶Q10 0.4μM，層粘連蛋白18μg/L，亞麻酸4μM，煙酰胺12μM，牛磺酸3mg/L，血小板衍生生長因子5μg/L，氯化膽堿76μM，葫蘆素B 1.4mg/L。
所述基礎培養基為F12培養基。
制備方法與實施例3類似。
與實施例3的區別在于，將薯蕷皂苷元替換為葫蘆素B。
試驗例一、本發明培養牙髓干細胞的培養基對牙髓干細胞培養效果
1、受試培養基：本發明實施例1-3所得培養牙髓干細胞的培養基，以及對比例1和對比例2所得培養牙髓干細胞的培養基。
2、培養干細胞來源：來源于牙髓的牙髓干細胞。
3、體外細胞培養實驗
用無菌鑷子夾取牙髓組織，切除根尖部1mm的牙髓組織；用眼科彎剪將牙髓組織剪成1mm3，置于50mL離心管中，加入13mL的組織消化液，封口后充分混合均勻，轉移至恒溫空氣搖床中，37℃、200rpm消化15min；加入等體積的培養基反復吹打離散細胞團塊，通過70μm的細胞篩網過濾，2000rpm離心3min；利用PBS清洗1～2次，沉淀用培養基重懸，以5×103個/mL接種培養皿中，混勻細胞懸液，放于37℃、濕度為95％的二氧化碳培養箱中培養。每隔24小時，用血球計數板測一次細胞數量。
4、實驗結果
用本發明實施例1-3所得培養牙髓干細胞的培養基，與對比例1和對比例2所得培養牙髓干細胞的培養基對牙髓干細胞進行培養，培養開始時以及培養1天、2天、3天、4天和5天的細胞數量如表1所示。
表1：不同培養基對牙髓干細胞培養后細胞數量
由表1可以看出，在相同的培養時間內，生長在本發明實施例1-3所得培養牙髓干細胞的培養基中牙髓干細胞的細胞數量，明顯大于生長在對比例1和對比例2所得培養牙髓干細胞的培養基中牙髓干細胞的細胞數量。這說明，本發明培養牙髓干細胞的培養基可以明顯促進牙髓干細胞的增殖，本發明培養牙髓干細胞的培養基的擴增效果好。
試驗例二、對增殖后的牙髓干細胞體外分化為成骨細胞，成軟骨細胞，成脂肪細胞的潛能分析影響實驗
1、受試培養基：本發明實施例1-3所得培養牙髓干細胞的培養基，以及對比例1和對比例2所得培養牙髓干細胞的培養基。
2、培養干細胞來源：來源于牙髓的牙髓干細胞。
3、體外細胞分化實驗
將細胞傳代擴增至P10代，使用LONZA的成脂，成骨，成軟骨檢測試劑盒對P10代牙髓干細胞進行分化檢測。
4、實驗結果
檢測結果表明，經本發明實施例1-3所得培養牙髓干細胞的培養基培養過的牙髓干細胞分化成脂肪細胞，成軟骨細胞，成骨細胞的比率在85％以上。而對比例1和對比例2所得培養牙髓干細胞的培養基培養過的牙髓干細胞分化成脂肪細胞，成軟骨細胞，成骨細胞的比率在65％。因此，本發明所得培養牙髓干細胞的培養基可以有效的保持牙髓干細胞的多向分化能力。