本發明屬于生物工程
技術領域：
，涉及微生物及其應用，具體涉及一種隸屬于鏈霉菌屬的放線菌菌株KN37，以及其在抑制多種農作物病原菌的應用。
背景技術：
：新疆優越的自然條件使其在農產品生產方面具有先天的優勢。種植業是新疆農業中的主要產業，占農業總產值的76％，是增加農業收入的主要來源。新疆種植作物主要包括糧食類、油料類、棉花類、蔬菜類、瓜果類和其他經濟作物。然而，植物病害嚴重威脅著農作物的正常生產，幾乎每種農作物都受到多種病原真菌的危害。據統計，全世界每年因植物病害造成的經濟損失高達20000億美元，其中僅蔬菜作物一項每年的經濟損失就可達到2000億美元。我國每年因植物病害造成的損失也是難以計數的，尤其是新疆地區。如新疆棉花每年因病害損失皮棉約36萬噸，市價約70億元。植物病害造成新疆地區加工番茄的損失同樣巨大，每年造成經濟損失達30億元之多。因此，植物病害的防治一直以來都是困擾農業生產的一大難題。近些年，化學農藥的大量使用導致農產品出口受限、抗藥性、環境污染等問題的產生。因此，開發新型高效、廣譜、低毒、環保的殺菌劑(微生物藥劑)一直是當今農藥研究的難點和熱點。技術實現要素：本發明提供一種放線菌菌株KN37，菌株KN37的發酵液可抑制多種農作物病原菌，可用于開發成新型高效、廣譜、低毒、環保的微生物殺菌劑。為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：一種放線菌菌株KN37，是發明人在新疆喀納斯地區采集的土壤中分離得到的一種放線菌。該菌株(生物材料)的保藏信息為：名稱：Streptomycessp.KN37，以下簡稱為KN37；保藏編號：CGMCCNo.13160；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；保藏時間：2016年10月27日。本發明通過16SrDNA序列方法對菌株KN37進行了分類鑒定。提取此菌的DNA，擴增16SrDNA的序列。從菌株KN37與鏈霉菌已有效發表種16SrDNA序列構建出的系統發育樹可以獲知，菌株KN37歸屬于鏈霉菌屬。進一步地，本發明給出了菌株KN37的種子培養基及其培養條件。其培養條件為：在28℃、120rpm條件下，在培養基中搖床培養36h；所述培養基組成為：蛋白胨10g/L、酵母膏2g/L、酸水解酪蛋白2g/L、氯化鈉6g/L、pH值7.4。同時，本發明還結合形態學特征對菌株KN37進行了分類鑒定。將菌株KN37接種在培養基上，呈現的形態學特征為：菌落絨毛狀，菌落的顏色為白色，在培養基中基內菌絲無橫隔、不斷裂，氣生菌絲生長旺盛，孢子柱形，表面光滑，不產生可溶性色素。結合菌株形態觀察、培養特性及16SrDNA的鑒定結果，本發明所述放線菌菌株KN37隸屬于鏈霉菌屬，因而本專利申請發明人將其命名為Streptomycessp.KN37。另一方面，本發明還給出了所述放線菌菌株KN37在生產廣譜抗菌活性物質的用途。所述廣譜抗菌活性物質來源于菌株KN37經液體發酵培養后的發酵液，所述發酵培養條件為：在28℃、180rpm條件下搖床培養7d；培養基組成為：1％豆粉浸汁1L、葡萄糖10g、蛋白胨3g、氯化鈉2g、碳酸鈣2g，pH自然。根據試驗數據，所述菌株KN37的發酵液可抑制多種農作物病原菌。優選地，所述菌株KN37的發酵液用于抑制葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、番茄葉霉病菌(Fulviafulva)的生物活性。鑒于放線菌菌株KN37發酵液的生物活性，所述菌株KN37的發酵液制備用于防治農作物病害的微生物藥劑，即本發明所述殺菌劑。與現有技術相比，本發明至少具有下述的有益效果或優點：(1)本發明提供一種新的放線菌菌株KN37。該菌株可作為研制高效、廣譜、低毒、環保的微生物殺菌劑的生物材料，菌株KN37的發酵液能夠直接用于殺菌物質抑制多種農作物病原菌。尤其是，菌株KN37的發酵液對葡萄灰霉病菌、番茄早疫病菌、棉花枯萎病菌、番茄葉霉病菌具有較好的抑制作用。(2)本發明優化了菌株KN37種子培養基及其培養條件。其培養條件為：在28℃、120rpm條件下，在培養基中搖床培養36h；所述培養基組成為：蛋白胨10g/L、酵母膏2g/L、酸水解酪蛋白2g/L、氯化鈉6g/L、pH值7.4。(3)本發明給出了菌株KN37具有殺菌活性的發酵液的制備條件。其發酵培養條件為：在28℃、180rpm條件下搖床培養7d；培養基組成為：1％豆粉浸汁1L、葡萄糖10g、蛋白胨3g、氯化鈉2g、碳酸鈣2g，pH自然。附圖說明圖1是本發明所述放線菌菌株KN37的菌落形態圖。圖2是本發明所述放線菌菌株KN37與相關種16SrDNA序列的系統發育樹。具體實施方式以下將結合實施例對本發明的技術方案做進一步詳細闡述。實施例1：菌株KN37的分離和鑒定(1)放線菌菌株KN37是從新疆喀納斯地區采集的土壤中分離得到一種放線菌。該菌株KN37的種子培養條件為：在28℃、120rpm條件下，在培養基中搖床培養36h；所述培養基組成為：蛋白胨10g/L、酵母膏2g/L、酸水解酪蛋白2g/L、氯化鈉6g/L、pH值7.4。(2)采用16SrDNA基因測序法對放線菌菌株KN37進行分類鑒定。16SrDNA序列測定委托上海生工生物工程股份有限公司進行。具體測序方法如下：用溶菌酶法從新鮮菌體中提取基因組DNA，采用通用引物(27F和1492R)進行16SrDNA擴增，PCR產物經檢測后測序。經測定，該菌株KN37的16SrDNA序列如下所示：ACCATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACACGCTCAGGCATCTGAGTGTGTTGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGAAGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGAAGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGA從菌株KN37與鏈霉菌已有效發表種16SrDNA序列構建出的系統發育樹(圖2)可以看出：菌株KN37與參比菌株的16SrDNA序列相似性介于98～99％之間，與Streptomyceskanamyceticus的系統發育關系最為密切，其之間的序列相似性為99％，這與目前屬的界定中16SrDNA序列相似性不低于95％的標準相符合。但該菌株在系統進化樹上不與任何已知菌種相聚，而是以較高的進化差異獨立成枝，說明該菌株與所有參比模式菌株在進化上均存在較大差異。(3)放線菌菌株KN37的形態鑒定菌株KN37在大多數培養基上生長良好(見表1)，在高氏培養基上菌落絨毛狀，白色(圖1)，基內菌絲無橫隔，不斷裂，氣生菌絲生長旺盛，孢子柱形，表面光滑。KN37菌株在各個培養基上均無可溶性色素產生。表1，菌株KN37的培養特征培養基基內菌絲氣生菌絲菌落生長情況淀粉甘油培養基白色白色+PDA培養基白色白色+++ISP4培養基白色白色+++察氏培養基白色白色+ISP5培養基白色白色+++LB培養基淺黃色淺黃色+++牛肉膏蛋白胨培養基白色乳白色++Bennett培養基白色白色+++高氏一號培養基淺黃色白色+++注：++為正常生長；+為生長狀況較差；+++為生長旺盛。菌株KN37的生理生化特性和碳源利用情況如下：菌株KN37明膠液化和硝酸鹽還原反應均為陽性；菌株KN37可利用葡萄糖、D-核糖、蔗糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和纖維素作為唯一碳源，但不能利用D-果糖和肌醇。實施例2：菌株KN37的生物活性及其應用(1)菌株KN37對病原菌的抑制活性利用生長速率法測定菌株KN37發酵液對番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、番茄葉霉病菌、番茄晚疫病菌、番茄細菌性斑點病菌、棉花枯萎病菌、棉花黃萎病菌、辣椒疫霉病菌、蘋果炭疽病菌、黃瓜炭疽病菌、油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、白菜黑斑病菌、玉米小斑病菌、煙草赤星病菌、稻瘟病菌、根腐病菌、立枯病菌等多種病原菌的抑制活性。結果參見表2所示，菌株KN37對大多病原菌均具有很好的抑制效果(表2)。表2，菌株KN37發酵液對18種病原菌的抑制作用病原菌抑制率％病原菌抑制率％番茄灰霉病菌90.26棉花黃萎病菌64.88番茄早疫病菌72.66辣椒疫霉病菌72.07番茄葉霉病菌74.02蘋果炭疽病菌88.89番茄晚疫病菌85.98黃瓜炭疽病菌85.06番茄細菌性斑點病菌91.67油菜菌核病菌97.85棉花枯萎病菌50.62小麥赤霉病菌73.76水稻紋枯病菌35.79白菜黑斑病菌58.91玉米小斑病菌42.67煙草赤星病菌51.32稻瘟病菌69.42根腐病菌86.33(2)菌株KN37發酵液對番茄灰霉病的防治效果利用組織法測定KN37對番茄灰霉病的防治效果，結果參見表3顯示，菌株KN37發酵液對番茄灰霉病具有很好的保護作用。表3，菌株KN37發酵液對番茄灰霉病的保護和治療效果(3)菌株KN37發酵液對番茄病害的防治效果KN37菌株發酵液施用于大棚內的番茄后，番茄灰霉病、番茄早疫病、番茄晚疫病、番茄葉霉病、番茄細菌性病害的發生率和危害程度菌顯著降低(表4)。表4，菌株KN37發酵液對大棚番茄病害的防治效果病害名稱防治效果％病害名稱防治效果％灰霉病62.72早疫病61.53晚疫病58.43葉霉病71.66細菌性病害55.25根部病70.84根據本實施例結果表明，本發明所述的菌株KN37經過液體發酵培養，其發酵液中含有抑制常見農作物病原菌的物質，能夠顯著減輕病害的發生，有望開發成為一種新型的防治農作物病害的微生物藥劑。上面結合實施例對本發明做了進一步的敘述，但本發明并不限于上述實施方式，在本領域的普通技術人員所具備的知識范圍內，還可以在不脫離本發明宗旨的前提下做出各種變化。序列表<110>石河子大學<120>一種放線菌菌株KN37及其應用<160>1<210>1<211><212>RNA<213>放線菌菌株KN37<400>1ACCATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACACGCTCAGGCATCTGAGTGTGTTGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGAAGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGAAGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGA當前第1頁1 2 3