本發(fā)明屬于功能基因篩選技術領域，具體涉及一種具有熱穩(wěn)定性和降解卡拉膠活力的酶。

背景技術：

卡拉膠(carrageenan)是海洋紅藻中的一種結構性多糖，由α-1,3和β-1,4糖苷鍵交替連接的D-半乳糖或其衍生物組成。它是一種親水性膠體，主要存在于海藻的細胞壁中。根據(jù)卡拉膠二糖結構單元中所含硫酸基和內(nèi)醚鍵的數(shù)目和位置劃分為若干種類型，其中κ-，λ-，ι-卡拉膠較為常見，另外也有α-，β-，θ-，μ-，ν-，γ-，δ-，ξ-，π-，ω-卡拉膠等類型。目前卡拉膠主要用于食品及與食品相關工業(yè)，已有的研究結果表明：卡拉膠寡糖具有多種生物活性，如抗病毒、抗氧化、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等，因此在醫(yī)藥領域有很大的應用價值。

雖然卡拉膠有諸多優(yōu)點，但是卡拉膠的分子質(zhì)量大、溶解性差、機體不易吸收、利用率低等缺點，制約了卡拉膠在醫(yī)藥領域的應用。如何利用卡拉膠酶高效制備卡拉膠寡糖，提升卡拉膠的應用價值已成為當前卡拉膠研究亟需攻克的技術。迄今發(fā)現(xiàn)的卡拉膠酶大部分為熱不穩(wěn)定酶，當溫度高于60℃時就會迅速失活，嚴重限制了卡拉膠降解酶的應用。牟海津研究表明，卡拉膠降解菌M-2分泌的κ-卡拉膠酶在55℃放置30min即喪失全部酶活；Potin等研究顯示，Cytophaga菌株分泌的κ-卡拉膠酶在40℃放置1h，酶活亦完全喪失。而來源于嗜熱微生物的高溫酶因其作用溫度高、耐熱性好等優(yōu)點，是生物工程領域具有發(fā)展前景的酶資源。

嗜熱微生物由于能合成多種具有應用價值的耐熱酶，已成為近年來科學研究的熱點。微生物學家們普遍認為，能在55℃以上高溫環(huán)境生長的微生物為嗜熱微生物，包括最低等的古細菌和部分細菌，能在80℃以上環(huán)境中生長的為極端嗜熱菌，其中大部分是古細菌。耐熱酶是嗜熱微生物產(chǎn)生的一類熱穩(wěn)定性酶，這種酶蛋白最顯著特點就是在高溫下仍能保持很高的催化效率。由于在高溫條件下能提高底物和產(chǎn)物的溶解性，減少物質(zhì)與反應器的貼壁效應，同時還能降低染菌的風險，減少產(chǎn)物收集的難度，所以高溫酶有望取代傳統(tǒng)的常溫催化，廣泛用于食品、皮革加工、生物制藥、廢水處理等諸多生產(chǎn)領域。本發(fā)明從一株熱泉菌中分離獲得熱穩(wěn)定卡拉膠酶，通過克隆獲得其編碼基因并通過基因工程手段實現(xiàn)了異源高效表達，從而獲得了工業(yè)化生產(chǎn)熱穩(wěn)定卡拉膠酶的技術。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種具有熱穩(wěn)定性和降解卡拉膠活力的酶(簡稱為卡拉膠酶)及其應用，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。

本發(fā)明所提供的卡拉膠酶，其包含有：

1)氨基酸序列為SEQ ID NO:1的蛋白酶；

2)與1)中氨基酸序列具有90％或以上同源性的蛋白酶。

編碼上述酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2

本發(fā)明再一個方面提供一種用于重組表達上述酶的重組表達載體；

本發(fā)明還提供一種重組宿主細胞，轉入了上述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或上述重組載體。

本發(fā)明所提供的卡拉膠酶用于降解卡拉膠。

本發(fā)明從熱泉菌株中克隆獲得了一種具有熱穩(wěn)定性和降解卡拉膠活力的酶，將其編碼基因克隆到宿主中實現(xiàn)異源表達，最終實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)卡拉膠酶，該酶具有較強的高溫耐受力，為后續(xù)的工業(yè)應用奠定基礎。

附圖說明

圖1：經(jīng)SDS-PAGE電泳獲得的電泳圖；

圖2：重組酶的活性鑒定圖；

圖3：篩選的酶的最適反應溫度圖；

圖4：為篩選的酶降解卡拉膠的產(chǎn)物分析圖；其中注：M為標準寡糖對照；依次為酶活酶對照、15min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、360min、720min、1440min。

具體實施方式

下面結合說明書附圖和實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。

本發(fā)明說明書具體實施例中所使用的培養(yǎng)基的配比如下：

分離培養(yǎng)基(又名：Zobell 2216E海水培養(yǎng)基)組分如下：蛋白胨5g，酵母粉1g，用過濾后的陳海水定容至1000ml，121℃下高壓濕熱滅菌20min。

分離平板培養(yǎng)基組分如下：蛋白胨5g，酵母粉1g，瓊脂15g，用過濾后的陳海水定容至1000ml，121℃下高壓濕熱滅菌20min。

LB液體培養(yǎng)基組分如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，用去離子水定容至1000ml，121℃下高壓濕熱滅菌20min。

LB平板培養(yǎng)基組分如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g,瓊脂15g，用去離子水定容至1000ml，121℃下高壓濕熱滅菌20min。

微生物樣品采自于印度尼西亞卡利安達島東海岸的熱泉樣品(5°44’46”N,105°35’12”E)，經(jīng)16S DNA鑒定確定該菌為芽孢桿菌(Bacillus)屬；初步發(fā)酵實驗表明該菌株在高溫下具有降解卡拉膠的能力。將純化的菌株加入含30wt％的甘油溶液中，保存于-80℃超低溫冰箱中。

實施例1：

產(chǎn)熱穩(wěn)定卡拉膠酶熱泉菌的基因組文庫構建

(1)制備目的DNA片段

將芽孢桿菌菌(Bacillus)種子液接種于Zobell 2216E海水培養(yǎng)基中，于50℃、150rpm的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用細菌基因組提取試劑盒(購自Tiangen公司，DP302-02)提取染色體DNA，檢測其電泳DNA濃度，DNA長度大于40kb，符合建庫要求。

(2)基因組DNA的部分消化

芽孢桿菌菌(Bacillus)染色體DNA經(jīng)Sau3AI內(nèi)切酶部分消化，Sau3AI內(nèi)切酶酶切60min后，制得插入片段。酶切60min后，染色體DNA剛好酶切完全，適用于構建基因組文庫；當酶切時間超過80min后，酶切過度，各片段不是平均分布，而多為小片段，不利于建庫。因此選酶切60min作為菌株染色體DNA的不完全酶切時間。

(3)基因組文庫的構建

按照pUC118載體(購自Takara公司)和插入片段約1:3的摩爾比作連接反應。反應體系于16℃連接過夜，濃縮連接產(chǎn)物至3μl，分別取1μl轉化感受態(tài)細胞E.coli DH5α，培養(yǎng)后涂布與含有氨芐青霉素(50μg/ml)、IPTG(20μg/ml)和X-Gal(40μg/ml)的LB平板培養(yǎng)基上，于37℃靜置培養(yǎng)過夜至可見菌落，根據(jù)菌落藍白斑反應篩選轉化子。隨機挑取約18000個菌落作為基因組文庫的克隆保存，從平板中隨機挑選15個白色單菌落，提取質(zhì)粒，用BcaBEST Primer M13-47和BcaBEST Primer RV-M經(jīng)PCR擴增目的片斷，引物序列如下：

BcaBEST Primer M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

BcaBEST Primer RV-M：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸240s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

經(jīng)檢測每個克隆均有外源DNA，最小插入片段為800bp左右，最大插入片段6kb左右，平均插入片段大小約為4kb左右。

從基因組文庫中篩選一個周圍有明顯水解圈的克隆。提取重組質(zhì)粒并測序，獲得產(chǎn)熱穩(wěn)定卡拉膠酶完整的ORF。ORF的完整長度為1125bp，共編碼374個氨基酸，理論分子量為42.5kDa。

實施例2：熱穩(wěn)定卡拉膠的重組表達載體構建

將本發(fā)明獲得的熱穩(wěn)定卡拉膠基因克隆到表達載體上，構建重組表達菌株。首先基于全長序列，設計擴增全基因的引物：

上游引物F-GTCGTCGTCGACCAGTAATTTTACCGGTATC；

下游引物R-CATAAATCTAGACACTCACGACTAAAGTATCT；

PCR擴增確認基因全長序列。采用酶切克隆的方法構建表達質(zhì)粒，即用采用BamH I/XbaⅠ內(nèi)切酶對熱穩(wěn)定卡拉膠酶的PCR產(chǎn)物和表達載體pET-30(a)分別進行雙酶切，回收純化；利用T4 DNA Ligase進行連接，并轉化TOP10的感受態(tài)細胞。采用質(zhì)粒抽提試劑盒(購自Tiangen公司)提取陽性克隆的質(zhì)粒，經(jīng)檢測，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，該基因編碼400個氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

將上述制得的陽性克隆的質(zhì)粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株中，構建表達重組菌株；具體過程如下：

取-80℃保存的BL21，于冰上融化，以預冷的移液管槍尖吸取10μl重組質(zhì)粒，加入剛剛融化的BL21；輕搖混勻，冰浴放置30min，迅速轉移到42℃水浴中，準確放置90秒；迅速轉移到冰上，冷卻2min；然后加入800μl LB液體培養(yǎng)基，于37℃，150rpm，45min；涂布含卡那霉素50μg/mL的LB平板培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。

實施例3：利用重組表達菌株表達熱穩(wěn)定卡拉膠酶

將上述構建好的表達重組菌株轉接到100ml含有卡那霉素50μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴大培養(yǎng)直至菌液OD₆₀₀值達0.6時，15℃冷卻30min，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為1.0mmol/L，15℃搖床培養(yǎng)24h。低溫離心收集上清，濃縮凍干。然后進行Ni²⁺親和層析，由于表達的重組蛋白N端含有6×His tag，能親和吸附到層析柱中，經(jīng)不同濃度的咪唑溶液梯度洗脫后，收集洗脫液，凍干備用。重組蛋白的誘導表達以及純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，如圖1所示。

實施例4：熱穩(wěn)定卡拉膠酶活性檢測和酶特性分析

利用DNS(3,5-二硝基水楊酸)方法測定上述制得的熱穩(wěn)定卡拉膠酶活性。具體操作如下：

分別取1mL滅活的與沒滅活的熱穩(wěn)定卡拉膠酶酶液和2mL底物溶液(含有0.2wt％的κ-卡拉膠)于60℃溫度恒溫水浴反應30min，取1mL反應產(chǎn)物加入到1.5mL DNS溶液中，沸水浴5min。而后迅速冷卻至室溫，加蒸餾水至25mL，混勻在520nm波長下測OD值。測得的熱穩(wěn)定卡拉膠酶活性為800U/ml。

另外，將上述制得的熱穩(wěn)定卡拉膠酶酶液直接滴于固體平板培養(yǎng)基上，用碘液染色后可以看到明顯的透明圈(圖2)，表明熱穩(wěn)定卡拉膠酶是具有卡拉膠降解活性的，為后續(xù)的研究和應用提供了良好材料。

為測定熱穩(wěn)定卡拉膠酶的耐熱性，分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃進行酶促反應30min，DNS法測定熱穩(wěn)定卡拉膠酶的酶活。以酶活最高值為100％計算其相對酶活力。

經(jīng)測定，熱穩(wěn)定卡拉膠酶最適反應溫度為60℃(如圖3)，在溫度為80℃的條件下，該酶仍具有50％左右的酶活，較現(xiàn)有卡拉膠酶具有明顯的高溫耐受性特性。

實施例4：酶解產(chǎn)物組成分析

稱別一定量的熱穩(wěn)定卡拉膠酶酶液和含有0.2wt％的卡拉膠的底物于60℃溫度恒溫水浴反應，并分別于30min、60min、90min、120min、150min、180min、240min、360min、720min和1440min取一定反應產(chǎn)物，離心濃縮，采用TLC層析技術分析反應不同時間后酶解產(chǎn)物的組成(圖4)。其中海藻寡糖的檢測方法的步驟如下：

A、毛細管點樣用鉛筆在距硅膠板底端2cm處輕輕劃一條直線，為方便點樣，在點樣前在直線上每隔2cm處做一個標記。用0.5mm玻璃點樣毛細管分別將卡拉膠寡糖標準品和卡拉膠寡糖樣品點樣于硅膠板直線上的標記處，在用毛細管點樣時，毛細管應垂直于硅膠板的方向點樣，而且毛細管接觸硅膠板的時間應盡量短，不然點樣斑點直徑難以控制，點樣斑點直徑要控制2mm，讓點樣點自然干燥。

B、層析缸展層將已點好樣的硅膠板底端(點樣端)放入已盛有展層劑的層析缸中，層析板一定要放平，展層劑液面不得超過點樣點，層析時層析缸封閉，自下而上展層，當展層前沿達距薄板頂端1厘米處時，取出硅膠板，于60℃烘箱中烘干。

C、顯色劑顯色將顯色劑均勻的噴涂在烘干好的層析硅膠板上，置于60℃烘箱內(nèi)加熱，直至顯出層析斑點。

由圖4可見，該酶在60℃的溫度下，與卡拉膠底物經(jīng)過不同時間(15min-1440min)的反應，可以直接將卡拉膠降解為卡拉二糖，不產(chǎn)生任何中間產(chǎn)物，因而可以高效地制備高純度的卡拉二糖。

SEQUENCE LISTING

<110> 國家海洋局第一海洋研究所

<120> 一種具有熱穩(wěn)定性和降解卡拉膠活力的酶

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 374

<212> PRT

<213> 1

<400> 1

Met Ala Phe Ile Asn Ile Lys Pro Glu Leu Lys Gln Asn Met Glu Arg

1 5 10 15

Leu Ser Asp Ile Leu Asn Ile Pro Glu Pro Leu Leu Ile Ser Ala Asn

20 25 30

Ala Asn Ala Ser Ala Asp Glu Leu Tyr Phe Pro Gly Val Ser Phe His

35 40 45

Ala Gly Lys Asn Val Gln Ala Ala Glu Thr Tyr Glu Gln Leu Gln Leu

50 55 60

Leu Ala Asn Gln Tyr Thr Phe Glu Asp Glu Gln Trp Leu Thr Lys Thr

65 70 75 80

Ala Val Tyr Asp Ser Ala Glu Leu Lys Lys Glu Ile Gly Arg Leu Thr

85 90 95

Glu Cys Phe Pro Phe Val Thr Ser Arg Ile Ile Gly Arg Ser Ser Met

100 105 110

Gly Gln Pro Ile Tyr Glu Leu Leu Leu Gly Ala Glu Asn Ala Gly Lys

115 120 125

Arg Thr His Met Asn Ala Ser Phe His Ala Asn Glu Trp Ile Thr Thr

130 135 140

Ser Val Leu Met Lys Trp Leu Lys Glu Tyr Cys Tyr His Leu Cys Thr

145 150 155 160

Gly Gln Thr Ala Leu Gly Phe Ser Pro Leu Asp Ile Phe Ser Ser Thr

165 170 175

Lys Leu Ser Val Val Pro Ile Val Asn Pro Asp Gly Val Asp Leu Val

180 185 190

Leu Asn Gly Pro Gly His Leu Gly Ile Ala Arg Glu Ala Leu Asp Glu

195 200 205

Met Asn Glu His Gln Pro Asp Phe Arg Glu Trp Lys Ala Asn Ile Asn

210 215 220

Gly Val Asp Leu Asn Asn Gln Phe Pro Ser Phe Trp Glu Ile Glu Lys

225 230 235 240

Gln Arg Lys Pro Pro Lys Ser Pro Ser Tyr Arg Asp Tyr Pro Gly Asp

245 250 255

Glu Pro Leu Thr Glu Pro Glu Ala Ala Ala Met Arg Asp Leu Ile Ala

260 265 270

Asn Glu Pro Pro Asp Arg Leu Val Ala Leu His Thr Gln Gly Glu Glu

275 280 285

Ile Tyr Trp Gly Tyr Lys Gly Leu Glu Pro Pro Glu Ser Ala Asp Val

290 295 300

Ile Gln Thr Phe Glu Arg Leu Ser Gly Tyr Lys Gly Val Arg Tyr Ile

305 310 315 320

Asp Ser Tyr Ala Gly Phe Arg Asp Trp Phe Ile His Tyr Tyr Gly Arg

325 330 335

Glu Gly Tyr Thr Val Glu Leu Gly Lys Gly Lys Asn Pro Leu Pro Leu

340 345 350

Lys Gln Phe Asp Asp Ile Tyr Cys Lys Ser Arg Gly Ile Leu Trp Ala

355 360 365

Ser Cys Phe Phe Glu Ser

370

<210> 2

<211> 1125

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

atggcattca tcaacatcaa accggagtta aagcagaata tggaaagact gtctgacatt 60

ctgaacatac ccgaaccgct tttaatcagt gcaaatgcaa atgcatccgc ggacgaactt 120

tattttccgg gagtatcttt tcatgcagga aaaaacgttc aagcagcaga aacatatgaa 180

cagctgcaat tattggcgaa tcaatacacg tttgaagatg aacagtggct gacaaaaaca 240

gccgtttacg attcagcaga actgaaaaag gaaattggca gattgacgga atgctttccg 300

tttgttactt cccgtatcat cggccgctca agcatgggcc agcctatata tgaactgctc 360

cttggagctg aaaatgccgg aaaaagaacg catatgaatg cctcttttca tgccaatgaa 420

tggatcacca cttctgtttt gatgaaatgg ctcaaagaat actgttatca tttatgtaca 480

ggccagaccg ctttaggttt ttcaccgctc gatatttttt catcaacaaa gctttccgtc 540

gtgccgatcg ttaatcccga cggtgttgac cttgtactta acggccccgg tcatcttggg 600

atcgcgagag aagcgctgga tgagatgaac gagcatcagc cggatttccg ggaatggaaa 660

gccaatataa acggagtgga tttaaataat cagtttccgt ctttctggga gatcgaaaaa 720

caaagaaaac cgcctaaatc cccttcctac agagactacc ccggagatga accgctgaca 780

gaaccggaag cggcagcgat gagggattta atcgcaaacg agccgcctga ccggcttgtg 840

gcgcttcaca cacaggggga ggaaatttat tggggataca agggattgga gcctcctgaa 900

tcagctgatg tgatccaaac atttgagcgc ctgagcggtt ataagggcgt cagatatata 960

gacagctatg caggatttag agattggttt attcattatt acggaagaga aggatatact 1020

gttgaacttg gcaaaggaaa aaatccttta ccgctgaaac aatttgacga tatatattgt 1080

aaaagcagag gaatactttg ggcatcctgt ttttttgaaa gctga 1125