本發明屬于中醫藥領域，具體是石仙桃多糖的制備及其在制備保肝藥物中的應用。

背景技術：

肝臟是腹腔內最大的實質性器官，擔負人體的重要生理功能。目前肝臟疾病成為威脅人類健康的常見疾病之一。肝損傷是肝臟疾病共有的病理狀態，其治療直接影響肝病治療預后。近年來肝損傷治療備受關注，特別是中藥治療研究取得了很大進展。很多中藥具有明顯的保肝護肝作用，無論是中藥化學成分還是中藥復方都是通過調節免疫、提高抗氧化能力、降低組織細胞中自由基等，維護肝細胞膜完整，減緩肝細胞凋亡。從目前研究來看，清熱解毒、活血化瘀中藥多能保護肝組織、修復肝組織。其所含化學成分多糖、黃酮類化合物、苷類、生物堿等又各有不同的作用。中藥多糖成分尤其能調節免疫功能，黃酮類化合物和苷類成分主要能抗氧化，清除自由基等。總之，能保肝護肝的中藥成分都具有維持細胞膜完整，減緩肝細胞凋亡的作用，對CCl₄ 所致肝損傷都有一定的保護作用。

中藥石仙桃為蘭科石仙桃屬植物石仙桃Pholidota chinensis Lindl.，以假鱗莖或全草入藥，全年可采，鮮用或開水燙后曬干備用。分布于廣布于華東、華南和西南大部分地區。具有養陰潤肺，清熱解毒，利濕，消瘀之功效。常用于肺熱咳嗽，咳血，吐血，眩暈，頭痛，夢遺，咽喉腫痛，風濕疼痛，濕熱浮腫，痢疾，白帶，疳積，瘰疬，跌打損傷。 至今，已公開的與石仙桃有關的文章有300多篇，但以中藥石仙桃提取物制備保肝藥物的藥物及其制備方法，則未見報道。

技術實現要素：

本發明的目的是提供中藥石仙桃多糖在制備保肝藥物中的應用及其制備方法，以及對該藥物進行抗肝纖維化動物實驗的方法和結果。

實現本發明目的的技術方案是：

一、石仙桃多糖的制備方法：

將新鮮采集的石仙桃以其假鱗莖或全草陰干粉碎，得到石仙桃粗粉，按1:10的料液比加入水，沸水提取2次，每次1.5 h，合并提取液進行濃縮，用氯仿與正丁醇的比例4:1，采用Sevag法多次萃取，得到除去蛋白質的上清液，加95%乙醇使醇含量達到80%，將其置于4℃冰箱中醇沉 12 h，抽濾，濾渣依次用乙醚、丙酮、無水乙醇洗滌，即得石仙桃粗多糖；將石仙桃粗多糖溶于水中，加樣到經pH =7.5的磷酸鹽緩沖液前處理的 DE52 型樹脂層析柱中，靜止過夜，用流速為1.2 ml/min的蒸餾水洗脫，合并洗脫液，冷凍干燥得到石仙桃多糖。

二、石仙桃多糖的制備方法制得的石仙桃多糖。

三、石仙桃多糖用于制備保肝的藥物。

四、石仙桃多糖制備保肝的藥物，以石仙桃多糖為有效成分，余量為藥劑成型輔料。可制備成供口服的中藥制劑，如片劑、口服液、顆粒劑等，其制法與現有的相應劑型的制法通用。

五、石仙桃多糖在制備保肝藥物的藥效學實驗方法及結果。

石仙桃藥材資源豐富，制備石仙桃多糖工藝簡單、成本低，具有良好的開發價值。此外，本發明發掘了石仙桃多糖具有保肝護肝作用，制備保肝藥物或保健品具有良好的藥用價值，并為石仙桃多糖進一步深入開發提供研究基礎。

附圖說明

圖1. 對肝組織病理形態學的影響(HE, ×200)；

A：正常對照；B：模型對照；C：石仙桃多糖（500 mg/kg）；D：石仙桃多糖（300 mg/kg）；E：石仙桃多糖（100 mg/kg）；F：聯苯雙酯（120 mg/kg）。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明的內容作進一步的說明，但并不是對本發明的限定。

石仙桃多糖在制備保肝藥物的藥效學實驗方法及結果：

1 材料與方法

1.1 供試藥品的制備 石仙桃為蘭科石仙桃屬植物石仙桃Pholidota chinensis Lindl.，以假鱗莖或全草入藥，采自廣西藥用植物園。稱取干燥的石仙桃1500 g，加入15000 ml水，沸水提取2次，每次1.5 h，合并提取液，濃縮至220 ml，用（Sevag法）氯仿-正丁醇（4:1）多次萃取，得到除去蛋白質的上清液，加95%乙醇使醇含量達到80%，將其置于4℃冰箱中醇沉 12 h。抽濾，濾渣依次用乙醚、丙酮、無水乙醇洗滌，即得石仙桃粗多糖。將石仙桃粗多糖溶于水中，加樣到經pH =7.5的磷酸鹽緩沖液前處理的 DE52 型樹脂層析柱中，靜止過夜，用流速為1.2 ml/min的蒸餾水洗脫，合并洗脫液，冷凍干燥得到石仙桃多糖。采用DE52型樹脂層析柱，上樣量0.3 g，上樣體積40 ml，先以蒸餾水進行洗脫，然后用0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/ml NaCl 溶液梯度洗脫。洗脫液用苯酚- 硫酸試劑顯色后，在λ= 488 nm處測其吸光度。按吸光度和洗脫液體積作圖，按峰面積計算，測得其純度≥87.36%。

1.2 動物 昆明種SPF級小鼠60只，體重19-22 g，雌雄各半，由桂林醫學院SPF實驗動物中心提供（許可證號：SCXK2007-0001）。

1.3 試劑 丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；TNF-α，IL-6及IL-1β試劑盒購于Elabscience公司；NF-κB購于英國Abcam公司；四氯化碳（CC1₄）購于廣東汕頭市西隴化工廠，批號：0710262；聯苯雙酯滴丸購于浙江萬邦藥業有限公司，批號：A02140101。

1.4 儀器 TGL-16K臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機廠；AU600全自動生化檢測儀，奧林巴斯生產；0lymPus BX51顯微鏡，奧林巴斯生產；BS1105電子天平，德國sartorius公司。恒溫水浴鍋XMTD-6000，上海長風儀器廠；THZ-C-1 臺式冷凍恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠；eppendorf移液器，德國eppendorf股份公司；Epoch酶標儀，美國 Bio-tek。

1.5 方法^[7] 60只小鼠隨機分為正常對照組、模型組、聯苯雙酯組（120 mg/kg）和石仙桃多糖組（500 mg/kg，300 mg/kg，100 mg/kg），每組10只。除正常對照組及模型組外，各治療組按20 ml/kg劑量灌胃給藥，每天按時1次，共7天。末次給藥后，除正常對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射0.12% CC1₄花生油（10 ml/kg）。禁食不禁水24 h，眼球取血，離心分離（4000 rpm ,10 min），取血清。采血后，迅速解剖，在同一位置取肝組織，部分肝組織置于-80℃冰箱保存，用于肝組織指標檢測，剩余肝組織固定于4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋、切片、HE染色，觀察肝組織病理學變化；生化法測定血清中ALT、AST、MDA、SOD及GSH-Px的活性或含量；酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和NO含量。

2.1 對血清中ALT、AST和肝組織中NO含量的影響 與正常組相比，模型組血清中ALT、AST和肝組織中NO含量顯著升高。與模型組相比，聯苯雙酯組和石仙桃多糖劑量組血清中ALT、AST含量呈現不同程度降低，肝組織中NO含量顯著降低，見表1。

表1對小鼠血清中ALT、AST和肝組織中NO含量的影響（±s,n=10）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 對血清中SOD、GSH-Px及MDA活性或含量的影響 與正常組相比，模型組血清中SOD、GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著升高。與模型組相比，聯苯雙酯組及石仙桃多糖劑量組血清中SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低，見表2。

表2 對血清中SOD、GSH-Px及MDA活性或含量的影響（ ± s, n = 10）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 對肝組織中IL-1β、IL-6及TNF-α表達水平的影響 與正常組相比，模型組肝組織中IL-1β、IL-6及TNF-α表達水平顯著升高。與模型組相比，聯苯雙酯組及石仙桃多糖劑量肝組織中IL-1β、IL-6及TNF-α表達水平不同程度下降，見表3。

表3對肝組織中IL-1β、IL-6及TNF-α表達水平的影響（ ± s, n = 10）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 對肝組織病理形態學的影響 從肝臟的整體形態可見，正常組小鼠肝臟色澤紅潤，富有彈性，且表面光滑細膩。而CC1₄致小鼠肝損傷模型組小鼠肝臟表面泛黃粗糙，肝臟體積有所增大，表面呈現大量顆粒狀。石仙桃多糖劑量組小鼠肝臟表面稍顯粗糙，但無明顯泛黃，體積略有增大較模型組小，損傷明顯減輕。在高倍顯微鏡下觀察：正常組小鼠肝臟肝小葉結構清晰，結構紋理完整，肝細胞以中央靜脈為中心呈現放射狀排列，大小均勻，無壞死、變性等病理變化，未見炎癥細胞浸潤等。CC1₄致小鼠肝損傷模型組的肝臟肝小葉結構被嚴重破壞，肝細胞嚴重壞死，可見炎細胞浸潤。石仙桃多糖劑量組小鼠肝臟肝小葉結構較完整，肝細胞壞死程度明顯減輕，炎癥細胞明顯減少，肝組織炎癥得到顯著改善，結果見圖1。

綜上所述，本發明首次對石仙桃多糖在制備保肝藥物進行了抗肝損傷的研究，通過動力實驗表明，仙桃多糖具有較好的保護肝損傷的藥理作用，作用機制可能與仙桃多糖通過降低相關炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α的水平表達從而逆轉肝損傷密切相關。可用于制備片劑、口服液、顆粒劑等劑型的治療肝損傷的中藥制劑。