本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種克雷氏肺炎桿菌及其菌劑和制備方法與應用。

背景技術：

福美雙是植物真菌病病害防治中的常用農藥，化學名稱是四甲基硫代過氧化二碳酸二酰胺，又經常被稱為秋蘭姆，賽歐散等。英文名：tetramethylthiuram disulfide；Thiram。白色或灰白色、有特殊氣味、結晶粉末。密度略大于水。不溶于水，不溶于稀堿液、汽油，溶于乙醇、苯、氯仿、二硫化碳等。福美雙和代森錳鋅經常作為兩種有效成分來制作成復配型殺菌劑，屬低毒殺菌劑，對皮膚和粘膜有刺激作用。可以治療疫病等真菌類病害，廣泛用作植物殺菌劑，對多種作物的霜霉病、疫病、炭疽病、禾谷類黑穗病、苗期黃枯病有較好的防治，在煙草上福美雙是常用的真菌病害防治藥劑。由于長期大量地應用，煙葉中福美雙的檢出率越來越高。由于福美雙及其衍生物具有致癌性、致突變性和致畸性，以及急性毒性和亞致死作用，目前已引起人們的極大關注。生物降解是對福美雙污染煙葉進行降解的重要途徑之一。對于福美雙殘留，國內外進行了福美雙降解微生物的篩選工作。到目前為止，已分離出多個具有福美雙降解能力的菌株，如假單胞菌屬、分枝桿菌屬、芽孢桿菌屬等，但是未見肺炎桿菌用于福美雙降解中的報道。

技術實現要素：

本發明第一目的在于提供一種克雷氏肺炎桿菌，第二目的在于提供一種以所述克雷氏肺炎桿菌作為活性成分的菌劑，第三目的在于提供所述以克雷氏肺炎桿菌作為活性成分的菌劑制備方法，第四目的在于提供所述以克雷氏肺炎桿菌作為活性成分的菌劑的應用。

本發明的第一目的是這樣實現的，所述的克雷氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)FM84為福美雙降解菌，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2015年12月15日，保藏編號：CGMCC No. 11663；所述克雷氏肺炎桿菌屬于細菌界，變形菌門，γ-變形菌綱，腸桿菌目，腸桿菌科，克雷伯氏菌屬。

——克雷氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)FM84的獲得與鑒定

（1）克雷氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)FM84的獲得與鑒定

本發明所述的克雷氏肺炎桿菌，是從煙草葉片中分離得到。

菌株獲得：

LB液體培養基：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化鈉10.0g，蒸餾水補足至1000ml，混合后攪拌均勻，自然pH值，高壓蒸汽滅菌(121℃，30min)后制得。

LB固體培養基：在LB液體培養基配方中添加瓊脂15.0g。

煙葉樣品采自云南省玉溪市紅塔區，取1g煙葉樣品置于250ml錐形瓶中，加入100ml LB液體培養基和終濃度為100mg/L的福美雙，振蕩培養(28℃，150rpm)5天，取培養液進行梯度稀釋，取稀釋后的培養液200μl涂布于含100mg/L福美雙的LB固體平板上，置于恒溫培養箱(28℃)中培養，待平板上長出菌落后，挑取各菌落于含100mg/L福美雙的LB固體平板上反復純化，直至菌落單一，將純化后的各菌落分別接至終濃度為100mg/L福美雙的LB液體試管中振蕩培養(28℃，150rpm)過夜，將培養好的菌液離心后接至富集培養液中培養一周，通過高效液相色譜法(HPLC)檢測各富集培養液中福美雙殘留量，最后篩選獲得一株能降解高效氯氰菊酯的菌株，命名為FM84。

菌株鑒定：

將上述獲得的菌株進行生化特征和分子生物學鑒定。該菌株的主要生物學特征為：菌體無芽孢和鞭毛，革蘭氏陰性，在LB固體培養基上為乳白色，不透明，有莢膜，粘韌度不等，近圓形，邊緣整齊。生化測定結果見表1。菌株可在25～35℃，pH值7.0～9.0培養條件下較好生長。該菌株經16S rDNA序列分析鑒定為肺炎桿菌屬的克雷氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）。

表1 FM84菌株生化特征測定

表1中，“+”表示陽性反應，“-”表示陰性反應。

（2）克雷氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)FM84的保藏

通過上述鑒定結果，確認菌株FM84為克雷氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)的一個株系，命名為FM84，于2015年12月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100080），其保藏編號：CGMCC No. 11663。

本發明的第二目的是這樣實現的，是以所述克雷氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)FM84經菌種活化、種子培養、生產培養、制劑制備后制成的菌劑。

本發明的第三目的是這樣實現的，所述的克雷氏肺炎桿菌為活性成分的菌劑的制備方法，其特征在于包括菌種活化、種子培養、生產培養、制劑制備步驟，具體包括：

(1)菌種活化：將所述FM84菌株的保存種按平板培養法進行培養，培養至單菌落出現；

(2)種子培養：將所述單菌落接入至種子培養瓶中，用FM84菌株種子培養基培養至對數生長期；

(3)生產培養：將步驟(2)培養得到的培養液接入發酵罐中，用FM84菌株生產培養基培養至對數生長期，所述培養液的接入量為所述FM84菌株生產培養基總體積的4-8％；

(4)制劑制備：將步驟(3)培養得到的發酵液離心，沉淀用生理鹽水懸浮，分裝得到福美雙農藥殘留降解菌劑。

本發明的第四目的是這樣實現的，所述的菌劑在制備降解福美雙藥物中的應用。

本發明的克雷氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)FM84，生產成本低、福美雙農藥去除效果好、高效、無毒、環保，且該菌株可通過簡單、快捷、低成本的操作方法制備得到福美雙農藥殘留降解菌劑，使用本發明菌株制備得到的降解菌劑具有生產成本低、使用方便，去除效果好等優點，能夠有效用于農業生產中無農藥殘留農產品的生產。

除非另有說明外，本發明中所采用的百分數均為體積百分數。

附圖說明

圖1為本發明克雷氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)FM84在LB培養基的菌落特征示意圖；

圖2為本發明克雷氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)FM84對福美雙的降解曲線示意圖。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明教導所作的任何變換或改進，均落入本發明的保護范圍。

本發明所述的克雷氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)FM84為福美雙降解菌，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2015年12月15日，保藏編號：CGMCC No. 11663；所述克雷氏肺炎桿菌屬于細菌界，變形菌門，γ-變形菌綱，腸桿菌目，腸桿菌科，克雷伯氏菌屬。

所述的克雷氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)FM84的生物學特征為：菌體無芽孢和鞭毛，革蘭氏陰性，在LB固體培養基上為乳白色，不透明，有莢膜，粘韌度不等，近圓形，邊緣整齊。菌株可在25～35℃，pH值7.0～9.0培養條件下較好生長。

本發明所述的克雷氏肺炎桿菌為活性成分的菌劑，是以所述克雷氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)FM84經菌種活化、種子培養、生產培養、制劑制備后制成的菌劑。

本發明所述的克雷氏肺炎桿菌為活性成分的菌劑的制備方法，其特征在于包括菌種活化、種子培養、生產培養、制劑制備步驟，具體包括：

菌種活化：將所述FM84菌株的保存種按平板培養法進行培養，培養至單菌落出現；種子培養：將所述單菌落接入至種子培養瓶中，用FM84菌株種子培養基培養至對數生長期；生產培養：將步驟種子培養得到的培養液接入發酵罐中，用FM84菌株生產培養基培養至對數生長期，所述培養液的接入量為所述FM84菌株生產培養基總體積的4-8％；種子培養和生產培養基的優選配方含：(NH4)₂SO₄ 1-3g/L、K₂HPO₄ 4-7g/L、KH₂PO₄1-3g/L、MgSO₄?7H₂O 0.1g/L、葡萄糖5-10 g/L。培養條件為：培養溫度25～35℃，pH值7.0～9.0，攪拌頻率150～200rpm，空氣流量為0.1~1.0vvm。制劑制備：將步驟生產培養得到的發酵液離心（6000rpm，10min），沉淀用含有0.5％吐溫-20和0.9%的氯化鈉水溶液懸浮，分裝得到福美雙農藥殘留降解菌劑。

本發明所述的克雷氏肺炎桿菌為活性成分的菌劑的應用為所述的菌劑在制備毒降解福美雙藥物中的應用。

下面以具體實施例對本發明做進一步說明：

實施例1

菌株的篩選與鑒定

從大田生長的煙草上采集葉片樣品，作為菌源進行自然富集培養，將葡萄糖2g，胰蛋白胨4g，牛肉膏4g，MgSO₄0.8g加入到400mL的蒸餾水中，配制好的培養液在121℃的溫度條件下滅菌處理20min，在此培養基上培養三天，再配制無機鹽基礎培養基，加入福美雙，配制成溶液后，然后再加入蒸餾水定容至500mL，上述加入福美雙的量要使配制好的培養液中福美雙的最終濃度均為100mg/mL，然后將配制好的培養液在121℃的溫度條件下滅菌處理20min，即得所需的培養液。在此培養基上培養三天，稀釋涂布分離出一株菌命名為FM84，該菌于2015年12月15日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號CGMCC 11663。

FM84的16SrDNA基因的PCR擴增、測序由上海英駿生物技術有限公司完成。菌株FM84 16S rDNA序列（GenBank登記號：KU057959）與克雷伯菌屬細菌親緣關系最近，與Klebsiella pneumoniae CP010361.1菌株同源性達100.0%，結合形態、菌落特征及生理生化特性，鑒定菌株屬于克雷白氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）。

實施例2

菌劑的制備

將所述FM84菌株的保存種接種到LB固體平板培養法進行培養24h，至單菌落出現；將上述單菌落接入至含有(NH4)2SO4 1g/L、K2HPO4 4g/L、KH₂PO₄ 3g/L、MgSO₄?7H₂O 0.1g/L、葡萄糖5 g/L培養基的三角瓶中，培養至對數生長期得到種子液；將種子培養得到的培養液接入發酵罐中，接種比例為5%，28℃，200rpm，空氣流量為0.8vvm，培養48h得到生產培養液。將生產培養得到的發酵液離心（6000rpm，10min），沉淀用含有0.5％吐溫-20和0.9%的氯化鈉水溶液懸浮，分裝得到福美雙農藥殘留降解菌劑。

實施例3

福美雙降解實驗

被福美雙污染的大田煙葉，按每畝噴施1-10×10¹³cfu克雷白氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae ）FM84，煙株在田間自然生長7d后，即能實現對煙葉上福美雙殘留的生物降解。

圖2表示了FM84菌處理煙葉中福美雙隨時間的動力學降解曲線。接種福美雙降解菌FM84的處理在7天的時候福美雙降解了99.2%，而噴施清水作為對照的CK煙葉降解緩慢，7天的時候降解了67.2%。可見福美雙降解菌噴施后，加速了福美雙殘留的降解。

利用本發明的方法對煙葉上福美雙殘留的生物降解效果好，與福美雙自然降解相比，提高了對福美雙污染煙葉的降解效果，更有利于實際中對煙葉上福美雙農藥殘留的控制。