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一種獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法與流程

文檔序號:11126309閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于,包括以下步驟:

步驟一、將細菌ITS通用引物對獼猴桃潰瘍病菌標準菌株和其它獼猴桃潰瘍病病原菌的16S~23SrDNA間的ITS區域進行PCR擴增并測序,并得到測序后的序列;

步驟二、用生物學軟件clastal X對測序后的序列及GenBank數據庫中已登錄的丁香假單胞桿菌屬ITS序列進行多重同源性比較分析,并找出獼猴桃潰瘍病菌穩定性點突變區;

步驟三、根據獼猴桃潰瘍病菌穩定性點突變區,應用引物和探針設計軟件Prmier Express設計獼猴桃潰瘍病菌特異引物和獼猴桃潰瘍病菌特異探針;

步驟四、對獼猴桃潰瘍病菌特異引物和獼猴桃潰瘍病菌特異探針進行可用性檢測、特異性檢測、以菌液為模板的靈敏度檢測、以DNA為模板的靈敏度檢測、以接種獼猴桃潰瘍病菌的獼猴桃枝條為對象的熒光PCR檢測和以田間發病樣品為對象的熒光PCR檢測;

步驟五、重復步驟三和步驟四直至獲得用于對獼猴桃細菌性潰瘍病菌檢測的實時熒光PCR引物和實時熒光PCR探針。

2.根據權利要求1所述的獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于:所述步驟四中可用性檢測為以獼猴桃潰瘍病菌標準菌株的染色體DNA為模板進行實時定量熒光PCR的檢測。

3.根據權利要求1所述的獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于:所述步驟四中特異性檢測為選取獼猴桃潰瘍病菌不同菌株及其近似亞種、近似種、近似屬的菌株進行熒光PCR反應的檢測。

4.根據權利要求1所述的獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于,所述步驟四中以菌液為模板的靈敏度檢測步驟為:

將獼猴桃潰瘍病菌標準菌株作為陽性,在NB液體培養基中26℃振蕩培養12h;

將培養好的菌液進行10×濃度梯度稀釋,通過平板計數法計算菌液原始濃度;

以連續稀釋的不同濃度梯度菌液為模板進行熒光PCR檢測。

5.根據權利要求1所述的獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于,所述步驟四中以DNA為模板的靈敏度檢測步驟為:

將獼猴桃潰瘍病菌標準菌株作為陽性,在NA液體培養基中26℃振蕩培養12h;

提取培養好的獼猴桃潰瘍病菌菌液的總DNA,通過ND-2000超微量分光光度計測定DNA的濃度,將培養好的菌液進行10×濃度梯度稀釋;

以DNA各濃度梯度為模板進行熒光PCR檢測。

6.根據權利要求1所述的獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于,所述步驟四中以接種獼猴桃潰瘍病菌的獼猴桃枝條為對象的熒光PCR檢測步驟為:

將獼猴桃潰瘍病菌在NA液體培養基中26℃振蕩培養12h;

通過注射器針刺將培養好的獼猴桃潰瘍病菌菌液接種至健康獼猴桃植株的莖桿上;

通過蘸有無菌水的棉花對接種后的獼猴桃植株進行保濕,觀察獼猴桃發病情況;

在接種獼猴桃植株發病后,提取發病植株有癥狀部位及無癥狀部位的總DNA;

以獼猴桃潰瘍病菌標準菌株為陽性對照,進行熒光PCR檢測。

7.根據權利要求1所述的獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法,其特征在于,所述步驟四中以田間發病樣品為對象的熒光PCR檢測步驟為:

采集田間發病獼猴桃樣品,提取其病健交界處的總DNA;

以獼猴桃潰瘍病菌標準菌株作陽性對照,健康的獼猴桃樣品作陰性對照,進行實時熒光PCR檢測。

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