本發明屬于海洋活性物質制備的
技術領域：
，具體涉及一種從鱈魚內臟中提取高純度海產多不飽和脂肪酸磷脂的方法。
背景技術：
：磷脂是一類含磷酸根的類脂化合物，是組織細胞的基本組成成分，包括鞘磷脂和甘油磷脂兩大類。前者主要見于高等動物的紅細胞膜中，后者在動物肝臟、腦及卵巢中含量豐富。磷脂不僅具有較高的營養價值，還具有生理調節機能，促進人體新陳代謝、增強免疫力、預防疾病等作用。現在，美國、歐洲、日本等發達國家已將磷脂應用于臨床中，預防腦、心、肝、腫瘤等疾病。此外，磷脂還具有乳化、潤濕、抗氧化、改善物料粘度、防止淀粉老化等特征，使其在食品工業、輕工、化工等領域有著廣泛的應用。目前，市場上磷脂產品主要是大豆磷脂和蛋黃磷脂。大豆磷脂雖然存在廣泛，價格低廉，但其脂肪酸組成相對簡單，不飽和程度較低；蛋黃磷脂的PC純度較高，但生產成本高，缺少對人體有益的多不飽和脂肪酸。海產動物來源的磷脂因其側鏈中富含EPA和DHA等豐富的ω-3多不飽和脂肪酸，具有顯著的降血脂、抗衰老、促進神經傳導、提高大腦活力、預防心腦血管疾病，保肝、增強免疫力、抑制腫瘤細胞生長等多種功能，開發利用前景廣闊。我國海產品加工廢棄物原料豐富，高值化利用市場前景好，但目前尚無規模化生產技術。魚蝦貝等加工下腳料大都用于加工低值產品或作為廢棄物處理掉，造成了漁業資源的極大浪費，同時還存在著環境污染的隱患。因此，利用這些下腳料提取精制高經濟附加值的多不飽和脂肪酸磷脂，對于提高海洋資源利用價值，突破海產磷脂產業化關鍵技術意義重大，且具有顯著的經濟價值和社會意義。鱈魚廣泛分布于世界各大海洋，生活在海洋底層和中下層，是海洋漁業捕撈的主要對象之一。全球鱈魚總產量較高，約占海洋漁業總產量的12％。現代隨著人們對健康水平要求的提高，市場對魚類產品需求越來越大，促使我國的海洋魚類加工業迅速發展。目前，我國鱈魚每年加工量約40～50萬噸，鱈魚的加工會產生大量的加工副產物，如魚頭、內臟、魚皮等，其重量約占原料魚的50％左右。這些副產物，特別是鱈魚內臟，大都用于加工低值產品或作為廢棄物直接丟棄，既污染了環境，又造成資源的嚴重浪費。隨著科學技術和工業化的快速發展，魚類加工下腳料的高值化利用越來越受到重視。鱈魚內臟含有大量的磷脂、不飽和脂肪酸、蛋白質和維生素等，具有極大的利用空間和利用價值。國內外對磷脂的提取純化進行了很多的研究，常用的方法有：溶劑提取法、吸附色譜法、超臨界萃取法、酶解法、無機鹽復合沉淀法、微波提取法、膜分離法等。但是，這些方法存在很多的技術缺陷：原料方面主要從大豆和蛋黃中提取，從而和人類搶奪食物資源；超臨界萃取法、膜分離法等工藝較為復雜，操作成本高；無機鹽沉淀法引入金屬離子(Zn2+、Cd2+等)，具有一定的毒性，影響磷脂的質量；硅膠吸附色譜法，常造成死吸附，填料不易重復利用，易造成環境污染等。技術實現要素：本發明針對現有技術的不足，提供一種操作簡便，成本低，安全環保的利用鱈魚內臟制備高純度多不飽和脂肪酸磷脂的方法。為了實現上述發明目的，本發明提供的技術方案，一種從鱈魚內臟中提取高純度海產多不飽和脂肪酸磷脂的方法，將鱈魚內臟粉碎，用堿性乙醇液攪拌提取，提取液經包合凈化劑脫膽固醇、脫色后得到粗磷脂，粗磷脂經超聲強化超臨界萃取、聚苯乙烯凝膠柱層析得到高純度多不飽和脂肪酸磷脂。具體的，包括以下步驟：(1)將鱈魚內臟粉碎，加入85～100％的堿性乙醇液攪拌提取2～3次，每次2～4小時，合并提取液，用鹽酸調pH值到中性；(2)提取液中加入包合凈化劑,攪拌30～50min，離心取上清液，于低于50℃下減壓濃縮，得到脫膽固醇的粗磷脂；(3)粗磷脂用少量無水乙醇溶解，用適量活性白土分散，揮干溶劑，進行超聲強化超臨界CO2提取，超聲頻率為10～25KHz，萃取溫度為20～24℃，萃取壓力為20～26Mpa,萃取時間為1～2.5h，CO2流量為10～15L/h，萃取結束后收集總磷脂；(4)總磷脂用少量二氯甲烷溶解后，過濾，經Bio-BeadsS-X2聚苯乙烯凝膠柱層析，環己烷洗脫除去小極性雜質后，環己烷-乙酸乙酯洗脫劑洗脫，收集洗脫液，薄層色譜檢測后，合并洗脫液，于低于50℃下減壓濃縮，干燥，得到精制磷脂。其中：所述的鱈魚內臟，包括生殖腺(卵和魚白)、心臟、肝臟、胃和腸等；所述的原料與堿性乙醇液按照質量體積比1:6～1:12混合；所述的堿性乙醇液為向乙醇液中添加堿性物質，使其pH達到9.0～10.0，堿性物質為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉或醋酸鈉等。所述的包合凈化劑為β-環糊精和活性炭的混合物，其中，β-環糊精和活性炭的重量比例為1:10，兩者直接混合即可；包合凈化劑用量為每1000mL提取液中加入10～40g包合凈化劑；所述步驟(2)中離心轉速為3000～5000rpm。所述步驟(3)中活性白土的用量為粗磷脂重量的2～4倍，超聲頻率為18～24KHz，萃取溫度為20～24℃，萃取壓力為22～24Mpa，萃取時間為1.5～2h，CO2流量為10～15L/h；所述步驟(4)中洗脫劑為環己烷-乙酸乙酯按照1:1比例混合后的溶劑，洗脫速度為每小時0.5～1.5倍柱體積。與現有技術相比，本發明具有以下優點：(1)利用鱈魚加工下腳料，進行廢物利用，一方面解決大量剩余海洋副產物資源的浪費問題，減少環境污染；另一方面豐富了磷脂的制備來源，且原料來源廣泛廉價，降低了磷脂提取成本，具有重要的生態、經濟和社會意義；(2)提取過程中通過向乙醇中添加堿性物質，對磷脂起到增溶作用，提高了磷脂的收率；(3)提取過程中溫度均控制在50℃以下，避免喪失磷脂的生理活性，適合海產多不飽和脂肪酸磷脂的提取；(4)提取過程操作簡便，提取效率高；柱層析所用填料機械強度好，死吸附少，可重復使用。(5)凈化過程中采用β-環糊精和活性炭組成的包合凈化劑，除去膽固醇的同時進行脫色，快速高效的達到凈化的目的。(6)超臨界萃取過程中采用更低的萃取溫度、更低的萃取壓力，但是卻具有更短的萃取時間，萃取率得到明顯提高，節約能源，降低成本；(7)本發明方法得到的鱈魚內臟高純度多不飽和脂肪酸磷脂，磷脂的純度大于等于97％。附圖說明圖1為本發明實施例1至實施例4得到的高純度磷脂薄層層析結果圖：其中圖1中1、2、3、4分別為實施例1、2、3、4對應的層析結果。圖2為磷酸二氫鉀的標準曲線。圖3為實施例1得到的高純度磷脂氣質色譜分析結果。具體實施方式下面結合具體試驗方法和附圖對本發明的技術方案及其所產生的技術效果進行進一步的闡述，下述說明僅是為了解釋本發明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發明的保護范圍。實施例1稱取100g冷凍鱈魚內臟，用組織粉碎機粉碎，加入1000mL90％的乙醇液(醋酸鈉使其pH為9.0)，室溫下攪拌提取2小時，減壓抽濾得到提取液；濾渣加入相同堿性乙醇液重復攪拌提取1次，抽濾得到提取液，合并兩次提取液，鹽酸調節pH至中性；提取液中加入22g包合凈化劑(凈化劑中β-環糊精與活性炭的重量比為1:10)，攪拌30min，靜置后離心10min，取上清液于47℃下減壓濃縮去除溶劑得到粗磷脂；粗磷脂用少量無水乙醇溶解后，用3倍粗磷脂重量的活性白土分散，揮干溶劑，投入萃取釜中，在頻率為24KHz的超聲條件下進行強化超臨界CO2萃取得到總磷脂，其萃取條件為：萃取壓力為22MPa，萃取時間為90min，萃取溫度為20℃，CO2流量為15L/h；少量二氯甲烷溶解總磷脂，過濾后，濾液上Bio-BeadsS-X2層析柱，環己烷洗脫除去小極性雜質后，環己烷-乙酸乙酯按比例1:1等度洗脫，流速為每小時1.0倍柱體積，用薄層層析法檢識，展開劑為10:11.3:11.7:2.7的二氯甲烷-無水乙醇-三乙胺-水體系，根據Rf值和顯色特征來判斷、合并含磷脂部分，45℃減壓濃縮洗脫液，真空干燥后得到高純度磷脂，其收率為2.8％(對投料冷凍鱈魚內臟計)，磷脂純度為97.17％。產品經薄層檢測分析，結果如圖1中1所示，圖中可以看出，所提取的鱈魚內臟磷脂中主要組分包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷酯酰絲氨酸(PS)、雙磷脂酰甘油(CP)及鞘磷脂(SM)等。取本實施例得到的高純度磷脂樣本50mg，加200μL水，勻漿三次，每次5500RPM，20秒，氮氣保護。加400μLMTBE、80μL甲醇和200μL水。渦旋30秒，超聲10分鐘。離心15min，取上層MTBE層蒸干。用100μL二氯甲烷：甲醇(1:1)復溶后進行HPLC-MS分析，經鑒定其所含各類磷脂中主成分結構為PC(16:0/18:1)，PE(18:0p/20:5)，CP(18:2/18:2/18:2/18:2)，SM(d18:1/14:0)，LPC(18:1)，LPE(20:5)，LPI(20:5)，PA(18:0/20:5)，PG(16:0/20:2)，PI(18:0/20:5)，PS(18:0/20:5)。實施例2稱取100g冷凍鱈魚內臟，組織粉碎機粉碎后加入600mL95％的乙醇液(碳酸氫鈉調節其pH為10.0)，室溫下攪拌提取4小時，減壓抽濾得到提取液；濾渣加入相同堿性乙醇液重復攪拌提取2次，每次提取4小時，抽濾得到提取液，合并提取液，鹽酸調節pH至中性；向提取液中加入36g包合凈化劑(凈化劑中β-環糊精與活性炭的重量比為1:10)，攪拌30min，靜置后離心10min，取上清液于45℃下減壓濃縮去除溶劑，得到粗磷脂；粗磷脂用少量無水乙醇溶解后，用2倍粗磷脂重量的活性白土分散，揮干溶劑，投入萃取釜中，在頻率為22KHz的超聲條件下進行強化超臨界CO2萃取得到總磷脂，其萃取條件為：萃取壓力為23MPa，萃取時間為2小時，萃取溫度為23℃，CO2流量為12L/h；總磷脂用少量二氯甲烷溶解，過濾后，濾液上Bio-BeadsS-X2層析柱，環己烷洗脫除去小極性雜質后，環己烷-乙酸乙酯按比例1:1洗脫，流速為每小時0.5倍柱體積，用薄層層析法檢識，展開劑為10:11.3:11.7:2.7的二氯甲烷-無水乙醇-三乙胺-水體系，根據Rf值和顯色特征來判斷、合并含磷脂部分，43℃減壓濃縮洗脫液，真空干燥，得到高純度磷脂，其收率為3.4％(對投料冷凍鱈魚卵計)，磷脂純度為98.54％。產品經薄層檢測分析，結果如圖1中2所示。實施例3稱取100g冷凍鱈魚內臟，用組織粉碎機進行粉碎，加入1200mL堿性乙醇(碳酸氫鈉調節其pH為10.0)，室溫下攪拌提取4小時，減壓抽濾得到提取液；濾渣加入相同堿性乙醇重復攪拌提取1次，抽濾得到提取液，合并提取液，鹽酸調節pH至中性；向提取液中加入72g包合凈化劑(凈化劑中β-環糊精與活性炭的重量比為1:10)，攪拌40min，離心10min，取上清液于43℃下減壓濃縮去除溶劑，得到粗磷脂；粗磷脂用少量無水乙醇溶解后，用4倍粗磷脂重量的活性白土分散，揮干溶劑，投入萃取釜中，在頻率為20KHz的超聲條件下進行強化超臨界CO2萃取得到總磷脂，其萃取條件為：萃取壓力為22MPa，萃取時間為100min，萃取溫度為24℃，CO2流量為10L/h；少量二氯甲烷溶解總磷脂，過濾后，濾液上Bio-BeadsS-X2層析柱，環己烷洗脫除去小極性雜質后，環己烷-乙酸乙酯按1:1的比例進行洗脫，流速為每小時1.5倍柱體積，用薄層層析法檢識，展開劑為10:11.3:11.7:2.7的二氯甲烷-無水乙醇-三乙胺-水體系，根據Rf值和顯色特征來判斷、合并含磷脂部分，43℃減壓濃縮洗脫液，于低于50℃下真空干燥，得到高純度磷脂，其收率為3.9％(對投料冷凍鱈魚卵計)，磷脂純度為97.81％。產品經薄層檢測分析，結果如圖1中3所示。實施例4稱取100g冷凍鱈魚卵，組織粉碎機進行粉碎，加入800mL85％的乙醇液(醋酸鈉調節其pH為9.5)，室溫下攪拌提取3小時，減壓抽濾得到提取液；濾渣加入相同堿性乙醇液重復攪拌提取2次，抽濾得到提取液，合并提取液，鹽酸調節pH至中性；向提取液中加入96g包合凈化劑(凈化劑中β-環糊精與活性炭的重量比為1:10)，攪拌50min，離心10min后取上清液，于48℃下減壓濃縮去除溶劑，得到粗磷脂；粗磷脂用少量無水乙醇溶解后，用3倍粗磷脂重量的活性白土分散，揮干溶劑，投入萃取釜中，在頻率為18KHz的超聲條件下進行強化超臨界CO2萃取得到總磷脂，其萃取條件為：萃取壓力為24MPa，萃取時間為110min，萃取溫度為21℃，CO2流量為14L/h；少量二氯甲烷溶解總磷脂，過濾后，濾液上Bio-BeadsS-X2層析柱，環己烷洗脫除去小極性雜質后，環己烷-乙酸乙酯按1:1的比例進行洗脫，流速為每小時1.0倍柱體積，用薄層層析法檢識，展開劑為10:11.3:11.7:2.7的二氯甲烷-無水乙醇-三乙胺-水體系，根據Rf值和顯色特征來判斷、合并含磷脂部分，43℃減壓濃縮洗脫液，真空干燥，得到高純度磷脂，其收率為3.2％(對投料冷凍鱈魚卵計)，磷脂純度為97.52％。產品經薄層檢測分析，結果如圖1中4所示。對比例1稱取冷凍鱈魚卵，組織粉碎機進行粉碎，分成相等重量2份，各100g，一份加入800mL85％的堿性乙醇液(醋酸鈉調節其pH為9.5)，一份加入800mL85％的乙醇液，然后其他提取分離參數與實施例4相同，制備為相應的磷脂產品，得到的磷脂純度和產品收率如表1所示。可見，相同的原料和制備過程，堿性物質的添加有利于磷脂的提取。表1中性乙醇提取堿性乙醇提取磷脂收率1.6％3.2％磷脂純度79.89％97.52％對比例2稱取冷凍鱈魚卵200g，組織粉碎機進行粉碎，加入2000mL90％的乙醇液(醋酸鈉使其pH為9.0)，室溫下攪拌提取2小時，重復攪拌提取1次，提取液調節pH至中性，加入包合凈化劑，攪拌30min，靜置后離心取上清液于47℃下減壓濃縮去除溶劑得到粗磷脂。粗磷脂分為相等重量2份，一份進行超聲強化超臨界CO2萃取，一份進行普通超臨界CO2萃取，，實驗結果如表2所示。可見，超聲強化超臨界萃取采用更低的萃取溫度和萃取壓力，卻在更短的萃取時間里，提高產品的收率和磷脂純度，達到節能高效的目的。表2超聲強化超臨界CO2萃取常規超臨界CO2萃取萃取壓力24MPa30MPa萃取溫度20℃35℃萃取時間90min120minCO2流量15L/h20L/h超聲輔助是否收率2.7％1.3％磷脂純度97.09％89.39％試驗例①測定方法采用分光光度法(鉬藍比色法)測定磷脂的含量。做出的磷酸二氫鉀的標準曲線，如附圖2所示。準確量取0.3mL磷脂樣品溶液(0.5mg/mL的二氯甲烷溶液)置于10mL的刻度試管中(空白對照量取0.3mL二氯甲烷溶劑)，水浴揮干溶劑，加入4滴濃硫酸、3滴高氯酸于電爐上消化至無色澄清，冷卻后補水至2mL，加入1滴酚酞指示劑，用50％氫氧化鈉溶液中和至溶液顯紅色，緩慢滴加稀硫酸(5/200，v/v)使紅色消失，補水至5mL，搖勻，依次加入1.0mL調節酸度的硫酸，搖勻，1.0mL鉬酸銨溶液，搖勻，0.6mL抗壞血酸溶液，補水至10mL，加塞混勻，迅速放入70℃的水浴中顯色30min取出置冷水中冷卻10min,以0mL為參比，在波長820nm處測定吸光值，代入標準曲線，得到無機磷的含量，再乘以系數26.3即得總磷脂的含量。②脂肪酸成分分析量取甲醇110mL，緩慢加入氯化乙酰21.5mL，冰浴中攪拌混勻，加完后封口，冰藏，作為反應液備用。另取5mg實施例1得到的高純度磷脂樣品，置于5mL安培管中，滴3滴苯，溶解樣品，加5ml上述反應液，振蕩，封口，100℃水浴1h。取出反應液，按照1:5加入正己烷萃取，收集正己烷層，濃縮，進行GC-MS分析，結果如圖3所示。該結果說明本發明得到的鱈魚內臟磷脂中富含多不飽和脂肪酸EPA和DHA，相比大豆磷脂和蛋黃磷脂具有更大的營養價值和藥用價值。以上所述，僅是本發明的優選實施例而已，并非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是在未脫離本發明原理的前提下，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發明技術方案的保護范圍。當前第1頁1 2 3