本發明涉及生物技術領域，特別涉及二代測序文庫構建技術。

背景技術：

二代測序由于其超高的測序能力在科研和臨床中具有極為重要的應用。二代測序技術也稱深度測序、大規模平行測序，核心思想是邊合成邊測序(Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列，現有的技術平臺主要有Roche/454FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。這三個技術平臺各有優點，454FLX的測序片段比較長，高質量的讀長能達到400bp；Solexa測序性價比最高，不僅機器的售價比其他兩種低，而且運行成本也低，在數據量相同的情況下，成本只有454測序的1/10；SOLID測序的準確度高，原始堿基數據的準確度大于99.94％，而在15×覆蓋率時的準確度可以達到99.999％。

Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原理是邊合成變測序。在Sanger等測序方法的基礎上，通過技術創新，用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據捕捉的熒光信號并經過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。

二代測序的一般流程如下：1)文庫制備，將DNA用霧化或超聲波隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個核苷酸黏性末端。然后將測序接頭與片段連接；2) 簇的創建，將模板分子加入芯片用于產生克隆簇和測序循環。芯片有8個縱向泳道的硅基片。每個泳道內芯片表面有無數的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構，以供后續的預擴增使用。通過不斷循環獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段；3)測序，DNA聚合酶結合熒光可逆終止子，熒光標記簇成像，在下一個循環開始前將結合的核苷酸剪切并分解；4)數據分析，測序得到的原始數據是長度為幾十個堿基的序列，要通過生物信息學工具將這些短的序列組裝成長的Contigs甚至是整個基因組的框架，或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上，進一步分析得到有生物學意義的結果。

聚合酶鏈反應(即PCR)是一種廣泛運用于分子遺傳和診斷的技術，用于放大擴增特定的DNA片段，可看作是生物體外的特殊DNA復制，可分析任何短的DNA序列，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加，即使樣品中只含有低水平的DNA。PCR技術可用于擴增分析用的DNA或RNA選定片段。

目前市場上最成功的商業化多重PCR建庫技術是Thermo Fisher公司的Ampliseq技術，該技術可以在同一孔反應中完成上千對引物的擴增，使得多個靶標區域的富集可以通過一次PCR反應完成，隨后加上Ion Torrent測序平臺的通用接頭建好文庫用于二代測序。然而，這個產品存在最大的缺陷是客戶定制化的panel設計生產周期較長，需要兩到三個月，嚴重的增加了時間成本；并且每個樣本的建庫費用高達1000-2000元，致使其經濟成本極高；另外該試劑盒只適用于Ion Torrent測序平臺，受平臺因素影響大，亦不利于測序費用的降低。

技術實現要素：

鑒于以上問題，本發明提供了一種基于多重PCR的二代測序建庫技術，該技術可以有效的解決Ampliseq試劑盒存在的問題，對于客戶定制化的panel設計生產周期只需要兩周，并且可以極大的降低單個樣本建庫的成本，且在IonTorrent和Illumina測序平臺都通用。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明中用到了兩輪多重PCR來建庫。

首先針對每個靶標區域或者靶標位點，需要設計兩條特異性引物，一條引物在另一條引物的3’下游100-150bp的位置，處于下游的引物在5’端加上二代測序平臺通用的測序接頭。上游的引物OP用于第一輪多重PCR，下游的引物IP用于第二輪多重PCR。

具體的建庫過程是：

步驟1，將樣本DNA進行片段化處理，隨后每個片段兩端加上特殊的接頭；

步驟2，加入第一輪擴增的上游引物混合池，與特殊接頭互補的通用引物，配制成PCR總體系，進行第一輪擴增；

步驟3，將第一輪PCR產物純化后，加入第二輪擴增的下游引物混合池，與第二步中使用過的特殊接頭互補的通用引物配制成PCR總體系，進行第二輪擴增；

步驟4，將第二輪PCR產物純化后，配置反應總體系，進行Q-PCR定量，稀釋到合適的濃度，即可用于二代測序。

上述技術方案中，作為優選，步驟2中，第一輪特異性引物是普通的PCR擴增引物，共20個左右的堿基，Tm值設定在60℃，序列根據目標區域設計得到，多個引物混成一個OP引物池做為第一輪PCR的上游引物。PCR總體系為：2倍PCR Mix 35uL，10umol/L P7 1uL，1umol/L OP 1uL或0.5umol/L OP 2uL，DNA 25uL。

上述技術方案中，作為優選，步驟3中，第二輪特異性引物是普通的PCR擴增引物，在其5’端加上測序接頭5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’共80個左右的堿基，其中根據目標區域設計得到的序列長度是20個堿基左右，Tm值設定在60℃，多個引物混成一個IP引物池做為第二輪PCR的上游引物。P7的序列：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3’。PCR總體系為：2倍PCR Mix 15uL，10umol/L P7 1uL，1umol/L OP 1uL或0.5umol/L OP 2uL，DNA 5uL，NFW 5uL。

上述技術方案中，作為優選，所述步驟4中的PCR總體系10uL具體為：VAHTS SYBR qPCR Master Mix 5uL，qPCR Primer Mix 1uL，DNA 2uL，ROXReference Dye 2 0.2uL，NFW 5uL。

上述技術方案中，作為優選，所述的第一輪PCR擴增循環數目為10-14。

上述技術方案中，作為優選，所述的第二輪PCR擴增循環數目為10-14。

本發明的優點和有益效果在于：提供一種基于多重PCR的二代測序建庫技術。在二代測序過程中采用該技術則不需要再購買商業的建庫試劑盒，所有反應試劑都可以單獨購買組合，極大的降低了實驗成本。另外由于在PCR過程中固定了一端的通用引物，極大的降低了多重PCR反應體系中的引物種類和數量，可以有效的抑制非特異性擴增和引物之間的相互干擾，也降低了不同引物間的擴增效率的差異。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為兩輪多重PCR的二代測序建庫過程。

圖2為10個樣本100 SNPs平均覆蓋深度。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發明的技術方案，而不能以此來限制本發明的保護范圍。

實施例1.基因組DNA片段化

a.打開Qsonica超聲破碎儀，提前讓循環水浴降溫，工作溫度為4℃。

b.轉移總量為1ug的基因組DNA到0.2mL的離心管中，用Nuclease Free Water(以下稱NFW)補足到100uL，震蕩混勻，短時離心。

c.將0.2mL的離心管裝入超聲破碎儀的適配器，旋緊中軸，插入頂蓋，閉合機器，設定打斷程序：振幅-25％，on&off為20s-30秒，時長15分鐘。開始打斷。

d.打斷結束后，取出0.2mL離心管，按照順序排列整齊，開蓋。

實施例2. 3in 1接頭連接

a.配置反應體系22uL，先配置去除DNA之外的試劑，按照理論值的125％配，震蕩混勻，短時離心，分裝到96孔板中，每孔加7uL，之后從前面0.2mL離心管中轉移15uL的DNA到每孔中，蓋上蓋子。震蕩混勻，短時離心。

b.96孔板或八聯管放入PCR儀。設定程序：25℃30分鐘、72℃15分鐘、4℃保持。

c.結束后，每孔中加入0.5uL的T4 Ligase(單槍)和1uL的Adapter，蓋上新的蓋子。震蕩混勻，短時離心。室溫下孵育20-30分鐘。

d.磁珠震蕩30秒，充分混勻后，每一孔中加入25uL的磁珠，蓋上新蓋子。震蕩混勻，短時離心。室溫下孵育5分鐘。

e.將96孔板或八聯管放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，吸棄上清。

f.每孔加入100uL 80％乙醇，靜置30秒，吸棄上清。重復一遍。短時離心，吸棄上清。

g.晾干3-5分鐘，觀察磁珠表面不再潮濕反光，成霧面狀，可離開磁力架，每孔加入30uL NFW，吹打混勻重懸磁珠，室溫孵育1分鐘。

h.孔板再次放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，轉移上清到新的孔板中。

實施例3.多重PCR

一、第一輪多重PCR

a.按照Qubit dsDNA HS Assay Kit操作手冊檢測樣品濃度，根據Qubit檢測的樣本濃度，每個樣品取同樣的量(10ng)，每5～10個樣本混合在一起轉移到新的孔板中。

b.第一輪特異性引物是普通的PCR擴增引物，共20個左右的堿基，Tm值設定在60℃，序列根據目標區域設計得到，多個引物混成一個OP引物池做為第一輪PCR的上游引物。配置PCR總體系,按照理論值的125％配，震蕩混勻，短時離心。

c.孔板放入PCR儀中，選擇MAPlex-1st程序運行2個小時。

二、PCR產物純化

a.PCR結束后，取下孔板，打開蓋子，每孔加入60uL的磁珠，吹打混勻，室溫下孵育5分鐘。

b.將孔板或八聯管放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，吸棄上清。

c.每孔加入100uL 80％乙醇，靜置30秒，吸棄上清。重復一遍。

d.晾干3-5分鐘，觀察磁珠表面不再潮濕反光，成霧面狀，可離開磁力架，每孔加入20uL NFW，吹打混勻重懸磁珠，室溫孵育1分鐘。

e.孔板再次放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，轉移上清到新的孔板中。

三、第二輪多重PCR

a.第二輪特異性引物是普通的PCR擴增引物，在其5’端加上測序接頭5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’共80個左右的堿基，其中根據目標區域設計得到的序列長度是20個堿基左右，Tm值設定在60℃，多個引物混成一個IP引物池做為第二輪PCR的上游引物。P7的序列：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’。配置PCR總體系，按照理論值的125％配制，震蕩混勻，短時離心。

b.孔板放入PCR儀中，選擇MAPlex-2nd程序運行2個小時。

四、PCR產物純化

步驟同二，做兩次純化，徹底去除引物二聚體。第一次使用28uL的磁珠純化，用20uL的NFW洗脫；第二次用20uL的磁珠純化，用25uL的NFW洗脫。

五、電泳鑒定

每個樣品取5uL，進行2.5％的瓊脂糖電泳，觀察是否有條帶，以及條帶長度是否在300-400bp之間。

實施例5.文庫定量與混合

a.將標準品、熒光定量試劑、引物從-20℃取出放置于冰上融化。

b.樣品稀釋10000倍，分兩次梯度稀釋。第一次取文庫原液2uL，加入198uL的NFW，振蕩混勻或者用槍吹打混勻，短時離心。再從中取出10uL，加入990uL NFW，振蕩混勻或者用槍吹打混勻，短時離心。

c.配置反應體系10uL，,按照理論值的125％配，震蕩混勻，短時離心。

d.打開ABI7500熒光定量PCR儀，放入樣品，開始檢測。檢測結束，根據檢測結果將所有樣品稀釋到同樣濃度，使終濃度不小于2.5nmol/L，體積不小于30uL，再等量混合后，送出測序。

e.實驗結果如圖2所示，MAPlex custom panel中包含100個SNPs，基因組DNA起始量是250ng，通過MAPlex方法建庫，HiSeq2500測序平臺PE 2*150測序，單個樣本取100Mb數據，上靶率93％，平均深度為321×，92％的位點測序深度在20×以上，可重復性100％。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海美迪維康生物科技有限公司

<120> 基于多重PCR的二代測序建庫技術

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<170> PatentIn version 3.5

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caagcagaag acggcatacg ag 22