本發(fā)明涉及一種茯苓多糖硫酸酯的制備方法。

背景技術(shù)：

茯苓是我國傳統(tǒng)的用于利尿和鎮(zhèn)定的中藥，茯苓多糖是茯苓的主要有效成分，占干燥菌核90％以上，開發(fā)利用茯苓多糖資源有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。茯苓多糖為帶有少量β-1，6分支的β-1，3葡聚糖，主鏈每50個(gè)葡萄糖殘基單位中有1個(gè)β-1，6結(jié)合的葡萄糖糖苷支鏈和1～2個(gè)β-1，6葡萄糖糖苷間隔。眾多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)食藥用菌多糖通過作用于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，在治療腫瘤、心血管疾病、肝炎、糖尿病、甚至愛滋病方面顯示出特殊的療效，其中β-D-(1-3-1-6)葡聚糖顯示出更顯著的調(diào)理作用，但和茯苓多糖一樣，很多葡聚糖的水溶性很差，只有對(duì)這些多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，增加其水溶性，才可以更好地利用它們。將天然多糖進(jìn)行硫酸酯化修飾也是多糖結(jié)構(gòu)改造的一個(gè)研究熱點(diǎn)，多糖硫酸化后可以增強(qiáng)原有的生物活性或產(chǎn)生新的功能。多糖硫酸化方法主要有濃硫酸法、三氧化硫、吡啶法和氯磺酸，吡啶法(woLFRoM&SHEN法)等，其中氯磺酸，吡啶法因磺化效率高、成本低而得到廣泛使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出一種茯苓多糖硫酸酯的制備方法。

一種茯苓多糖硫酸酯的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）稱取100g茯苓粉，分3次溶于總共為10倍體積的0.5mol/LNaoH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6～7，4℃冰箱中沉淀過夜，在4℃環(huán)境中、5000g離心20min，收集沉淀，去離子水洗滌沉淀3次，用無水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌3次，于70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用；

（2）將附有冷凝管和攪拌裝置的容量瓶置冰浴中，加入吡啶100mL，磁力攪拌器攪拌，使之充分冷卻，用分液漏斗按10：1體積比慢慢加入氯磺酸10mL；

（3）加人6g待硫酸化干燥的多糖樣品，迅速將容量瓶移入沸水浴中，電動(dòng)攪拌器100℃恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h；

（4）反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾回收吡啶50mL；

（5）然后加人100mL水，用2．5mol/LNaoH中和至pH7～8，再加入3倍體積無水乙醇沉淀；

（6）沉淀重新溶于100mL水中；

（7）于透析袋中對(duì)自來水透析，再對(duì)蒸餾水透析；

（8）用0．5mol/LNaoH中和稍微變酸的透析液，保證最終硫酸化產(chǎn)物為鈉鹽；在45℃減壓濃縮后冷凍干燥后即得。

優(yōu)選地，所述步驟（2）氯磺酸的加入速度<0.3mL/min。

優(yōu)選地，所述多糖樣品中，氯磺酸/單糖殘基的摩爾比為4：1。

優(yōu)選地，所述步驟（7）的自來水透析的溫度為20℃，時(shí)間為2d。

優(yōu)選地，所述步驟（7）的蒸餾水透析的溫度為20℃，時(shí)間為1d。

本發(fā)明所述方法制備的茯苓多糖硫酸酯磺化效率高，分子量小，生產(chǎn)成本低、環(huán)境污染小。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1。

一種茯苓多糖硫酸酯的制備方法，包括以下步驟：

（1）稱取100g茯苓粉，分3次溶于總共為10倍體積的0.5mol/LNaoH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6～7，4℃冰箱中沉淀過夜，在4℃環(huán)境中、5000g離心20min，收集沉淀，去離子水洗滌沉淀3次，用無水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌3次，于70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用；

（2）將附有冷凝管和攪拌裝置的容量瓶置冰浴中，加入吡啶100mL，磁力攪拌器攪拌，使之充分冷卻，用分液漏斗按10：1體積比慢慢加入氯磺酸10mL；

（3）加人6g待硫酸化干燥的多糖樣品，迅速將容量瓶移入沸水浴中，電動(dòng)攪拌器100℃恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h；

（4）反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾回收吡啶50mL；

（5）然后加人100mL水，用2．5mol/LNaoH中和至pH7～8，再加入3倍體積無水乙醇沉淀；

（6）沉淀重新溶于100mL水中；

（7）于透析袋中對(duì)自來水透析，再對(duì)蒸餾水透析；

（8）用0．5mol/LNaoH中和稍微變酸的透析液，保證最終硫酸化產(chǎn)物為鈉鹽；在45℃減壓濃縮后冷凍干燥后即得。

實(shí)施例2。

一種茯苓多糖硫酸酯的制備方法，包括以下步驟：

（1）稱取100g茯苓粉，分3次溶于總共為10倍體積的0.5mol/LNaoH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6～7，4℃冰箱中沉淀過夜，在4℃環(huán)境中、5000g離心20min，收集沉淀，去離子水洗滌沉淀3次，用無水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌3次，于70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用；

（2）將附有冷凝管和攪拌裝置的容量瓶置冰浴中，加入吡啶100mL，磁力攪拌器攪拌，使之充分冷卻，用分液漏斗按10：1體積比慢慢加入氯磺酸10mL；

（3）加人6g待硫酸化干燥的多糖樣品，迅速將容量瓶移入沸水浴中，電動(dòng)攪拌器100℃恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h；

（4）反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾回收吡啶50mL；

（5）然后加人100mL水，用2．5mol/LNaoH中和至pH7～8，再加入3倍體積無水乙醇沉淀；

（6）沉淀重新溶于100mL水中；

（7）于透析袋中對(duì)自來水透析，再對(duì)蒸餾水透析；

（8）用0．5mol/LNaoH中和稍微變酸的透析液，保證最終硫酸化產(chǎn)物為鈉鹽；在45℃減壓濃縮后冷凍干燥后即得；

（9）所述步驟（2）氯磺酸的加入速度<0.3mL/min。

實(shí)施例3。

一種茯苓多糖硫酸酯的制備方法，于包括以下步驟：

（1）稱取100g茯苓粉，分3次溶于總共為10倍體積的0.5mol/LNaoH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6～7，4℃冰箱中沉淀過夜，在4℃環(huán)境中、5000g離心20min，收集沉淀，去離子水洗滌沉淀3次，用無水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌3次，于70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用；

（2）將附有冷凝管和攪拌裝置的容量瓶置冰浴中，加入吡啶100mL，磁力攪拌器攪拌，使之充分冷卻，用分液漏斗按10：1體積比慢慢加入氯磺酸10mL；

（3）加人6g待硫酸化干燥的多糖樣品，迅速將容量瓶移入沸水浴中，電動(dòng)攪拌器100℃恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h；

（4）反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾回收吡啶50mL；

（5）然后加人100mL水，用2．5mol/LNaoH中和至pH7～8，再加入3倍體積無水乙醇沉淀；

（6）沉淀重新溶于100mL水中；

（7）于透析袋中對(duì)自來水透析，再對(duì)蒸餾水透析；

（8）用0．5mol/LNaoH中和稍微變酸的透析液，保證最終硫酸化產(chǎn)物為鈉鹽；在45℃減壓濃縮后冷凍干燥后即得；

（9）所述步驟（2）氯磺酸的加入速度<0.3mL/min；

（10）所述多糖樣品中，氯磺酸/單糖殘基的摩爾比為4：1。

實(shí)施例4。

一種茯苓多糖硫酸酯的制備方法，包括以下步驟：

（1）稱取100g茯苓粉，分3次溶于總共為10倍體積的0.5mol/LNaoH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6～7，4℃冰箱中沉淀過夜，在4℃環(huán)境中、5000g離心20min，收集沉淀，去離子水洗滌沉淀3次，用無水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌3次，于70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用；

（2）將附有冷凝管和攪拌裝置的容量瓶置冰浴中，加入吡啶100mL，磁力攪拌器攪拌，使之充分冷卻，用分液漏斗按10：1體積比慢慢加入氯磺酸10mL；

（3）加人6g待硫酸化干燥的多糖樣品，迅速將容量瓶移入沸水浴中，電動(dòng)攪拌器100℃恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h；

（4）反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾回收吡啶50mL；

（5）然后加人100mL水，用2．5mol/LNaoH中和至pH7～8，再加入3倍體積無水乙醇沉淀；

（6）沉淀重新溶于100mL水中；

（7）于透析袋中對(duì)自來水透析，再對(duì)蒸餾水透析；

（8）用0．5mol/LNaoH中和稍微變酸的透析液，保證最終硫酸化產(chǎn)物為鈉鹽；在45℃減壓濃縮后冷凍干燥后即得；

（9）所述步驟（2）氯磺酸的加入速度<0.3mL/min；

（10）所述多糖樣品中，氯磺酸/單糖殘基的摩爾比為4：1；

（11）所述步驟（7）的自來水透析的溫度為20℃，時(shí)間為2d。

實(shí)施例5。

一種茯苓多糖硫酸酯的制備方法，包括以下步驟：

（1）稱取100g茯苓粉，分3次溶于總共為10倍體積的0.5mol/LNaoH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6～7，4℃冰箱中沉淀過夜，在4℃環(huán)境中、5000g離心20min，收集沉淀，去離子水洗滌沉淀3次，用無水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌3次，于70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用；

（2）將附有冷凝管和攪拌裝置的容量瓶置冰浴中，加入吡啶100mL，磁力攪拌器攪拌，使之充分冷卻，用分液漏斗按10：1體積比慢慢加入氯磺酸10mL；

（3）加人6g待硫酸化干燥的多糖樣品，迅速將容量瓶移入沸水浴中，電動(dòng)攪拌器100℃恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h；

（4）反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾回收吡啶50mL；

（5）然后加人100mL水，用2．5mol/LNaoH中和至pH7～8，再加入3倍體積無水乙醇沉淀；

（6）沉淀重新溶于100mL水中；

（7）于透析袋中對(duì)自來水透析，再對(duì)蒸餾水透析；

（8）用0．5mol/LNaoH中和稍微變酸的透析液，保證最終硫酸化產(chǎn)物為鈉鹽；在45℃減壓濃縮后冷凍干燥后即得；

（9）所述步驟（2）氯磺酸的加入速度<0.3mL/min；

（10）所述多糖樣品中，氯磺酸/單糖殘基的摩爾比為4：1；

（11）所述步驟（7）的自來水透析的溫度為20℃，時(shí)間為2d；

所述步驟（7）的蒸餾水透析的溫度為20℃，時(shí)間為1d。