本發明屬于生物醫學
技術領域：
，涉及一類檢測試劑及其制備方法和應用，具體為硝基還原酶的特異性熒光探針及其制備方法和用于腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤缺氧程度的應用。
背景技術：
：細胞的生長和增殖有賴于充分的氧氣和能量供應，在供氧量正常的組織中，細胞的能量來源約90％依賴于線粒體的有氧氧化。然而，腫瘤組織內，腫瘤細胞失控性生長和增殖消耗大量的營養和氧氣，其內部不能及時、有效的建立新生血管網，或新生血管網的結構和功能異常，存在暫時性封閉或“盲端”；并且通透性較高，液體外滲至組織間隙導致血流黏滯阻力增加。這些因素使腫瘤內部血流減少，氧的供應遠少于氧的需求，腫瘤細胞處于缺氧狀態。此外，惡性腫瘤的自身進程以及抗腫瘤治療所造成的貧血亦加劇了腫瘤的缺氧，腫瘤內部缺氧微環境由此產生。硝基還原酶家族屬黃素酶，可以在輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸存在下代謝芳香族硝基化合物或者硝基取代的雜環化合物。研究表明缺氧組織或細胞以及腫瘤中硝基還原酶的含量相對正常狀態呈現升高趨勢。在缺氧條件下以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH作為電子供體細胞內的硝基還原酶可催化多種外源硝基芳香族化合物發生單電子轉移，生成硝基陰離子自由基，隨后進一步被還原成羥胺或氨基。研究發現，硝基還原酶通常存在于細菌中，如大腸桿菌，在人的正常細胞中幾乎不存在，而在惡性腫瘤中大量存在。因此，硝基還原酶可以作為腫瘤的生物標記物。小分子熒光探針被廣泛的應用于化學分析，生物分析以及生物動態過程實時、非侵入性監測。因此，小分子熒光探針被廣泛用于藥物篩選和治療效果的評估，實現了腫瘤治療效果的早期監測。RGD(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)氨基酸序列是多種生物細胞外基質和血漿蛋白結構中常見的基本成分，也是纖維細胞黏附的主要位點。人的基因組可產生24個不同的已知的整合素，大約有1/3的整合素在不同程度上識別RGD序列。腫瘤新生血管內皮細胞膜表面表達高水平的αvβ3/α5β1和α5β1整合素，因此含有RGD序列的蛋白，作為整合素配體，能夠靶向性到達腫瘤局部新生血管內皮。外源性RGD多肽及其類似物可與體內含RGD序列的物質競爭結合，從而阻斷血管上皮細胞增殖的信使傳遞，終止細胞增殖，使血管不能生長，導致腫瘤組織供氧系統中斷，最終細胞萎縮、凋亡。研究發現RGD環狀多肽比線狀多肽有更高的受體結合特異性。基于上述原因，大量含RGD序列的線性或環狀多肽被作為αvβ3拮抗劑合成，部分已成功制成熒光探針。技術實現要素：針對上述問題，本發明的目的在于制備了一類硝基還原酶的特異性熒光探針及制備方法和應用。該探針本體和被硝基還原酶還原后的產物，熒光強度具有明顯的差別，且產物熒光可由熒光檢測器檢測，利用該探針反應可對多種生物體系中硝基還原酶的分布和反應效率進行評價。本發明第二個目的提供一種腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤轉移的試劑。本發明第三個目的提供所述硝基還原酶的特異性熒光探針在制備用于腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤轉移的試劑上的應用。本發明第四個目的提供提供一種監測腫瘤缺氧程度的試劑。本發明第五個目的提供所述硝基還原酶的特異性熒光探針在制備用于監測腫瘤缺氧程度的試劑上的應用。本發明的技術方案如下：硝基還原酶的特異性熒光探針，該探針由檢測基團sensor、熒光基團dye、腫瘤靶向基團target通過化學鍵連接而成；其結構為：結構I型sensor-dye或結構II型sensor-dye-target。進一步，所述檢測基團sensor結構為：所述熒光基團dye可以為熒光素類似物，其結構為：所述腫瘤靶向基團target的結構為：本發明所述硝基還原酶的特異性熒光探針，優選，所述結構I型sensor-dye的結構為下式FBN-1或FBN-2所示：所述結構II型sensor-dye-target的結構為下式FBN-3或FBN-4所示：本發明所述硝基還原酶的特異性熒光探針，本身沒有熒光，探針中的硝基被硝基還原酶特異性還原，還原后的熒光產物具有很高的熒光量子產率，可采用熒光檢測器實現底物熒光變化的快速、靈敏檢測。本發明所述硝基還原酶的特異性熒光探針，作為硝基還原酶的特異性底物，通過定量檢測單位時間內的底物消除率或其產物的生成率來定量測定不同生物體系中硝基還原酶的活性。本發明還提供所述硝基還原酶的特異性熒光探針的制備方法，該方法為：a)通過在堿性條件下用對硝基芐溴將熒光素(化合物(1))羥基烷基化制備得到硝基還原酶的特異性熒光探針FBN-1；b)通過還原FBN-1的酮羰基得到羥基后，再用對硝基芐溴將其烷基化得到硝基還原酶的特異性熒光探針FBN-2。c)FBN-3和FBN-4分別由FBN-1,FBN-2和RGD環肽縮合而成。本發明還提供一種腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤轉移的試劑，所述試劑含有上述硝基還原酶的特異性熒光探針。本發明還提供所述硝基還原酶的特異性熒光探針在制備用于腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤轉移的試劑上的應用。本發明還提供所述硝基還原酶的特異性熒光探針在制備用于腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤轉移的試劑上的應用，可作為手術導航的試劑。本發明還提供一種監測腫瘤缺氧程度的試劑，所述試劑含有上述硝基還原酶的特異性熒光探針。本發明還提供所述硝基還原酶的特異性熒光探針在制備用于監測腫瘤缺氧程度的試劑上的應用。發明詳述該探針由檢測團和熒光基團通過化學鍵連接而成，概述為結構I型，其可表示為sensor-dye。硝基還原酶的特異性熒光探針具體實例為：結構I型：dye-sensorI型探針作為硝基還原酶的特異性底物，本身由于硝基的強吸電子效應，導致d-PET效應而猝滅分子熒光，當其被硝基還原酶還原后，釋放出化合物(1)，熒光強度大大增強。通過定量檢測單位時間內還原產物的生成量來測定酶或細胞制備液等生物樣品及細胞中硝基還原酶的活性。識別機理如下：1)在PBS或Tris-HCl等常用緩沖液中，反應溫度為20℃至45℃之間，優選37℃為最優反應時間；孵育體系pH介于5.0～8.5之間，優選pH7.4為最優反應pH值；反應時間為5～30分鐘，優選反應時間為20min。2)通過測定單位時間熒光強度的增加倍數評價硝基還原酶的活性，可采用熒光檢測器實現產物及底物的快速靈敏檢測；熒光檢測條件為：激發波長490nm，在510～550nm進行熒光發射譜的檢測。本發明中的硝基還原酶的熒光探針具有以下特點：該特異性探針底物在生物體中僅和硝基還原酶發生還原反應，其他常見的生物體系基質及雜質例如：無機鹽、糖類、氨基酸、維生素、生物巰基物種、氧化物種不產生干擾。該探針的相對熒光量子效率達到熒光量子產率較高，且激發波長為490nm，該波長較常見，可用熒光光譜法檢測，測定限可達0.65ng/mL。該探針對生物體的毒性較低，可用于動物生物體中和細菌生長過程中產生硝基還原酶含量的檢測。本發明的又一目的，提供了一種手術導航的試劑和方法。該試劑可以由I型試劑連接腫瘤靶向基團(target)制備而成，可實時靶向熒光成像腫瘤細胞或組織，該試劑可概述為結構II型，其可表示為sensor-dye-target。實時靶向熒光成像腫瘤細胞或組織的試劑具體實例為：結構II型：target-dye-sensor上述熒光探針的制備方法如下：FBN-1的制備方法：FBN-2的制備方法：FBN-3的制備方法：FBN-4的制備方法：研究發現，缺氧是腫瘤的特征微環境，硝基還原酶在缺氧腫瘤中高表達，而沒有發現其存在于正常細胞和組織中。在生物體中，II型試劑既是硝基還原酶的特異性底物，又可以特異性靶向集聚到腫瘤組織。所以II型試劑可應用在外科腫瘤切除手術過程中，腫瘤邊界鑒別，殘余腫瘤組織識別和腫瘤轉移淋巴結的追蹤，為腫瘤外科手術的熒光導航系統提供了一種新的熒光導航試劑。該試劑注射入患有腫瘤疾病的活體后，機體手術視野雜特定波長光波照射下，腫瘤細胞或組織會發出一定波長的熒光，在成像系統下指導醫生進行外科手術，有效提高手術治療效果，降低腫瘤患者死亡率。本發明試劑做為外科手術熒光導航試劑在荷瘤小鼠內實施的技術方案如下：1)II型試劑可溶于含DMSO0％-5％的PBS溶液或生理鹽水溶液，配制成工作液，尾靜脈注射或局部注射至小鼠體內；2)II型試劑經血液循環，可特異性聚集靶向到腫瘤部位；3)II型試劑在非腫瘤組織區域無熒光信號或熒光信號強度較弱，在腫瘤組織部位熒光信號強度很強。4)利用活體熒光成像技術，根據熒光信號，精確成像腫瘤位置，為外科手術提供導航。本發明的再一個目的提供了一種靶向監測腫瘤細胞或組織缺氧程度的試劑。利用本發明的結構II型探針通過熒光成像技術檢測腫瘤缺氧區域的硝基還原酶含量可于評價和研究腫瘤缺氧區域的缺氧水平。缺氧是腫瘤的特征微環境，研究發現硝基還原酶的含量和腫瘤的缺氧程度呈正相關關系，所以II型試劑可用于監測腫瘤的缺氧程度。II型試劑作為硝基還原酶的特異性底物，在生物體中，通過靶向基團靶向到腫瘤組織，在缺氧程度不同的腫瘤中，硝基還原酶的濃度也不同，熒光探針的還原量也不同。通過定量檢測相同時間內還原產物的熒光強度來間接測定腫瘤細胞和組織的缺氧程度。分別以人肺癌細胞(A549)，人卵巢癌細胞(SKOV-3)和人肝癌細胞(HepG-2)作為腫瘤細胞模型，活體肝癌腫瘤荷瘤小鼠模型作為活體生物模型探究II型試劑檢測癌細胞缺氧程度的能力。在腫瘤細胞中的具體測定方法為：1)在四個共聚焦培養皿中接種細胞，過夜，使其貼壁；2)II型試劑預孵育細胞30min；3)分別把四皿細胞放入缺氧程度不同的環境中培養8h；4)熒光顯微鏡觀察四皿細胞的熒光強度強弱。在活體荷瘤小鼠中的具體測定方法為：1)II型試劑可溶于含DMSO0％-5％的PBS溶液或生理鹽水溶液，配制成工作液，尾靜脈注射小鼠體內；2)II型試劑經血液循環，可特異性聚集靶向到腫瘤部位；3)因腫瘤缺氧程度不同，腫瘤部位的熒光強度也不同，利用活體熒光成像技術檢測腫瘤位置的熒光強度；4)根據熒光強度的強弱和腫瘤缺氧程度的正相關關系，不同腫瘤的熒光強度的強弱間接表示其缺氧程度的大小。本發明有益技術效果：本發明提供了硝基還原酶的特異性熒光探針，該特異性探針可以被生物體系中的硝基還原酶還原，因此可用于檢測生物體內的硝基還原酶；該探針可特異性靶向到腫瘤組織，別硝基還原酶還原后，熒光增強，因此該探針可以用于腫瘤靶向熒光成像，又因為在不同缺氧程度中，硝基還原酶的表達量不同，該探針又可以用于檢測腫瘤缺氧程度。實驗發現，探針本身的熒光強度較弱，被硝基還原酶還原后，熒光顯著增強；在缺氧程度較高的環境中，探針被硝基還原酶時，熒光強度的增強倍數更高本發明基于腫瘤的缺氧性和硝基還原酶在缺氧腫瘤中的高表達，可在具有缺氧微環境，并高表達硝基還原酶的腫瘤中應用，結合熒光成像儀，可用于腫瘤靶向熒光成像，腫瘤缺氧程度監測和監測腫瘤轉移等應用。本發明中，檢測腫瘤靶向試劑識別腫瘤后熒光信號變化，操作簡單、對身體無害；該試劑在應用中實現了高靈敏度，高特異性，為醫學上研究腫瘤和臨床上監測、治療腫瘤轉移提供了有效的工具，因此在腫瘤靶向熒光成像，腫瘤缺氧程度監測和監測腫瘤轉移等具有良好的應用前景。附圖說明圖1為探針FBN-1的核磁1HNMR圖譜；圖2為探針FBN-1的核磁13CNMR圖譜；圖3為探針FBN-3的高效液相色譜(HPLC)和飛行時間質譜分析譜圖；圖4為探針FBN-1(5μM)與硝基還原酶反應前后的吸收光譜圖；圖5為探針FBN-1(5μM)與硝基還原酶反應前后的發射光譜圖；圖6為探針FBN-2(5μM)與硝基還原酶反應前后的吸收光譜圖；圖7為探針FBN-2(5μM)與硝基還原酶反應前后的發射光譜圖；圖8為探針FBN-1與硝基還原酶作用的動力學實驗。其中激發波長為490nm；探針的濃度：5μM。硝基還原酶濃度分別為0、0.01、0.02、0.04、0.07、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55μg/mL；圖9為探針FBN-2與硝基還原酶作用的動力學實驗。其中激發波長為490nm；探針的濃度：5μM。硝基還原酶濃度分別為0、0.01、0.03、0.06、0.10、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5μg/mL；圖10為探針FBN-1與各種干擾物種和硝基還原酶反應的熒光發射光譜；圖11為探針FBN-3在20％，15％，8％，0.1％氧氣條件下與人肺癌細胞，人卵巢癌細胞和人肝癌細胞共孵育8小時的熒光共聚焦圖；圖12為探針FBN-3在肝癌荷瘤小鼠模型中，對直徑6mm和14mm腫瘤的時間依賴熒光成像。具體實施方式為了更好地理解本發明，下面結合附圖和實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的內容不僅僅局限于下面的實施例。本發明所用試劑：本發明所用儀器：儀器廠家高效液相色譜儀GE,AKTA熒光光譜儀VarianCaryEclipse基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀ABSCIE,4800Plus活體成像儀PerkinElmer實施例1.FBN-1熒光探針的合成工藝為：稱取0.40mmol化合物(1)，0.60mmol化合物(2)，1.20mmol，K2CO3于50mL三口瓶中，加入12mLDMF溶解，Ar保護，40℃攪拌5小時。減壓蒸餾，除去溶劑，粗產物通過硅膠柱提純，得產物FBN-1.產率81.8％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.29(d,J＝8.7Hz,2H),8.03(s,1H),8.00(d,J＝7.9Hz,1H),7.64(d,J＝8.7Hz,2H),7.25(d,J＝7.9Hz,1H),7.03(d,J＝2.4Hz,1H),6.94(d,J＝8.9Hz,1H),6.88(d,J＝9.7Hz,1H),6.84(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝9.7,1.9Hz,1H),6.45(d,J＝1.8Hz,1H),5.30(s,2H),2.13(s,3H),1.65(s,9H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ185.76,165.13,162.63,158.59,154.41,147.95,147.89,142.77,136.58,136.54,133.30,131.53,130.56,130.18,129.30,129.22,127.76,127.22,124.05,118.50,114.48,113.83,106.13,101.61,81.71,69.29,28.20,19.61；FT-IR:ν[cm-1]3425,3045,2978,2922,1712,1643,1600,1513,1442,1347,1300,1260,1205,1165,1100,1030,905,850,764,725,600,495；實施例2.FBN-3熒光探針的合成工藝為：稱取0.20mmolRGD環肽，0.20mmolFBN-1，0.6mmolDIEA,0.6mmolEDC·HCl于50mL三口瓶中，加入25mLDMF溶解，Ar保護，室溫攪拌10小時。減壓蒸餾，除去溶劑，粗產物加入96％三氟乙酸，室溫攪拌3小時后，減壓蒸餾，除去溶劑，得黃色粘稠狀粗產物，高效液相色譜分離提純，通過硅膠柱提純，得產物FBN-1.產率50.1％。HPLC純度99％，MALDI-TOF(m/z):理論值1082.4134,實驗值[M+H]+1083.55。實施例3.探針FBN-1與硝基還原酶反應前后吸收光譜與熒光發射光譜變化稱取1.9mg試劑FBN-1，配成2ml的2mM二甲基亞砜母液。將2.5μl的上述母液滴加到一定量的含有500μM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的10mM磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入60μL的100μg/mL的硝基還原酶溶液，再用10mM的磷酸鹽緩沖溶液定容到1ml。37℃下反應25min后，測量其吸收光譜和熒光發射光譜。熒光發射光譜測定時激發波長為490nm；激發和發射的狹縫寬度為5nm；電壓500V。圖4和圖5結果表明，本發明中的試劑FBN-1具有以下特點：1)探針在溶液中呈淡黃色并且無熒光，吸收光譜在456nm和479nm處有兩個吸收帶，熒光光譜在515nm處有較弱的熒光。2)隨著硝基還原酶的加入，吸收光譜中原有吸收帶強度變弱，493nm處產生了一個新的吸收帶；該探針的熒光光譜在515nm處產生綠色熒光，且熒光強度增強了約11倍。實施例4.探針FBN-2與硝基還原酶反應前后吸收光譜與熒光發射光譜變化稱取2.8mg試劑FBN-1，配成2ml的2mM二甲基亞砜母液。將2.5μl的上述母液滴加到一定量的含有500μM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的10mM磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入60μL的100μg/mL的硝基還原酶溶液，再用10mM的磷酸鹽緩沖溶液定容到1ml。37℃下反應25min后，測量其吸收光譜和熒光發射光譜。熒光發射光譜測定時激發波長為490nm；激發和發射的狹縫寬度為5nm；電壓600V。圖6和圖7結果表明，本發明中的試劑FBN-1具有以下特點：1)探針在溶液中呈淡黃色并且無熒光，吸收光譜在460nm和485nm處有兩個吸收帶，熒光光譜幾乎無熒光熒光。2)隨著硝基還原酶的加入，吸收光譜中原有吸收帶強度變弱，497nm處產生了一個新的吸收帶；該探針的熒光光譜在515nm處產生綠色熒光，且熒光強度增強了約255倍。實施例5.FBN-1與不同濃度硝基還原酶反應的熒光光譜性質將2.5μL的上述母液滴加到一定量的含有500μMNADH的10mM磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入不同濃度的硝基還原酶溶液，再用10mM的磷酸鹽緩沖溶液定容到1ml。37℃下反應20min后，測量其吸收光譜和熒光發射光譜。熒光發射光譜測定時激發波長為490nm；激發和發射的狹縫寬度為5nm；電壓500V。圖8結果表明，本發明中的試劑FBN-1具有以下特點：1)探針在溶液中呈淡黃色并且無熒光，但隨著硝基還原酶的加入，該探針在515nm處產生綠色熒光；2)515nm處，綠色熒光強度隨硝基還原酶濃度的增加而增加；3)使用5μM的FBN-1時，熒光增強與硝基還原酶的濃度在0-100ng/mL范圍內呈線性關系。實施例6.FBN-2與不同濃度硝基還原酶反應的熒光光譜性質將2.5μL的上述母液滴加到一定量的含有500μMNADH的10mM磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入不同濃度的硝基還原酶溶液，再用10mM的磷酸鹽緩沖溶液定容到1ml。37℃下反應20min后，測量其吸收光譜和熒光發射光譜。熒光發射光譜測定時激發波長為490nm；激發和發射的狹縫寬度為5nm；電壓600V。圖9結果表明，本發明中的試劑FBN-1具有以下特點：1)探針在溶液中呈淡黃色并且無熒光，但隨著硝基還原酶的加入，該探針在515nm處產生綠色熒光；2)515nm處，綠色熒光強度隨硝基還原酶濃度的增加而增加；3)使用5μM的FBN-1時，熒光增強與硝基還原酶的濃度在0-150ng/mL范圍內呈線性關系。實施例7.試劑FBN-1與生物體中其他物種反應情況(選擇性研究)在5μM的探針FBN-1溶液中分別加入各種物質：氯化鈣(2.5mM)，氯化鈉(2.5mM)，氯化鉀(50mM)葡萄糖(10mM)，維生素C(1mM)，維生素B6(1mM)，人血清白蛋白(100μM)，雙氧水(10μM)，羥基自由基(10μM)，谷氨酸(1mM)，精氨酸(1mM)，酪氨酸(1mM),谷氨酸(1mM)，絲氨酸(1mM)，半胱氨酸(1mM)，二硫蘇糖醇(1mM)，谷胱甘肽還原酶(5mM)，牛血清蛋白(100mg/mL,超氧化鉀(1mM)，雙氧水(1mM)次氯酸鈉(1mM)和硝基還原酶(0.6μg/mL)。在37℃下反應20min后，測量其熒光發射光譜。熒光發射光譜測定激發波長為490nm；激發和發射的狹縫寬度為5nm；電壓為500V。圖10結果表明，只有硝基還原酶可引起探針FBN-1產生明顯的光信號響應，證明該試劑對硝基還原酶具有高度的選擇性，而其他物種的存在不干擾硝基還原酶的測定。實施例8.FBN-3試劑對腫瘤細胞缺氧程度的檢測將密度為3×105個/mL的癌細胞接種到滅菌的鋪有蓋玻片的四個35mm培養皿中，在CO2培養箱(溫度為37℃，5％CO2)中培養過夜，待細胞貼壁后，10μMFBN-3預孵育30min，然后四皿細胞分別在四種條件(37℃，5％CO2，20％O2；37℃，5％CO2，15％O2；)中培養；37℃，5％CO2，8％O2；)中培養；37℃，5％CO2，0.1％O2；)中培養)中培養8小時，棄去細胞培養液，PBS緩沖液洗滌細胞5遍后，在熒光共聚焦顯微鏡下成像，比較四皿細胞的熒光強度，圖11結果表明在37℃，5％CO2，0.1％O2條件下培養的細胞熒光強度最強。實施例9通過定量檢測相同時間內還原產物的熒光強度來間接測定腫瘤細胞和組織的缺氧程度。分別以人肺癌細胞(A549)，人卵巢癌細胞(SKOV-3)和人肝癌細胞(HepG-2)作為腫瘤細胞模型，活體肝癌腫瘤荷瘤小鼠模型作為活體生物模型探究II型試劑檢測癌細胞缺氧程度的能力。在腫瘤細胞中的具體測定方法為：1)在四個共聚焦培養皿中接種細胞，過夜，使其貼壁；2)II型試劑預孵育細胞30min；3)分別把四皿細胞放入缺氧程度不同的環境中培養8h；4)熒光顯微鏡觀察四皿細胞的熒光強度強弱。在活體荷瘤小鼠中的具體測定方法為：1)II型試劑可溶于含DMSO0％-5％的PBS溶液或生理鹽水溶液，配制成工作液，尾靜脈注射小鼠體內；2)II型試劑經血液循環，可特異性聚集靶向到腫瘤部位；3)因腫瘤缺氧程度不同，腫瘤部位的熒光強度也不同，利用活體熒光成像技術檢測腫瘤位置的熒光強度；4)根據熒光強度的強弱和腫瘤缺氧程度的正相關關系，不同腫瘤的熒光強度的強弱間接表示其缺氧程度的大小。實施例10FBN-3試劑在肝癌荷瘤小鼠模型中對腫瘤的靶向成像和其對不同大小腫瘤缺氧程度的檢測首先建立人肺癌小鼠模型，大量培養人肺癌HepG-2細胞，收集對數生長期的細胞，去除培養液，用PBS洗滌兩次，將細胞密度調整到1×107/ml，在裸鼠的右側腋下注射0.2ml約2×106細胞，然后繼續飼養，每天觀察裸鼠的生長情況，并觀察是否有實體瘤生成。確認小鼠荷瘤后，當腫瘤直徑分別達到6mm和14mm后，尾靜脈注射FBN-3探針。分別在注射探針后1min，5min，10min，15min，20min，25min對小鼠進行熒光成像，觀察比較小鼠腫瘤熒光強度，結果見圖12。從熒光像數據可以看出，腫瘤組織熒光強度逐漸增強，直徑14mm的腫瘤最終熒光強度大于直徑6mm腫瘤的熒光強度。結果說明，探針FBN-3可以在活體生物層面作為手術導航試劑，且可以表征腫瘤組織的缺氧程度。本發明試劑做為外科手術熒光導航試劑在荷瘤小鼠內實施的技術方案如下：1)II型試劑可溶于含DMSO0％-5％的PBS溶液或生理鹽水溶液，配制成工作液，尾靜脈注射或局部注射至小鼠體內；2)II型試劑經血液循環，可特異性聚集靶向到腫瘤部位；3)II型試劑在非腫瘤組織區域無熒光信號或熒光信號強度較弱，在腫瘤組織部位熒光信號強度很強。4)利用活體熒光成像技術，根據熒光信號，精確成像腫瘤位置，為外科手術提供導航。當前第1頁1 2 3