本發明涉及分子生物學與基因工程技術領域，具體是涉及一種提高細菌轉化效率的方法。

背景技術：

細菌轉化指某一受體細菌通過直接吸收來自另一供體細菌的含有特定基因的脫氧核糖核酸(DNA)片段，從而獲得了供體細菌的相應遺傳性狀，這種現象稱為細菌轉化。自然界的轉化現象，一般發生在同一物種或近緣物種中。細菌轉化方法已被引入其他生物，例如采用原生質體轉化法，可將外源DNA注入到不具攝取DNA能力的生物中，使其獲得某些新的特性。細菌轉化現象最初由英國細菌學家格里菲斯(F.Griffith)于1928年發現，直至1944年美國科學家埃弗里(O.T.Avery)等人才證實了轉化因子是脫氧核糖核酸，從而為遺傳學的發展作出了重大貢獻。

細菌轉化是現代基因工程與分子生物學最重要的操作技術之一。轉化效率的高低決定后續工作的開展，而細菌的狀態是影響轉化效率最關鍵的因素之一。已發現在許多細菌中均能發生轉化現象。轉化成功率與某些因子密切相關，例如受體菌處于感受態階段可產生感受態因子，是接受外來DNA片段的最佳時期，而鈣離子、環腺苷酸(cAMP)等物質亦可大大提高轉化率。然而目前對于提高細菌轉化效率的研究還有待進一步提升。

其中，EPS廣泛存在于微生物細胞外和微生物聚集體內部。將存在于各種微生物聚集體內部的生物大分子(如多糖、蛋白質、核酸、磷脂等)統稱為胞外聚合物。EPS包括所有微生物分泌的大分子物質，以及細胞溶和大分子水解的產物。

根據EPS在細胞外存在的位置，可將其分為結合態EPS(包括莢膜聚合物、松散結合聚合物、鞘、凝聚凝膠和附著有機質)和游離態EPS(可溶態、膠體態、黏液態的大分子)。結合態EPS與細胞本身結合較為緊密，而游離態EPS與細胞微弱結合或存在于環境溶液中。一般地，結合態和游離態EPS可以通過離心的方法分離，殘留在上清液中的為游離態EPS，隨微生物細胞沉淀的為結合態EPS。普遍認為結合態EPS具有雙層結構，內層為緊密結合態EPS有特定的形狀并且緊密固定在微生物細胞表面，外層為松散結合態EPS并沒有明顯區分的疏松分散黏液層。雖然游離態EPS與細胞表面的相互作用非常微弱，但在的聚集過程中游離態EPS起到至關重要的作用，而結合態EPS幾乎不影響這一過程。游離態EPS在微生物細胞聚集、固相表面吸附、礦物溶解和生物礦化、重金屬固定等方面有重要影響。

由于細胞EPS的產生和分泌，進一步保護細胞膜并與外界環境隔離，導致外源質粒進入細胞內進行表達這一過程受到EPS的阻礙，使得轉化效率低下。

技術實現要素：

本發明解決的技術問題是提供一種提高細菌轉化效率的方法。

為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：

一種提高細菌轉化效率的方法，主要包括以下步驟：

1)受體菌的培養：從LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α單菌落，接種于10ml LB液體培養基中，37℃下150rpm下振蕩培養12h，直至對數生長后期；將該菌懸液以1％的比例接種于100ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養4小時至OD600＝0.5左右，得到菌液備用；

2)細胞EPS的去除：將25ml步驟1)制備的菌液加入離心管內，4000g離心10min，去掉上清液，再向離心管內加入25ml步驟1)制備的菌液，4000g離心10min，去掉上清液；之后加入預冷的25ml UP水重懸，再次離心，去掉上清液；向離心管中加入預冷的10ml超純水，重懸菌液，4℃40kHz超聲10min，12000g離心20min，去掉上清液，保留菌體；

3)感受態細胞的制備：

a.將步驟2)所得菌體加預冷的超純水至100ml，得到菌液，冰浴10min，倒入兩個滅菌的50ml離心管中，4℃5000rpm離心10min，收集菌體，去掉上清液；

b.向離心管中加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液或MnCl₂溶液(原體積1/5)，振蕩懸浮菌體，在冰上放置20min；

c.4℃，5000rpm離心10min，去掉上清，向離心管中加入0.1mol/L CaCl₂溶液或MnCl₂溶液25ml(原體積的一半)懸浮菌體沉淀；

d.4℃，5000rpm離心10min，去掉上清液，向離心管中加入2ml含20％甘油的冷的0.1mol/L CaCl₂溶液或MnCl₂溶液懸浮菌體，得到感受態細胞懸液，每份100μl分裝后保存于-80℃冰箱中備用；

4)轉化：

a.從-80℃冰箱中取200μl步驟3)制備的感受態細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上；

b.加入質粒DNA溶液(含量不超過50ng，體積不超過10μl)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后；

c.42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘；

d.向管中加入1ml LB液體培養基(不含抗生素)，混勻后37℃振蕩培養1小時，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因；

e.將上述菌液搖勻后取100μl涂布于含抗生素的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37℃培養16-24小時；

f.根據生長情況對菌落數進行計數。

進一步地，在上述方案中，所述LB培養基的配制方法為：在950mL去離子水中加入：胰蛋白胨(bacto-typtone)10g，酵母提取物(bacto-yeast extract)5g，NaCl 10g，搖動容器直至溶質完全溶解，用NaOH調節pH至7.0，加入去離子水至終總體積為1L，121℃濕熱高溫滅菌20min。

進一步地，在上述方案中，所述20％甘油的冷的0.1mol/L CaCl₂溶液的配制方法為：取質量分數為30％的甘油溶液200ml，滅菌，取0.2M CaCl₂溶液200ml，滅菌，將二者混合均勻即成。

進一步地，在上述方案中，所述20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液的配制方法為：取質量分數為30％的甘油溶液200ml，滅菌，取0.2M MnCl₂溶液200ml，滅菌，將二者混合均勻即成。

本發明的有益效果是：本發明的提高細菌轉化效率的方法，具有轉化效率高、操作步驟簡單、溫度和細菌生長條件要求低、革蘭氏陰性菌和陽性菌通用的特點，對分子生物學與基因工程技術領域具有重要的意義。

附圖說明

圖1本發明細菌轉化過程示意圖；

圖2是不同處理下細胞膜通透性改變情況；

圖3是CaCl₂處理下的感受態細胞使用三種質粒(PUC19，PHSG298，PHSG396)轉化子統計結果；

圖4是MnCl₂處理下的感受態細胞使用三種質粒(PUC19，PHSG298，PHSG396)轉化子統計結果。

具體實施方式

下面結合具體實施方式來對本發明進行更進一步詳細的說明：

一種提高細菌轉化效率的方法，主要包括以下步驟：

1)受體菌的培養：從LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α單菌落，接種于10ml LB液體培養基中，37℃下150rpm下振蕩培養12h，直至對數生長后期；將該菌懸液以1％的比例接種于100ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養4小時至OD600＝0.5左右，得到菌液備用；

2)細胞EPS的去除：將25ml步驟1)制備的菌液加入離心管內，4000g離心10min，去掉上清液，再向離心管內加入25ml步驟1)制備的菌液，4000g離心10min，去掉上清液；之后加入預冷的25ml UP水重懸，再次離心，去掉上清液；向離心管中加入預冷的10ml超純水，重懸菌液，4℃40kHz超聲10min，12000g離心20min，去掉上清液，保留菌體；

3)感受態細胞的制備：

a.將步驟2)所得菌體加預冷的超純水至100ml，得到菌液，冰浴10min，倒入兩個滅菌的50ml離心管中，4℃5000rpm離心10min，收集菌體，去掉上清液；

b.向離心管中加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液或MnCl₂溶液(原體積1/5)，振蕩懸浮菌體，在冰上放置20min；

c.4℃，5000rpm離心10min，去掉上清，向離心管中加入0.1mol/L CaCl₂溶液(原體積的一半)懸浮菌體沉淀；

d.4℃，5000rpm離心10min，去掉上清液，向離心管中加入2ml含20％甘油的冷的0.1mol/L CaCl₂溶液懸浮菌體，得到感受態細胞懸液，每份100μl分裝后保存于-80℃冰箱中備用；

4)轉化：

a.從-80℃冰箱中取200μl步驟3)制備的感受態細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上；

b.加入PUC19質粒DNA溶液(含量不超過50ng，體積不超過10μl)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后；

c.42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘；

d.向管中加入1ml LB液體培養基(不含抗生素)，混勻后37℃振蕩培養1小時，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因；

e.將上述菌液搖勻后取100μl涂布于含抗生素的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37℃培養16-24小時；

f.根據生長情況對菌落數進行計數。

其中，所述LB培養基的配制方法為：在950mL去離子水中加入：胰蛋白胨(bacto-typtone)10g，酵母提取物(bacto-yeast extract)5g，NaCl10g，搖動容器直至溶質完全溶解，用NaOH調節pH至7.0，加入去離子水至終總體積為1L，121℃濕熱高溫滅菌20min。所述20％甘油的冷的0.1mol/LCaCl₂溶液的配制方法為：取質量分數為30％的甘油溶液200ml，滅菌，取0.2MCaCl₂溶液200ml，滅菌，將二者混合均勻即成。所述20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液的配制方法為：取質量分數為30％的甘油溶液200ml，滅菌，取0.2M MnCl₂溶液200ml，滅菌，將二者混合均勻即成。

實施例2

與實施例1不同的是，將所述步驟4)b中的PUC19質粒換成PHSG298質粒。

實施例3

與實施例1不同的是，將所述步驟4)b中的PUC19質粒換成PHSG396質粒。

實施例4

與實施例1不同的是，將所述步驟3)c中的CaCl₂溶液換成MnCl₂溶液；將所述步驟3)d中的含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液換成含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液。

實施例5

與實施例1不同的是，將所述步驟3)c中的CaCl₂溶液換成MnCl₂溶液；將所述步驟3)d中的含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液換成含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液；將所述步驟4)b中的PUC19質粒換成PHSG396質粒。

實施例6

與實施例1不同的是，將所述步驟3)c中的CaCl₂溶液換成MnCl₂溶液；將所述步驟3)d中的含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液換成含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液；將所述步驟4)b中的PUC19質粒換成PHSG396質粒。

最后應說明的是：以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明實施例技術方案的精神和范圍。