1.二代測序文庫的構(gòu)建方法,其特征在于,包括如下步驟:
步驟1,將樣本DNA進行片段化處理,隨后每個片段兩端加上特殊的接頭;
步驟2,加入第一輪擴增的上游引物混合池,與特殊接頭互補的通用引物配制成PCR總體系,進行第一輪擴增;
步驟3,將第一輪PCR產(chǎn)物純化后,加入第二輪擴增的下游引物混合池,與第二步中使用過的特殊接頭互補的通用引物配制成PCR總體系,進行第二輪擴增;
步驟4,將第二輪PCR產(chǎn)物純化后,配制反應(yīng)總體系,進行Q-PCR定量,稀釋到合適的濃度,即可用于二代測序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二代測序文庫的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟2中的PCR總體系具體為:2倍PCR Mix 35uL,10umol/L P7 1uL,1umol/L OP 1uL,DNA 25uL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二代測序文庫的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟2中的PCR總體系具體為:2倍PCR Mix 35uL,10umol/L P7 1uL,0.5umol/L OP 2uL,DNA 25uL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二代測序文庫的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟3中的PCR總體系具體為:2倍PCR Mix 15uL,10umol/L P7 1uL,1umol/L OP 1uL,DNA 5uL,NFW 5uL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二代測序文庫的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟3中的PCR總體系具體為:2倍PCR Mix 15uL,10umol/L P7 1uL,0.5umol/L OP 2uL,DNA 5uL,NFW 5uL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二代測序文庫的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟4中的PCR總體系10uL具體為:VAHTS SYBR qPCR Master Mix 5uL,qPCR Primer Mix 1uL,DNA 2uL,ROX Reference Dye 2 0.2uL,NFW 5uL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二代測序文庫的構(gòu)建方法,其特征在于,所述的第一輪PCR擴增循環(huán)數(shù)目為10-14。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二代測序文庫的構(gòu)建方法,其特征在于,所述的第二輪PCR擴增循環(huán)數(shù)目為10-14。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的二代測序文庫的構(gòu)建方法,其特征在于,所述的步驟2中,第一輪特異性引物是普通的PCR擴增引物,共20個左右的堿基,Tm值設(shè)定在60℃,序列根據(jù)目標區(qū)域設(shè)計得到,多個引物混成一個OP引物池做為第一輪PCR的上游引物。
10.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的二代測序文庫的構(gòu)建方法,其特征在于,所述的步驟3中,第二輪特異性引物是普通的PCR擴增引物,在其5’端加上測序接頭
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGC TCTTCCGATCT-3’共80個左右的堿基,其中根據(jù)目標區(qū)域設(shè)計得到的序列長度是20個堿基左右,Tm值設(shè)定在60℃,多個引物混成一個IP引物池做為第二輪PCR的上游引物;P7的序列:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3’。